1.2 微生物的培养技术及应用 人教版（2019）高中生物选择性必修三(课件共51张PPT)
文档属性
| 名称 | 1.2 微生物的培养技术及应用 人教版（2019）高中生物选择性必修三(课件共51张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 2.1MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2024-07-31 16:36:54 | ||
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文档简介
(共51张PPT)
微生物的选择培养和计数
WEISHENGWUDEXUANZEPEIYANGHEJISHU
几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈
第2节 微生物的培养技术及应用
02
H N
C
NH
教学目标
1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求， 进行酵母菌的纯培养。
2.阐明微生物选择培养的原理。
3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要
的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中 不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很
难实现。该怎么办呢
本节聚焦
1.怎样运用生物与环境相适应的观点来解释选择培养 的原理
2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微 生物
3.测定微生物数量的常用方法有哪些
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热
泉中筛选出水生栖热菌(Thermus aquaticus),
进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的
聚合酶链式反应(PCR)。
讨论
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢
这是因为水生栖热菌能在70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微
生物在此条件下不能生存。
2.以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于 目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生 物的生长。
类型 条件
分离得到的菌种
(1)改变培养条件 70～80℃的高温
水生栖热菌
(2)添加某种化学物质 加入青霉素
酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
(3)营养缺陷 不加碳源
自养型微生物
不加氮源
固氮菌
(一)选择培养基
1. 定义
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或
阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.类型
(一)选择培养基
怎样选择出抗氨苄 (biàn) 青霉素能力的细菌
培养基中加氨苄青霉素
没有氨苄青霉素抗 性的细菌被淘汰
没有氨苄 青霉素抗 性的细菌
具有氨苄 青霉素抗 性的菌落
培养基 应有菌落
O
尿素[CO(NH ) ] 含氮量高，化学性质稳定，是现代
农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤
中的某些细菌分解成NH , 再被转化为NO 、NH +等被植物
吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成
脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH ,NH 可以作为细菌生长
的氮源论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解
尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他
营养成分基本相同。
选择培养基配方的设计
⑨ 思考 ·讨论
1.从物理性质来讲，两者属于固体培 养基，
判断依据是添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2% 该类培养基的主要用途为 分离、鉴定、计数 ;
2. 从用途上来讲，培养基二属于 选择 培养基， 目的是为了获得 能分解尿素的微生物 ;
3. 两种培养基共有的培养基成分有：碳源、氮源、无机盐、水 ; 培养基一的碳源为 牛肉膏， 氮源为蛋白胨 ;
培养基二的碳源为 葡萄糖，氮源为 尿 素 0
培养基二
KH PO
1.4g
NaH PO
2.1g
MgSO ·7H 0
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素CO(NH )
1.0g
琼脂
15.0g
蒸馏水
定容到1000ml
培养基一
牛肉膏
5.0g
蛋白胨
10.0g
NaCl
5.0g
琼脂
20.0g
蒸馏水
定容到1000ml
由以上分析，可以知道如何分离土壤中能分解尿素
的细菌，然而，能否估算出1 g 土壤中的有多少分解 尿素的细菌呢 要如何解决
不能，还需要对土壤进行适当的处理以及科学的测 定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要 想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土壤进行 充分稀释，然后再将菌液涂布在制备好的选择培养基上， 也就是要采用稀释涂布平板法。
(二)微生物的选择培养
1.方法 应采用稀释涂布平板法。
2.方法概述
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯 培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布 到制备好的选择培养基上。
两个基本操作：梯度稀释和涂布平板。
①铲取土样，将样
品装入纸袋中
m m,mL mL 皿
1x10 1x1021x10 1x104 1x105 1x1061x10 7
90 mL无菌水
9 mL无菌水
④将涂布器浸在盛有
酒精的烧杯中。
②将10 g 土样加入盛有90mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇 匀，制成菌液。取1mL上清 液加入盛有9mL无菌水的试 管 中 ，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面。
⑥用涂布器将菌液均匀地 涂布在培养基表面。涂布 时可转动培养皿，使涂布 均匀。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃 尽、涂布器冷却后，再进行涂布
3.操作流程
10 g
(二)微生物的选择培养
4.培养与观察
放入37℃恒温箱中培养1～2d
稀释104倍
稀释105倍
稀释103倍
空白对照
4.培养与观察
待涂布的菌液被培养基吸收后， 将平板倒置，放入30～37℃的恒温 培养箱中培养1～2 d,在涂布有合 适浓度菌液的平板上就可以观察到 分离的单菌落。
▲图1-8 稀释涂布平板操作后分 离得到单菌落
(二)微生物的选择培养
(二)微生物的选择培养
培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基
放在一起培养，为什么
培养未接种的培养基的作用是对照。
未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落 生长，说明了什么
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生 长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
(二)微生物的选择培养
注意事项：
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不 要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目 的 菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖， 所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后 再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中， 以免引燃酒精。
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 在数次划线后培养，可以分 离到由一个细菌细胞繁殖而 来的肉眼可见的细胞群体， 即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一 起的微生物将被分散成单个细菌细胞， 从而能在培养基表面形成单个的菌落。
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作 复杂。
结果
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
常用微生物分离方法比较
以上两张图分别是平板划线法和稀释涂布平板法培养细菌的
结果。如果要对菌落进行计数，则哪种方法可行 为什么 得到 的细菌数量是确切的细菌数量吗
(1)原理
当样品的稀释度足够高时， 培养基表面生长的一个单菌落， 来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数， 就能推测出样品中大约含有多 少活菌。
稀释103倍
空白对照
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
稀释104倍
稀释105倍
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(2)计数原则
① 一般选择菌落数为30～300的平 板计数。
② 在同一稀释度下，应至少对3个 平板进行重复计数，然后求出平均 值。
③ 适当的稀释度、涂布是否均匀 是成功统计菌落数目的关键。
稀释104倍
稀释105倍
(三)微生物的数量测定
稀释103倍
空白对照
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(3)结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的 只是一个菌落。
(4)计算公式
每克样品中的菌落数=(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);
M代表稀释倍数。
例1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的 平均数为234,那么每g样品中的菌落数是(涂布平板时所用 稀释液的体积为0.1mL)( B )
A.2.34×108 B.2.34×109
C.234 D.23.4
思考：
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。 从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲
同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230;乙同学 在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256,该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计 结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1. 甲同学 实验操作不合理
;
原因是 未设置重复实验组 ;
2. 乙同学 结果计算不合理 ;
原因是21与另外两组数值相差太大，应舍去；
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(5)使用范围
可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、 酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品 中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。
2.直接计数法 — —显微镜直接计数 1.原理
利用特定的细菌计数板或 血细胞计数板在显微镜下观察、计数， 然后再计算一定体积的样品中微生物的数量；
*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
2.优点
快速直观
3.缺点
(1)统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
(2)个体小的细菌在显微镜下难以观察。
提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如 何分离它们 每克土壤样品究竟含有多少这 样的细菌
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利 用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以 从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培 养基的配方见右栏。
组分
含量
KH PO
1.4 g
Na HPO
2.1 g
MgSO ·7H O
0.2g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
H O
定容至1000 mL
探究 ·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但 是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素， 利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，
可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、 棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素
KH PO
Na HPO
MgSO ·7H O
琼脂 蒸馏水
1.0g
1.4g 2.1g
0.2g
15.0g 1000ml
进行实验
1.实验目的
①提供无机盐；
②调节pH。
2.实验原理
葡萄糖 10.0g
土壤取样
样品的稀释
微生物的培养与观察
实验设计
实验流程：
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(1)土壤取样
① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该 环境中生长。
② 取样过程：铲去表层土(一般3cm左右)。细菌绝大部分分布 在距地表3～8cm的土壤层。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操 作完成后，一定要洗手。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不 同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
② 测放线菌数：一般用10 、104、105稀释液。
③ 测真菌数：一般用102、10 、104稀释液。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能 保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×10 ~1×107倍稀释的稀释液分别涂布平 板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300的平板进行 计算。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
每个浓度至少设置4个平板，
1、2、3平板是选择培养基(实 验组，三个重复) ,4为牛肉膏
9 mL无菌水 蛋白胨培养基(用以判断选择 10g 土样 培养基是否具有选择作用);
10 整个实验还要设置2个平板：不
⑩ 涂布稀释液的选择培养基和牛
⑩ 肉膏蛋白胨培养基，以验证培 A组 B组 C组 养基中是否含有杂菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了 避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标 记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培 养样品的稀释度等。
3.实验步骤
(3)微生物的培养与观察
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培 养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记 录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌 落特征，如形状、大小和颜色等。
探究 实验
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
A组 B组 C组 D组
每个浓度至少设置4个平板，1 、2 、 3平板是选择培养基(实验组，三个重 复),4为牛肉膏蛋白胨培养基(用以 判断选择培养基是否具有选择作用);
整个实验还要设置2个平板：不涂布稀 释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培 养 基 ，以验证培养基中是否含有杂菌。
结果分析与评价
1.说出下列各组培养基目的。
(1)3组接种得选择培养基：
对土壤中分解尿素的 细菌分离和计数。
(2)1组接种的牛肉膏蛋白 胨培养基：
判断选择培养基是否 具有选择作用。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A组 B组 C组 D组
每个浓度至少设置4个平板，1 、2 、 3平板是选择培养基(实验组，三个重 复),4为牛肉膏蛋白胨培养基(用以 判断选择培养基是否具有选择作用);
整个实验还要设置2个平板：不涂布稀 释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培 养 基 ，以验证培养基中是否含有杂菌。
结果分析与评价
1.说出下列各组培养基目的。
(3)不接种的选择培养基：
验证选择培养基中 是否含有杂菌。
(4)不接种的牛肉膏蛋白胨 培养基：
验证牛肉膏蛋白胨培 养基中是否含有杂菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
培养基未被杂菌污染
未涂布培养基上有菌落生长
培养基被杂菌污染
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌 落数目明显多于选择培养基 上的菌落数木
选择培养基
具有选择作用
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
2.说出以下现象对应的结果分析。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
3.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明 培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基 上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明 选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
4.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平 板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说 明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
5.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落 数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异 很大，可能是什么原因引起的
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接 近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基 配制是否合理等方面查找原因。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行 鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设 计实验来鉴定自己分离的菌种。
1.原理
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强， pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化 学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
进一步探究
2.方法
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红 指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示 剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细 菌能够分解尿素。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
脲酶阳性
脲酶的检测
当样品的稀释度 足够高时，一个 菌落来源于一个 活菌
计算公式=(C÷V) ×M
检测pH的变化
培养基中加入酚红 指示剂进行检测
人为提供利于目的 菌株生长的条件， 抑制或阻止其他菌 生长
利用选择培养基 分离
土壤取样 →样品的稀释 →培养与观察→细菌 的计数
方法
原理
方法
土壤 中分 解尿 素的 细菌
分离 操作
方法
原理
原理
筛选
计数
鉴定
二 、微生物的选择培养和计数
到社会中去
1.空气中微生物总数的检测 2.水中细菌总数的检测
3.牛奶中细菌的分离与计数
4.土壤中真菌(或放线菌)的分离与计数
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染 的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。 (
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。 ( )
(3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离
到石油降解菌。 ( )
练习与应用
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板
上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( D )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
二 、拓展应用
1.反刍 (chú) 动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤 胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设 计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的 微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡， 因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，
还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请
你给出详细的实验方案。
提示：可以参考本节“探究 ·实践”中的设
计思路进行设计。
几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解
菌 为什么
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素
的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰
富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
几种纤维素分解菌在刚果红
培养基上形成的透明圈
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过
一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素
分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存
的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 几种纤维素分解菌在刚果红
培养基上形成的透明圈
谢谢
让课堂绽放魅力让教育更加美好
微生物的选择培养和计数
WEISHENGWUDEXUANZEPEIYANGHEJISHU
几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈
第2节 微生物的培养技术及应用
02
H N
C
NH
教学目标
1.概述培养基的配制方法和微生物纯培养的基本操作要求， 进行酵母菌的纯培养。
2.阐明微生物选择培养的原理。
3.进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。
自然界中微生物数量繁多，种类庞杂，要想从中分离出需要
的特定微生物并不容易，尤其当要分离的微生物在混合的菌群中 不是优势种群时，仅通过一般的平板划线法或稀释涂布平板法很
难实现。该怎么办呢
本节聚焦
1.怎样运用生物与环境相适应的观点来解释选择培养 的原理
2.如何通过调整培养基的配方来有目的地培养某种微 生物
3.测定微生物数量的常用方法有哪些
1973年，科学家从美国黄石国家公园的热
泉中筛选出水生栖热菌(Thermus aquaticus),
进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。
这种酶目前已被广泛用于体外扩增DNA片段的
聚合酶链式反应(PCR)。
讨论
1.为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢
这是因为水生栖热菌能在70~80 ℃的高温条件下生存，而绝大多数微
生物在此条件下不能生存。
2.以上例子给我们在分离纯化微生物带来什么启示
实验室中微生物的筛选，也可以应用同样的原理，即人为提供有利于 目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等),同时抑制或阻止其他微生 物的生长。
类型 条件
分离得到的菌种
(1)改变培养条件 70～80℃的高温
水生栖热菌
(2)添加某种化学物质 加入青霉素
酵母菌、霉菌等真菌
高浓度食盐
金黄色葡萄球菌
(3)营养缺陷 不加碳源
自养型微生物
不加氮源
固氮菌
(一)选择培养基
1. 定义
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或
阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2.类型
(一)选择培养基
怎样选择出抗氨苄 (biàn) 青霉素能力的细菌
培养基中加氨苄青霉素
没有氨苄青霉素抗 性的细菌被淘汰
没有氨苄 青霉素抗 性的细菌
具有氨苄 青霉素抗 性的菌落
培养基 应有菌落
O
尿素[CO(NH ) ] 含氮量高，化学性质稳定，是现代
农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后，会被土壤
中的某些细菌分解成NH , 再被转化为NO 、NH +等被植物
吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成
脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH ,NH 可以作为细菌生长
的氮源论：
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解
尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点
设计一种选择培养基，用尿素作为唯一氮源，可以将分解尿素的细菌分离出来。
这种培养基与普通培养基相比，只是用尿素作为唯一氮源，培养基的其他
营养成分基本相同。
选择培养基配方的设计
⑨ 思考 ·讨论
1.从物理性质来讲，两者属于固体培 养基，
判断依据是添加了凝固剂琼脂，且比例为1.5%~2% 该类培养基的主要用途为 分离、鉴定、计数 ;
2. 从用途上来讲，培养基二属于 选择 培养基， 目的是为了获得 能分解尿素的微生物 ;
3. 两种培养基共有的培养基成分有：碳源、氮源、无机盐、水 ; 培养基一的碳源为 牛肉膏， 氮源为蛋白胨 ;
培养基二的碳源为 葡萄糖，氮源为 尿 素 0
培养基二
KH PO
1.4g
NaH PO
2.1g
MgSO ·7H 0
0.2g
葡萄糖
10.0g
尿素CO(NH )
1.0g
琼脂
15.0g
蒸馏水
定容到1000ml
培养基一
牛肉膏
5.0g
蛋白胨
10.0g
NaCl
5.0g
琼脂
20.0g
蒸馏水
定容到1000ml
由以上分析，可以知道如何分离土壤中能分解尿素
的细菌，然而，能否估算出1 g 土壤中的有多少分解 尿素的细菌呢 要如何解决
不能，还需要对土壤进行适当的处理以及科学的测 定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要 想得到能分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土壤进行 充分稀释，然后再将菌液涂布在制备好的选择培养基上， 也就是要采用稀释涂布平板法。
(二)微生物的选择培养
1.方法 应采用稀释涂布平板法。
2.方法概述
由于土壤细菌的数量庞大，要想得到特定微生物的纯 培养物，必须要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布 到制备好的选择培养基上。
两个基本操作：梯度稀释和涂布平板。
①铲取土样，将样
品装入纸袋中
m m,mL mL 皿
1x10 1x1021x10 1x104 1x105 1x1061x10 7
90 mL无菌水
9 mL无菌水
④将涂布器浸在盛有
酒精的烧杯中。
②将10 g 土样加入盛有90mL 无菌水的锥形瓶中，充分摇 匀，制成菌液。取1mL上清 液加入盛有9mL无菌水的试 管 中 ，依次等比稀释。
③取0.1mL菌液，
滴加到培养基表面。
⑥用涂布器将菌液均匀地 涂布在培养基表面。涂布 时可转动培养皿，使涂布 均匀。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃 尽、涂布器冷却后，再进行涂布
3.操作流程
10 g
(二)微生物的选择培养
4.培养与观察
放入37℃恒温箱中培养1～2d
稀释104倍
稀释105倍
稀释103倍
空白对照
4.培养与观察
待涂布的菌液被培养基吸收后， 将平板倒置，放入30～37℃的恒温 培养箱中培养1～2 d,在涂布有合 适浓度菌液的平板上就可以观察到 分离的单菌落。
▲图1-8 稀释涂布平板操作后分 离得到单菌落
(二)微生物的选择培养
(二)微生物的选择培养
培养时要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基
放在一起培养，为什么
培养未接种的培养基的作用是对照。
未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键，如果无菌落 生长，说明了什么
未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生 长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
(二)微生物的选择培养
注意事项：
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，在计算时，不 要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目 的 菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖， 所以还需要进一步验证；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后 再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中， 以免引燃酒精。
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
原理 在数次划线后培养，可以分 离到由一个细菌细胞繁殖而 来的肉眼可见的细胞群体， 即菌落。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一 起的微生物将被分散成单个细菌细胞， 从而能在培养基表面形成单个的菌落。
特点 方法简单，但不适宜计数 单菌落更易分开，可以计数，但操作 复杂。
结果
共同点 使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落
常用微生物分离方法比较
以上两张图分别是平板划线法和稀释涂布平板法培养细菌的
结果。如果要对菌落进行计数，则哪种方法可行 为什么 得到 的细菌数量是确切的细菌数量吗
(1)原理
当样品的稀释度足够高时， 培养基表面生长的一个单菌落， 来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数， 就能推测出样品中大约含有多 少活菌。
稀释103倍
空白对照
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
稀释104倍
稀释105倍
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(2)计数原则
① 一般选择菌落数为30～300的平 板计数。
② 在同一稀释度下，应至少对3个 平板进行重复计数，然后求出平均 值。
③ 适当的稀释度、涂布是否均匀 是成功统计菌落数目的关键。
稀释104倍
稀释105倍
(三)微生物的数量测定
稀释103倍
空白对照
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(3)结果分析
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目少；
②统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
原因：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的 只是一个菌落。
(4)计算公式
每克样品中的菌落数=(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);
M代表稀释倍数。
例1.某同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的 平均数为234,那么每g样品中的菌落数是(涂布平板时所用 稀释液的体积为0.1mL)( B )
A.2.34×108 B.2.34×109
C.234 D.23.4
思考：
某两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。 从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果：甲
同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230;乙同学 在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、 212、256,该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计 结果。
请评价这两位同学的实验结果的有效性：
1. 甲同学 实验操作不合理
;
原因是 未设置重复实验组 ;
2. 乙同学 结果计算不合理 ;
原因是21与另外两组数值相差太大，应舍去；
(三)微生物的数量测定
1.间接计数法——稀释涂布平板法
(5)使用范围
可以用来测定土壤、水、食品等样品中的细菌、 酵母菌、芽孢和孢子等的数量，但不适于测定样品 中的放线菌、丝状真菌等丝状体微生物的数量。
2.直接计数法 — —显微镜直接计数 1.原理
利用特定的细菌计数板或 血细胞计数板在显微镜下观察、计数， 然后再计算一定体积的样品中微生物的数量；
*血细胞计数板常用对相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等；
细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数。
2.优点
快速直观
3.缺点
(1)统计结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
(2)个体小的细菌在显微镜下难以观察。
提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如 何分离它们 每克土壤样品究竟含有多少这 样的细菌
基础知识
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。利 用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以 从土壤中分离出分解尿素的细菌，该选择培 养基的配方见右栏。
组分
含量
KH PO
1.4 g
Na HPO
2.1 g
MgSO ·7H O
0.2g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
H O
定容至1000 mL
探究 ·实践
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但 是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素， 利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，
可以从土壤中分离出分离尿素的细菌。
常见的分解尿素的微生物：芽孢杆菌、小球菌、 棒状杆菌等细菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。
(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
尿素
KH PO
Na HPO
MgSO ·7H O
琼脂 蒸馏水
1.0g
1.4g 2.1g
0.2g
15.0g 1000ml
进行实验
1.实验目的
①提供无机盐；
②调节pH。
2.实验原理
葡萄糖 10.0g
土壤取样
样品的稀释
微生物的培养与观察
实验设计
实验流程：
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(1)土壤取样
① 取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该 环境中生长。
② 取样过程：铲去表层土(一般3cm左右)。细菌绝大部分分布 在距地表3～8cm的土壤层。
注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操 作完成后，一定要洗手。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不 同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
① 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
② 测放线菌数：一般用10 、104、105稀释液。
③ 测真菌数：一般用102、10 、104稀释液。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能 保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数
选用稀释范围更大的稀释液进行平板培养；
例如可以将1×10 ~1×107倍稀释的稀释液分别涂布平 板上培养，以保证能从中选择出菌落数为30～300的平板进行 计算。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
每个浓度至少设置4个平板，
1、2、3平板是选择培养基(实 验组，三个重复) ,4为牛肉膏
9 mL无菌水 蛋白胨培养基(用以判断选择 10g 土样 培养基是否具有选择作用);
10 整个实验还要设置2个平板：不
⑩ 涂布稀释液的选择培养基和牛
⑩ 肉膏蛋白胨培养基，以验证培 A组 B组 C组 养基中是否含有杂菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
3.实验步骤
(2)样品的稀释与涂布平板
注意事项：本实验使用的平板和试管较多，为了 避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标 记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培 养样品的稀释度等。
3.实验步骤
(3)微生物的培养与观察
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培 养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记 录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌 落特征，如形状、大小和颜色等。
探究 实验
土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进行实验
A组 B组 C组 D组
每个浓度至少设置4个平板，1 、2 、 3平板是选择培养基(实验组，三个重 复),4为牛肉膏蛋白胨培养基(用以 判断选择培养基是否具有选择作用);
整个实验还要设置2个平板：不涂布稀 释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培 养 基 ，以验证培养基中是否含有杂菌。
结果分析与评价
1.说出下列各组培养基目的。
(1)3组接种得选择培养基：
对土壤中分解尿素的 细菌分离和计数。
(2)1组接种的牛肉膏蛋白 胨培养基：
判断选择培养基是否 具有选择作用。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
A组 B组 C组 D组
每个浓度至少设置4个平板，1 、2 、 3平板是选择培养基(实验组，三个重 复),4为牛肉膏蛋白胨培养基(用以 判断选择培养基是否具有选择作用);
整个实验还要设置2个平板：不涂布稀 释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培 养 基 ，以验证培养基中是否含有杂菌。
结果分析与评价
1.说出下列各组培养基目的。
(3)不接种的选择培养基：
验证选择培养基中 是否含有杂菌。
(4)不接种的牛肉膏蛋白胨 培养基：
验证牛肉膏蛋白胨培 养基中是否含有杂菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
现象
分析
未涂布培养基上无菌落生长
培养基未被杂菌污染
未涂布培养基上有菌落生长
培养基被杂菌污染
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌 落数目明显多于选择培养基 上的菌落数木
选择培养基
具有选择作用
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
2.说出以下现象对应的结果分析。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
3.结合对照组，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出一些菌落。
如果没有接种的培养基上没有菌落生长，说明 培养基没有被杂菌污染。如果接种后的完全培养基 上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，说明 选择培养基筛选出了一些尿素分解菌。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
4.你是否获得了某一稀释度下菌落数为30~300的平 板 在这一稀释度下，是否至少有2个平板的菌落数接近
如果得到了两个或多个菌落数为30～300的平板，说 明稀释度合适，操作比较成功，能够进行菌落的计数。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
结果分析与评价
5.你统计的每克土样中能分解尿素的细菌的菌落 数是多少 与其他同学统计的结果接近吗 如果差异 很大，可能是什么原因引起的
如果是用同一土样进行的操作，数据应该比较接 近。如果差异很大，就需要从操作是否规范、培养基 配制是否合理等方面查找原因。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
进一步探究
本活动只是初步筛选了能分解尿素的细菌，对分离的菌种进行 鉴定还需要借助生物化学的方法。你可以查阅相关资料，进一步设 计实验来鉴定自己分离的菌种。
1.原理
细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强， pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化 学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。
进一步探究
2.方法
在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红 指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示 剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细 菌能够分解尿素。
探究 ·实践 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
脲酶阳性
脲酶的检测
当样品的稀释度 足够高时，一个 菌落来源于一个 活菌
计算公式=(C÷V) ×M
检测pH的变化
培养基中加入酚红 指示剂进行检测
人为提供利于目的 菌株生长的条件， 抑制或阻止其他菌 生长
利用选择培养基 分离
土壤取样 →样品的稀释 →培养与观察→细菌 的计数
方法
原理
方法
土壤 中分 解尿 素的 细菌
分离 操作
方法
原理
原理
筛选
计数
鉴定
二 、微生物的选择培养和计数
到社会中去
1.空气中微生物总数的检测 2.水中细菌总数的检测
3.牛奶中细菌的分离与计数
4.土壤中真菌(或放线菌)的分离与计数
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染 的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
(1)这种培养基是一种选择培养基。 (
(2)利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。 ( )
(3)相对于未被污染的土壤，从被石油污染的土壤中更容易分离
到石油降解菌。 ( )
练习与应用
一、概念检测
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板
上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( D )
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
二 、拓展应用
1.反刍 (chú) 动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤 胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设 计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的 微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡， 因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，
还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(1)现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请
你给出详细的实验方案。
提示：可以参考本节“探究 ·实践”中的设
计思路进行设计。
几种纤维素分解菌在刚果红 培养基上形成的透明圈
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(2)你打算到什么环境中去寻找纤维素分解
菌 为什么
提示：纤维素分解菌大多分布在富含纤维素
的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰
富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
几种纤维素分解菌在刚果红
培养基上形成的透明圈
二、拓展应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%～60%能被土壤中 某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研 究与应用，使人们能够利用精杆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。
已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物， 但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素 的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被 纤维素分解菌分解后，复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心 的透明圈(如下图所示)。请回答下列问题。
(3)有同学说，可以把滤纸埋在土壤中，经过
一段时间后，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素
分解菌。请你评价这一做法。
提示：这是人工设置适合纤维素分解菌生存
的环境，腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。 几种纤维素分解菌在刚果红
培养基上形成的透明圈
谢谢
让课堂绽放魅力让教育更加美好