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课题名称 1.2 微生物的培养技术及应用（4课时） 课堂类型： 新课 □复习课 □习题课 □实验课 □试卷讲评课 □其他：
学习者 分析 1.2.1 微生物的基本培养技术 学生在上节课中通过对传统发酵技术的学习能够理解获得单一菌种进行发酵是获得品质稳定的发酵产物的重要条件，以此为契机促进学生思考微生物的培养技术和筛选技术。本节内容除了要引导学生理解相关理论知识，更重要的是需要借助视频、实际操作等教学环节帮助学生正确操作，掌握真实条件下科研人员是如何做的？以此还能激发学生的学习兴趣或就业选择兴趣。 1.2.2 微生物的选择培养和计数 通过前一部分的学习，学生已基本掌握培养基的配制、无菌操作技术、微生物的分离与纯培养的等知识，有较高的参与实验的热情，但由于刚刚接触微生物培养技术，缺乏实践经验，实验操作能力还有所欠缺，此外，在本节内容的学习中，学生需要在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”这一探究活动中完成设计实验方案、统筹规划实验流程、熟练应用技术、团队合作完成实验、评价实验结果等多个环节，对于高中生来说具有一定的难度，加之本班学生女生较多，实验操作能力较为局限，教师在分组环节需要下点功夫。
教学目标 1. 微生物的基本培养技术（2课时） （1）概述培养基的营养构成、配制方法和无菌技术的原理、常用设备和方法； （2）尝试配制培养基进行酵母菌的纯培养，说明微生物纯培养的基本操作要求，初步掌握无菌操作、倒平板和平板划线的基本技能。 2. 微生物的选择培养和计数（2课时） （1）阐明微生物选择培养的原理。 （2）能利用平板划线法和稀释涂布平板法分离和纯化微生物。 （3）能利用稀释涂布平板法、显微镜计数法测定微生物数量。 （4）能举例说明通过调整培养基的配方，有目的地培养目标微生物，并尝试设计方案分离和计数能分解尿素的微生物。
教学重点 微生物纯培养的基本操作要求，微生物选择培养的原理； 酵母菌的纯培养； 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 落实教学重点的方法： 问题驱动、问题串拆分 板书加深印象 播放实验操作视频+实践操作
教学难点 酵母菌的纯培养； 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数。 突破教学难点的方法： 板书知识点、教师播放实验操作视频、学生分组探究实践
教学资源 选择 教师用书、教材、题单、天天练 技术手段的使用： 电子白板、板书、多媒体
课时： 4
核心问题 怎样进行酵母菌的纯培养？ 如何进行土壤中分解尿素的细菌的分离和计数？
教学过程设计【1.2.1 微生物的基本培养技术：第一课时】
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
为什么传统发酵和工业发酵的产物参差这么大？ 教师展示茅台酒和自己家里酿造的果酒图片，提问：茅台酒作为世界名酒，它的卖点就是酱香突出，没有辛辣刺激感，而且口感清纯。但是我们家里自己酿造的酒常常会有各种口味，这其中最大的原因就在于像茅台酒等这些工业生产的发酵产品是在严格的无菌条件下，而且接种的是单一菌种，其中涉及的问题我们可以拆分为三个问题：如何防止发酵过程中的杂菌污染？如何保证发酵过程中菌种的纯化？如何控制发酵过程的进程？这也就对应我们第二节的内容，即微生物培养过程中如何实现无菌技术？微生物培养过程中如何实现选择培养？微生物培养过程中如何对微生物进行数量测定？ 让学生初步认识防止杂菌污染，获得纯净微生物培养物的重要性。 同时以第一节传统发酵技术为问题导入实现大单元教学的教学情境统一，让学生带着问题在具体情境中学习并解决问题。
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微生物的类群有哪些呢？ 在学习微生物的培养技术之前，我们先来回顾总结一下微生物的类群有哪些？学生集体回答，教师点评。（旁栏：相关信息） 微生物的共同特点是个体微小，结构简单，我们通常需要借助光学显微镜或者电子显微镜才能看到，一般来说，实验室培养微生物的条件可以从两个方面来总结： 1、和动植物一样，微生物也需要吃东西，也就是提供微生物生长繁殖所需营养和环境条件，我们将其称之为培养基。 2、对于微生物来说，如果我们想要培养某一种微生物，那就要在它的生活环境即培养基中降低竞争者的数量，确保其它微生物无法混入，所以在培养微生物的时候常常需要保证无菌技术。以这两个基本条件为主线我们先来学习一下关于微生物的基本培养技术。 也就是对应你们教材上第9页的第一段：一方面要为人们需要的微生物提供合适的营养和环境条件；另一方面要确保其他微生物无法混入，并将需要的微生物分离出来。 回顾必修部分知识点，巩固提升学生的专业知识。
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什么是培养基？如何配制？ （一）概念 培养基指的是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长繁殖的营养基质，用来培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。培养基的种类按照其分类标准不同又有很多。 （二）种类 1、按物理状态分：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。顾名思义，这两种培养基的不同点在于物理状态的不同，根据其物理状态的不同也有不一样的用途。其中固体培养基用于菌种保存及分离、鉴定菌落、活菌计数等，微生物在琼脂固体培养基表面或者内部生长，可以形成肉眼可见的菌落。半固体培养基：用于观察微生物的运动、鉴定；液体培养基常用于工业生产和连续培养。液体培养基中加入凝固剂（如，琼脂），就可变为固体培养基。 （琼脂是一种多糖，在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。） 2、按功能分：选择培养基和鉴别培养基 选择培养基：指从众多微生物中分离出特定的微生物；在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长。 鉴别培养基：在培养基中加入某种指示剂或化学药品，用以鉴别不同种类的微生物。 3、按化学成分分：天然培养基和合成培养基 天然培养基：化学成分不明确，用于工业生产； 合成培养基：化学成分明确，用于微生物的分类和鉴定。 （三）营养成分 我们结合教材表1-1牛肉膏蛋白胨培养基的营养成分来看一下培养基中一般含有些什么？一般都含有水、碳源、氮源和无机盐等营养物质。 Q1：从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？ ——C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。 除此以外，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的需求。这里的特殊营养物质常指生长因子(即微生物生长繁殖所必需的，而自身不能合成或合成能力有限的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶，这些物质在天然物质牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有） 例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需将培养基的pH调至酸性；培养细菌时需将pH调至中性和微碱性；培养厌氧微生物时则需要提供无氧的条件。 这里还要拓展一下关于碳源和氮源的内容，碳源指的是凡是能够提高碳元素的物质，包括有机碳和无机碳；氮源指的是凡是能够提供氮元素的物质都是氮源，包括有机氮和无机氮。 营养成分含义作用主要来源碳源凡能提供所需碳元素的物质构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质(1)无机化合物：CO2、NaHCO3等；【自养】 (2)有机化合物：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等氮源凡能提供所需氮元素的物质合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物(1)无机化合物：NH3、铵盐、硝酸盐等；【自养、固氮细菌】 (2)有机化合物：尿素、牛肉膏、蛋白胨等生长因子(特殊营养物质)生长必不可少的微量有机物酶和核酸的组成成分维生素、氨基酸、碱基等水在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定培养基、大气、代谢产物等无机盐为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂培养基、大气等环境
能够按照不同的分类标准将培养基进行分类。 让学生在感性认识的基础上理性分析归纳培养基的营养构成，培养归纳概括的能力，进一步通过实践操作，加深对基础知识的理解。 认同生命与物质观，体会不同微生物的生长对物质的需求不同。 即时检测即时评价。
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什么是无菌技术？ 我们刚刚讲到微生物培养中除了给它吃的，还需要减少竞争者，也就是防止杂菌的污染，即无菌技术。获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染。主要内容包括：消毒和灭菌。 应该从哪些方面避免杂菌污染呢？ （1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 我们来具体看一下消毒和灭菌。 2、消毒与灭菌的含义 （1）消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。 生物消毒法是指利用生物或其代谢物除去环境中的部分微生物的方法。比如：有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。 （2）灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。 【拓展】 芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，且能发育成生物体，常为一个。芽孢壁很厚，抗恶劣环境能力强。 孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞，数量多，能直接发育成新个体。抗恶劣能力差。 请大家阅读教材11页，找出常用的消毒方法有哪些？ 常见的灭菌方法有哪些？ 【习题练习】 1．(2019·湖南株洲二中高二期末)下列关于灭菌和消毒的理解，不正确的是( D ) A．灭菌是指杀灭物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子 B．实验者的双手用酒精消毒 C．接种环用灼烧法灭菌 D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和紫外线照射等 2．(2019·山西太原高二期中)微生物培养过程中通常采用高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法可依次用于杀灭哪些部位的杂菌( C ) A．接种针、手、培养基 B．接种针、手、培养皿 C．培养基、手、接种针 D．培养基、手、培养皿 通过比较分析让学生明白两种无菌技术的差异，以便他们在实践中准确地应用技术。 学生自主阅读教材获取信息。 即时评价。
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课堂小结 总结本节内容，加深学生印象。
教学过程设计【1.2.1 微生物的基本培养技术：第二课时】
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怎样进行酵母菌的纯培养？ 我们在上节课中已经知道获得纯净微生物培养物的关键在于培养基的配制和无菌技术，我们这堂课以酵母菌为例进行探讨怎样进行酵母菌的纯培养？ 首先来了解几个概念：什么是培养物？什么又是纯培养物？纯培养又是一个什么样的过程？ 培养物：在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。 纯培养物：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。因为微生物体积小种类多，所以我们要把微生物群分散为单个细胞，这些由单个细胞繁殖而来的群体就叫单个菌落，这个过程就是获得纯培养物的过程。 因此，菌落的概念指的是：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。 纯培养：获得纯培养物的过程就是纯培养。 微生物的纯培养过程包括：配制培养基——灭菌——倒平板——接种和分离——培养等步骤。酵母菌也不例外。 教师逐一讲解以上过程，并结合相关视频加深学生的印象。 一、实验步骤 1、配制培养基 称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。 2、灭菌 培养基：转到锥形瓶，加棉塞，用牛皮纸或旧报纸包裹 （高压蒸汽灭菌法） 培养皿：用牛皮纸或旧报纸包裹 （干热灭菌法） 3、倒平板 待培养基冷却至50℃左右；在酒精灯火焰附近倒平板； 等平板冷却凝固后，倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。【教师播放视频】 展示相关问题，引导学生思考并回答。 4、接种和分离 接种：指在无菌条件下将微生物或含菌材料转移到合适其生长繁殖的培养基中的过程。 （1）接种工具： 接种针——用于穿刺接种； 接种环——用于斜面接种或平板划线接种； 玻璃涂布器——用于涂布平板接种； （2）接种的方法：涂布平板法、穿刺接种法、斜面接种法、平板划线法 我们这节课主要学习平板划线法的操作 平板划线法指的是：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。 比较直观一点的说法可以是，由于微生物的体积很小，因此我们接种的酵母菌肯定是一大堆，也就是微生物群，但是既然要纯培养，那么我们就需要获得单个酵母菌，用平板划线法就可以通过连续划线的方式来达到稀释分散微生物群的目的，进而获得单个酵母菌细胞，由单个酵母菌细胞生长繁殖得到的就是单个菌落。 请大家阅读教材13页，分析平板划线法的具体操作步骤：教师结合空白培养皿和接种环演示具体操作步骤，为后面学生实验奠定基础。 教师播放平板划线法的规范操作视频。 小组为单位，思考并回答下列问题。 5、培养酵母菌 完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。 Q1：刚刚通过平板划线法得到的平板是否只需要一个就可以进行培养最后获得纯酵母菌？——至少需要划3个平板，相当于是重复实验，避免实验的偶然性，减小实验误差。 Q2：未接种的平板的设置目的是什么？ 未接种的平板相当于空白对照；通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被污染或灭菌是否彻底。 二、结果分析与评价 教师结合图片逐一讲解相关过程。 提问学生评价其对灭菌方法的掌握情况。 通过播放视频加深学生的理解。 了解接种的方法和接种工具。 引导学生学习平板划线法的具体操作过程。 结合操作视频进一步规范操作过程的掌握。 结合相关问题引导学生理解平板划线法具体操作背后的原理和原因。 通过对实验结果预计出现问题的分析，培养学生思考并解决问题的能力。
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思维训练 评估论点的可信程度： 有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。 “酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？ 如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？ ——所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。 培养学生的批判性思维。
课堂小结 结合该流程图的形式总结本节内容重点，加深学生印象。
教学过程设计【1.2.2 微生物的选择培养和计数：第一课时】
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新课导入 【从社会中来】 教师展示美国黄石国家公园相关图片，介绍分析水生栖热菌的筛选：1973年，科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌，进而从这种菌种提取出耐高温的DNA聚合酶。为什么水生栖热菌能从热泉中被筛选出来呢？ ——因为水生栖热菌能在70～80 ℃的条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。 由此得到的启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。 比如，如果我们要筛选耐寒的微生物，就可以到冰川冻土层中去寻找，如果要筛选石油分解菌，那就要到富含石油的地方去寻找，比如被石油污染的土壤。 通过自然显现的展示，激发学生学习的兴趣。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
什么是选择培养基？如何筛选目的菌？ 教师进一步抛出问题，根据这一原理，我们可以思考一下实验室中如果要筛选某种特定的微生物，应该怎么做？——人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。比如：如果要筛选固氮微生物，我们可以在培养基中不加氮源；如果要筛选自养微生物，我们可以在培养基中不加入有机碳源。据此，我们得出选择培养基。 选择培养基：在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。 再比如，我们在必修二模块开展的“探究抗生素对细菌的选择作用”活动中，在添加抗生素的培养基中只有耐药菌可以存活。 通过这幅图片我们会发现左边培养基上的微生物数量远远多于右边加了抗生素的，这说明左边的培养基应该是完全培养基，也就是各种营养成分都有的，这两个培养基进行对比也就说明右边的培养基是具备选择作用的，因此，你能否总结一下：我如何证明一个选择培养基具有选择性呢？ 应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。 【基本培养基；仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基。完全培养基；凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或者半天然培养基，成为完全培养基。】 【选择性拓展延伸：一般来说，当选择培养基筛选出来某种目的菌以后，这种目的菌其实还需要通过鉴别才能确定是不是目的菌，就会用到鉴别培养基，我们在后面的题目中会涉及到，比如导学案14页的纤维素分解菌的筛选和鉴别】 那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？ 尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。 尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。 1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？ ——在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。 2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？ ——除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。 结合上节课的内容，你能否说出各成分的作用是什么？练习： 根据微生物生活特点，概括选择培养基的概念。指导学生分析和解决问题。 结合必修二中抗药性细菌的筛选进一步引导学生理解如何筛选目的菌。初步形成选择培养的思维和方法，同时深化生物进化与环境相适应的生命观念。 即时训练即时评价。
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稀释涂布平板法如何操作？ 如果我们想知道1g土壤中有多少能分解尿素的细菌，应该怎么做呢？这就涉及到两个问题：分离和计数。因此仅仅有选择培养基是不够的，还需要对土样进行适当的处理以及科学的测定微生物数量的方法。由于土壤中细菌的数量庞大，要想得到分解尿素的细菌的纯培养物，必须对土样进行充分稀释，然后再将稀释的菌液涂布到制备好的选择培养基上，也就是要采用稀释涂布平板法才行。 稀释涂布平板法指的是：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 展示稀释涂布平板划线法和平板划线法的结果图片，由此可见平板划线法不适用于计数，因此选择稀释涂布平板法进行接种，这样也便于计数。 整个稀释涂布平板法的过程可以概括为：A、梯度稀释菌液 B、涂布平板 稀释的原因：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。 具体操作步骤 1、土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌 2、样品的稀释（梯度稀释菌液）：将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。 3、涂布平板： 培养与观察：待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30～37 ℃的恒温培养箱中培养1～2 d。 最后在涂布有合适浓度菌液的平板上就可以观察到分离的单菌落，一般来说，随着你的稀释度越高，平板上的单菌落就更稀疏，比如左边这幅图中所示。 【注意】 1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，计算时，不要忽略； 2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证/鉴定； 3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行； 4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。 问题驱动引导学生思考稀释涂布平板法和平板划线法的区别，稀释涂布平板法更适用于计数。 多媒体动画呈现出样品的稀释过程。 结合科学实验的设计原则引导学生分析培养基数量的设置。 呈现预期结果，对实验原理理解更加到位。
教学过程设计【1.2.2 微生物的选择培养和计数：第二课时】
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微生物计数的方法有哪些 ？ 一、稀释涂布平板法——间接计数法 在上节课的学习中我们知道稀释涂布平板法可以用于计数，我们把通过稀释涂布平板法进行计数的方法称为间接计数法。 1、原理可以计数的原理是我们可以把一个菌落看成是一个细菌，因为当样品的稀释度足够高的时候，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。我们可以通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少个活菌。 2、计数原则是： （1）为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目。 （2）在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。 3、结果分析：一般来说，稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数量少。——因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的知识一个菌落。 所以统计结果也一般不用活菌数来表示，而是用菌落数来表示。 【选择性拓展】4、计算公式 【学以致用】案例:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。 1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。 2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。 你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？ ——甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。 乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。 显微镜直接计数法——直接计数法 血细胞计数板的具体操作方法我们在选择性必修一学习酵母菌种群数量变化的实验中也讲过，血细胞计数板总的有400个小格子，分为25*16和16*25；两种规格。 列表比较直接计数法和间接计数法: 项目直接计数法间接计数法原理利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌主要用具显微镜、细菌计数板培养基计数数据菌体本身培养基上菌落数优点计数方便、操作简单计数的是活菌缺点死菌、活菌都计算在内操作较复杂，有一定误差计算公式每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
现在我们可以更全面地对比分析平板划线法和稀释涂布平板法的。常用微生物分离方法比较： 多媒体呈现填空题，学生阅读教材回答稀释涂布平板法计数的原理、原则和结果或存在的问题。培养学生阅读教材获取信息的能力。 即时训练即时评价。 介绍显微镜直接计数法，简单回顾血细胞计数板的规格类型和操作方法。 列表比较、总结，加深学生对微生物数量测定方法的印象。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
如何测定1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？ 我们已经知道稀释涂布平板法可以完成分离和计数两个目的，如果我们实践进行1g土壤中尿素分解菌数量的测定，从一个实验的设计上来看，目的、原理、实验器材以及实验流程应该怎么进行呢？ 实验目的（提出问题） （1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 （2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌 （二）实验原理 绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。 培养基中各成分的作用我们上节课已经讲过。【抽同学回答】 （三）实验流程 结合我们对稀释涂布平板法的学习，我们其实可以初步总结一下该实验的实验流程如下：土壤取样——制备培养基——样品稀释涂布——微生物的培养与观察——菌落计数。 1、土壤取样： ①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。 ②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。 ③注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。 2、制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。【其实这里还需要配置一个基础培养基或者完全培养基，比如牛肉膏蛋白胨培养基，用于作为对照组判断选择培养基是否起到了选择作用，最后预期的结果应该是选择培养基上的微生物数量少，牛肉膏蛋白胨培养基上微生物数量多】【而且两种培养基都需要各自设置一个空白对照，即不接种细菌，看是否被杂菌污染】 【严格来说每个稀释度下需要三个选择培养基和1个牛肉膏蛋白胨培养基】 注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。 3、样品的稀释与涂布平板 我们已经知道稀释涂布平板法的原理是稀释度足够高，而且我们最后需要得到菌落数在30-300之间的平板才可以计数。而不同微生物在土壤中含量不同，所以分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。一般来说， 测细菌数：一般用104、105、106稀释液。 【② 测放线菌数：一般用103、104、105稀释液。③ 测真菌数：一般用102、103、104稀释液。】 但是问题来了，在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？刚刚提到的104、105、106也只是个大概范围为嘛。那应该怎么做呢？——选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。 ①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基（用以判断选择培养基是否具有选择作用）。 ②如何验证培养基中是否含有杂菌？ 设置2个平板作为对照：不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。 注意：实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、组别、培养时期、稀释度、培养物等。 4、微生物的培养与观察 ① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。 ② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。【当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数【3个平板数目不能相差太大，否则重做】，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。】 ③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。 （四）结果分析与评价 回顾旧知，加深学生的印象。 结合实验流程逐一讲解，注意实验细节的落实。 展示预期结果，学生分析评价，培养学生实验分析评价能力。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
如何对分离的尿素分解菌作进一步的鉴定？ 思考：如何对分离的尿素分解菌作进一步的鉴定？ 细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解细菌。 操作方法：在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。 液体培养基：可以直接看液体的变色情况。 固体培养基：可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。 通过讲解鉴定原理，学生总结操作方法，体验鉴别培养基的应用。
总结(共45张PPT)
1.2 微生物的培养技术及应用
1.2.1 微生物的基本培养技术
无细胞结构
原核细胞
真核细胞
微生物：
真菌：酵母菌、毛霉等；
原生生物：草履虫、变形虫等
微生物的类群
病毒：SARS病毒、新冠病毒等RNA病毒；噬菌体等DNA病毒
细菌：蓝细菌、大肠杆菌、乳酸菌、根瘤菌、硝化细菌；
放线菌、支原体、衣原体等
难以用肉眼观察的微小生物的统称。
本章提及的微生物主要指用于发酵的细菌和真菌。
相关信息（P9）
SARS冠状病毒
新冠病毒
酵母菌
毛霉
大肠杆菌
乳酸杆菌
思考：在实验室中培养纯净的微生物，需要满足哪些条件？
一、提供生长繁殖所需
营养和环境条件
二、防止杂菌污染
配制培养基
进行无菌操作
一、微生物的基本培养技术
（一）培养基的配制
1、概念：培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。用于培养、分离、鉴定、保存微生物或积累代谢物。（作用）
2、类型：
（1）按物理性质划分：
固体培养基：
液体培养基：
半固体培养基：
菌种保存、分离、鉴定、计数
观察微生物的运动
工业生产和连续扩大培养
凝固剂
（琼脂）
多
无
2、类型：
（2）按功能划分：
选择培养基：添加（或缺少）某种化学成分
鉴别培养基：添加某种指示剂或化学药剂
菌种的分离
菌种的鉴别
不加氮源的无氮培养基——分离固氮菌
伊红美蓝培养基——鉴别大肠杆菌
紫黑色，并带有金属光泽
一、微生物的基本培养技术
（一）培养基的配制
2、类型：
（3）按化学成分分：
天然培养基：
合成培养基：
化学成分不明确，用于工业生产
化学成分明确，用于微生物的分类和鉴定
牛肉膏蛋白胨/肉汤培养基
（培养细菌）
麦芽汁培养基
（培养酵母菌）
查氏培养基
（培养霉菌）
一、微生物的基本培养技术
（一）培养基的配制
3、营养成分：
培养基组分 提供的主要营养
牛肉膏 5g 碳源、磷酸盐和维生素
蛋白胨 10g 氮源和维生素
NaCl 5g 无机盐
H2O 定容至1000mL 氢元素、氧元素
1000mL牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
（1）一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。
（2）另外还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质（如生长因子）等的要求。
乳酸杆菌——添加维生素；
霉菌——调pH至酸性；
细菌——调pH至中性或微碱性；
厌氧微生物——提供无氧条件
一、微生物的基本培养技术
（一）培养基的配制
碳源
1）不同微生物所利用的碳源不同
①异养型：
②自养型：
含碳有机物（有机碳）
含碳无机物（无机碳）
糖类（主要）、蛋白质、脂肪酸
碳酸盐，碳酸氢盐，二氧化碳等
3、营养成分（补充）
①无机氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。
②有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等。
氮源
1）来源：
微生物 碳源 氮源 能源
蓝细菌
硝化细菌
根瘤菌
大肠杆菌
CO2
NH4＋、NO3-等
光能
CO2
NH3
NH3的氧化
糖类等有机物
N2
有机物
糖类、蛋白质等有机物
蛋白质等
有机物
1.自养型微生物与异养型微生物培养基的主要差别在于 ；
自养型微生物所需的碳源来自 碳源，
异养型微生物所需的碳源来自 碳源
2.无机氮源不但能给自养型微生物提供 ，也能作为 ，
3.含有C、H、O、N的有机物可作为 微生物的碳源、氮源、能源；
碳源
氮源
能源物质
异养型
无机
有机
学以致用
√
编号 成分 含量
① 粉状硫 10g
② （NH4）2SO4 0.4g
③ K2HPO4 4.0g
④ MgSO4 9.25g
⑤ FeSO4 0.5g
⑥ CaCl2 0.5g
⑦ H2O 100ml
2、右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。
自养型微生物
（2）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。
（3）表中营养成分共有 类。
（4）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。
（5）用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
固氮微生物
3
调节pH
琼脂（或凝固剂）
水
无机盐
无机氮源
1、获得纯净微生物培养物的关键是：
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在超净工作台上并在酒精灯火焰附近旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。
应该从哪些方面避免杂菌污染呢？
一、微生物的基本培养技术
（二）无菌技术
防止杂菌污染
（二）无菌技术
2、消毒与灭菌的含义
（1）消毒：是指使用较为温和的物理、化学或生物方法杀死物体表面或内部的部分微生物（不包括芽孢和孢子）。
（2）灭菌：是指使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
芽孢：有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，且能发育成生物体，常为一个。芽孢壁很厚，抗恶劣环境能力强。
孢子：细菌、原生动物、真菌和植物等产生的一种有繁殖作用的无性生殖细胞，数量多，能直接发育成新个体。抗恶劣能力差。
有的微生物能够寄生于多种细菌体内，使细菌裂解，因此可以用它们来净化污水、污泥。
一、微生物的基本培养技术
（二）无菌技术
3、常用的消毒方法【阅读教材，完成下表】
消毒方法 主要操作 应用范围
100 ℃煮沸5～6 min
家庭餐具等生活用品的消毒
62～65 ℃消毒30 min或80~90 ℃处理30s~1 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体
紫外线照射30 min
接种室、接种箱、超净工作台
用体积分数为70%～75%的酒精、氯气消毒水源，喷洒石炭酸或煤酚皂等消毒液
皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒
煮沸消毒法
巴氏消毒法
紫外线消毒
化学药物消毒
思考：为什么选择巴氏消毒法而不用煮沸消毒法给牛奶消毒？
（可以杀死牛奶中的绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分）
一、微生物的基本培养技术
一、微生物的基本培养技术
（二）无菌技术
灭菌方法 主要操作 应用范围
4、常用的灭菌方法
酒精灯火焰灼烧
干热灭菌箱160～170 ℃加热2～3 h
100 kPa、121 ℃维持15～30 min
微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
培养基及多种器材、物品
灼烧灭菌
干热灭菌
湿热灭菌
（高压蒸汽灭菌法）
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外,还有什么目的？
2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿
（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管
（3） 实验操作者的双手
能有效避免操作者自身被微生物感染。
旁栏思考
消毒
灭菌
1．(2019·湖南株洲二中高二期末)下列关于灭菌和消毒的理解，不正确的是( )
A．灭菌是指杀灭物体内外一切微生物，包括芽孢和孢子
B．实验者的双手用酒精消毒
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌和紫外线照射等
√
√
2．(2019·山西太原高二期中)微生物培养过程中通常采用高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法可依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A．接种针、手、培养基 B．接种针、手、培养皿
C．培养基、手、接种针 D．培养基、手、培养皿
培养基的类型
培养基的营养物质
消毒
灭菌
微生物的实验室培养
【课堂小结】
培养基
无菌技术
按物理性质划分
按组成成分划分
按功能划分
基本成分：碳源、氮源、水、无机盐
特殊需求：维生素（如乳酸杆菌）、碱基等
煮沸消毒
巴氏消毒
紫外线消毒
化学药剂消毒
湿热灭菌
干热灭菌
灼烧灭菌
1.概念：由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物，获得纯培养物的过程就是纯培养。
2.方法步骤
01
02
03
04
配制培养基
灭菌
倒平板
接种和分离
培养
05
微生物群
分散或稀释
单个细胞
单个菌落
繁殖
二、微生物的纯培养
菌落：由一个细胞繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。
（1）配制培养基
配制培养基：称取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000ml，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20g葡萄糖、15-20g琼脂，用蒸馏水定容至1000ml。
二、微生物的纯培养
二、微生物的纯培养
培养基：转到锥形瓶，加棉塞，用牛皮纸或旧报纸包裹
（高压蒸汽灭菌法）
培养皿：用牛皮纸或旧报纸包裹
（干热灭菌法）
（2）灭菌
待培养基冷却至50℃左右；在酒精灯火焰附近倒平板； 等平板冷却凝固后，倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
（3）倒平板
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？
问题讨论
可用手触摸锥形瓶，感觉温度下降到刚刚不烫手时即可倒平板
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，又可以避免培养基中的水分过快地挥发。
5.如何检验制备的培养基灭菌是否合格？
如果未接种的培养基在恒温箱中保温1—2天，无菌落生长，说明培养基的制备成功；否则需要重新制备。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。
接种：指在无菌条件下将微生物或含菌材料转移到合适其生长繁殖的培养基中的过程。
接种工具：
接种针——用于穿刺接种；
接种环——用于斜面接种或平板划线接种；
玻璃涂布器——用于涂布平板接种；
（4）接种和分离
二、微生物的纯培养
接种的方法：涂布平板法、穿刺接种法、斜面接种法、平板划线法
二、微生物的纯培养
（4）接种和分离
二、微生物的纯培养
平板划线法
通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。经过数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
单个细胞
微生物群
单个菌落
连续划线
稀释分散
生长繁殖
二、微生物的纯培养
①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环的金属丝烧红。
②在火焰旁冷却接种环，并拔出装有酵母菌培养液的试管的棉塞
③将试管口通过火焰
④将已冷却的接种环伸入菌液中，蘸取一环菌液
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞
⑥在火焰附近将皿盖打开一条缝隙，用接种环在培养基表面迅速划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基
⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线。注意不要将最后一次的划线与第一次划线相连。
平板划线法的操作步骤：
第1区划线
接种环灭菌
第2区划线
接种环灭菌
第3区划线
接种环灭菌
接种环灭菌
1
2
3
4
5
①接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划线多次
②划线首尾不能相接
③每次划线前接种环进行灭菌
④划线操作结束后，仍需灼烧接种环，培养皿倒置培养。
（3）平板划线法注意事项
分区划线法（最常用）
平板划线法
1.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。
问题讨论2
2.不要划破培养基的原因？
为了不影响对菌落形态的观察和特征鉴别；一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的。
3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
操作的第一步灼烧接种环：
避免接种环上原有的微生物污染培养物
每次划线前灼烧接种环：
为了杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，直到得到单个细胞。
4.在做第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
5.在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
6.为什么最后一次划线与第一次的划线不能相连？
最后一次划线已经将细胞稀释成单个细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
培养：完成平板划线后，待菌液被培养基吸收，将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入 28℃ 左右（培养温度因酵母菌种类的不同而稍有差异）的恒温培养箱中培养 24 ~ 48h。
微生物的纯培养
（5）培养
3个划线平板
1个不划线平板
（重复实验）
（空白对照）
恒温培养箱培养
巩固练习
设置未接种平板组的意义是什么？
通过观察未接种平板是否有菌落存在以确定培养基是否被 或
是否彻底。
污染
灭菌
下列接种过程正确的顺序是？
b a e f c g d
（2）在接种酵母菌的培养基上，你是否观察到了单菌落？这些菌落的颜色、形状和大小是否一致？如果你观察到了不同形态的菌落，你能分析出可能是由哪些原因引起的吗？
在接种酵母菌的培养基上可观察到单菌落。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特点， 则说明纯化酵母菌的操作成功；如果观察到了不同形态的菌落，可能是接种的菌种不纯或者无菌操作不规范等原因引起的。
（3）你是如何记录实验结果的？
可以在培养12h和24h后，观察菌落的大小、形状、颜色。培养24h后，菌落的大小、形状是否发生变化，菌落颜色是否加深，光泽度是否增加，等等。
4.结果分析与评价
（1）在未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有，说明了什么？
应该没有；如果有，说明培养基被杂菌污染或灭菌不彻底。
评估论点的可信程度
有一段时间，水果“酵素”风靡各地。水果“酵素”制作的大致过程是：将洗净、切成块状的水果放入洁净的容器，再加入糖和水,密封，置于阴凉处发酵一至两周。有人说，吃水果“酵素”可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力。请评估这一论点是否可信。追问以下问题可以帮助你分析。
“酵素”是什么？水果“酵素”的制作原理是什么？水果“酵素”中可能含有哪些成分？它是否含有人们无法从其他食品中获取但又是维护健康所必需的成分？水果“酵素”中的所有成分都有益于人体健康吗？
如果要更加有力地支持或反驳水果“酵素”有益健康的论点，应该怎样获取证据？
所谓“酵素”，就是“酶”的另一种说法。“酵素”制作就是利用微生物进行无氧呼吸的原理，进行像制作泡菜一样的发酵。 这样制作的“酵素”中可能有糖类(包括-些简单的糖和膳食纤维等)、蛋白质(包括多种酶)、有机酸等成分，不存在它独有的、特殊的营养物质，其中甚至可能含有微生物发酵产生的有毒物质，食用后可能会危害人体健康。因此，“吃水果酵素可以美容、减肥、促进消化和提高免疫力”的论点值得怀疑。
酵母菌的纯培养
2.接种和分离酵母菌
1.制备培养基
3.培养酵母菌
①配制培养基（马铃薯、葡萄糖、琼脂、水）
②灭菌
③倒平板（在酒精灯火焰附近操作）
培养基：湿热灭菌（高压蒸汽灭菌锅）
培养皿：干热灭菌（干热灭菌锅）
用接种环在固体培养基上用平板划线法接种
平板倒置，放入28℃左右的恒温培养箱培养
【课堂小结】
1.下列关于微生物实验操作的叙述，正确的是( )
A.配制细菌培养基过程中，需要在倒平板时调节培养基的pH
B.配制固体培养基时加入琼脂，其作用是为微生物生长提供碳源
C.平板划线法接种时，每次划线之前都需对接种环进行灭菌
D.实验结束后，使用完的培养基可以直接丢弃
2.如图是微生物平板划线示意图。划线的顺序为1、2、3、4、5，4.下列操作方法叙述正确的是( )
A.在1、2、3、4、5区域中划线前都要对接种环灼烧灭菌，
灼烧灭菌后立即进行划线
B.1和5划线可以如图所示，也可以相连在一起
C.在划线操作结束时，要对接种环灼烧灭菌
D.在5区域中才可以得到单菌落
C
C
1.微生物的纯培养既需要适宜的培养基，又要防止杂菌污染。判断下列相关表述是否正确。
（1）培养基中的营养物质浓度越高，对微生物的生长越有利。（ ）
（2）消毒和灭菌的杀菌程度存在差异。 （ ）
（3）微生物的纯培养物就是不含有代谢废物的微生物培养物。（ ）
×
√
×
练习与应用
一、概念检测
2.日常生活中保存食品的方法有哪些？这些方法是如何阻止或抑制微生物生长的？
干制：降低食品的水分含量；
腌制：通过食盐、糖等制造高渗环境，从而抑制微生物的生长和繁殖；
低温：通过降低微生物的代谢速率来抑制微生物的生长和繁殖。
练习与应用
一、概念检测
1.某同学将5个手指尖在贴有“洗手前”标签的培养基上轻轻按一下。然后用肥皂将该手洗干净，再将5个指尖在贴有“洗手后”标签的同种培养基上轻轻按一下。将这两个培养皿放入37℃恒温培养箱中培养24h后，发现贴有“洗手后”标签的培养皿中菌落较少。请分析回答下列问题。
（1）这个实验中需要进行灭菌处理的材料用具有
（2）“将指尖在培养基上轻轻按一下”相当于微生物培养中的哪一步操作？
（3）从实验结果来看,洗手后我们就能进行无菌操作了吗？操作时，我们可以采用什么方法来避免手上微生物的污染？
（1）：培养皿和培养基。
（2）：接种。
（3）通过实验结果可以看到，洗手后手上还有一些微生物，不能直接进行无菌操作。可以通过用酒精棉球擦拭双手，或戴消过毒的手套等方法来避免手上微生物的污染。
二、拓展应用
练习与应用
2.某生物兴趣小组将从葡萄皮上成功分离来的野生酵母菌分别接种于3个盛有等量同种液体培养基的锥形瓶中，并放置在摇床上培养，摇床转速分别为 210 r/min， 230 r/min和250 r/min。培养时间与酵母菌种群密度的关系如下图所示。请分析回答下列问题。
（1）摇床转速不同,意味着培养条件有什么不同？
意味着培养液中02含量不同。
（2）从图中数据你可以得出什么结论 其原因是什么
培养液中02含量越高,酵母菌种群密度越大。
（3）为什么培养8h后，其中2个锥形瓶中酵母菌的种群密度基本达到稳定
这时候已经达到了环境容纳量。
二、拓展应用
练习与应用
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第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
1.2.2 微生物的选择培养和计数
启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。PCR技术是一种常用的DNA扩增技术，此项技术的自动化，需要使用耐高温的DNA聚合酶，如果请你来找这种耐高温的酶，你会去哪里找？热泉70-80摄氏度的高温条件淘汰了绝大多数微生物，而耐热的水生栖热菌脱颖而出。美国黄石国家公园的一个热泉一、选择培养基
耐寒微生物
石油分解菌
被石油污染的土壤
冰川冻土层
实验室中，人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度和pH等) ，同时抑制或阻止其他微生物的生长，从而筛选特定的微生物。
培养基可分离固氮微生物；
培养基中 可培养自养型微生物。
无氮源
不加入有机碳源
一、选择培养基
在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
1. 定义
一、选择培养基
培养基中加氨苄青霉素
具有抗氨苄青霉素能力的菌落
长出各种各样的细菌
培养基+氨苄青霉素
没有抗氨苄青霉素能力的菌落被淘汰
怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌
培养基
怎么证明一个选择培养基具有选择性呢？
应该设置基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）或完全培养基作为对照，若基础培养基或完全培养基中生长的菌落数菌多于该选择培养基，则该选择培养基具有选择性。
基础培养基
选择培养基
那么如果让你分离土壤中分解尿素的细菌，你应该怎么设计呢？
尿素的立体结构
尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一种重要的氮肥。
尿素施入土壤后，会被土壤中的某些细菌分解成NH3，再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。
而这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。
CO(NH2)2
脲酶
+ H2O
+ CO2
2NH3
在选择培养基中，以尿素作为唯一氮源，只有能合成脲酶的细菌才能生长发育繁殖。
1.如果让你配制一种培养基，将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来，培养基的配方该如何设计？
2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点？
除以尿素作为唯一氮源外，该培养基的其他营养成分与普通培养基基本相同。
选择培养基配方的设计
讨论
配方：
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000ml
碳源
氮源
①提供无机盐；
②作为缓冲物质调节pH。
凝固剂
选择培养基配方的设计
1.从物理性质来讲，两者属于_____培养基，
判断依据是_________________________________；
该类培养基的主要用途为_____________________；
2.从用途上来讲，培养基二属于______培养基，
目的是为了获得_____________________；
3.两种培养基共有的培养基成分有：________________________；
培养基一的碳源主要为________，主要氮源为________；
培养基二的碳源主要为________，主要氮源为________。
培养基一 牛肉膏 5.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20.0g
蒸馏水 定容到1000ml
培养基二 KH2PO4 1.4g
NaH2PO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素CO(NH2)2 1.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 定容到1000ml
固体
添加了凝固剂琼脂
分离、鉴定、计数
选择
能分解尿素的微生物
碳源、氮源、无机盐、水
牛肉膏
蛋白胨
葡萄糖
尿素
学以致用
（一）方法:
（二）基本操作:
A、梯度稀释菌液 B、涂布平板
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
稀释的原因：稀释度足够高时，能在培养基表面形成单个菌落。
要对土壤进行充分稀释，然后再将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
(2)由于土壤细菌的数量庞大，那么怎么获得要想得到特定微生物的纯培养物呢？
二、微生物的选择培养
(1)1g土壤中有多少能分解尿素的细菌？
计数：测定分解尿素的细菌的数量
分离：获得分解尿素的细菌的纯培养物
稀释涂布平板法
稀释涂布平板法
平板划线法
二、微生物的选择培养
（三）操作步骤:
1.土壤取样：
从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
注：取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌
2.样品的稀释（梯度稀释菌液）
1×10
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1 mL
1×102
1×103
1×104
1×105
1×106
1×107
9 mL 无菌水
90mL无菌水
10g
②将10 g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀，制成菌液。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
二、微生物的选择培养
微量
移液器
3.涂布平板
③取0.1mL菌液，滴加到培养基表面。
④将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。
⑤将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器冷却后，再进行涂布。
⑥用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入恒温箱培养。
注意：各梯度分别涂布3个平板（重复实验）1个不涂布作空白对照。
二、微生物的选择培养
4.培养与观察
稀释103倍
稀释104倍
稀释105倍
空白对照
恒温培养箱
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板倒置，放入30-37℃的恒温培养箱中，培养1-2d。
二、微生物的选择培养
1.10g土样加入盛有90mL无菌水中后，已稀释10倍，计算时，不要忽略；
2.由于使用的是选择培养基，所以一般情况下，获得的单菌落即目的菌，但因为有些微生物可以利用目的菌的代谢产物来生长繁殖，所以还需要进一步验证/鉴定；
3.过程中所有操作都应在酒精灯火焰旁进行；
4.将涂布器从酒精中取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧；不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引燃酒精。
特别提醒
——间接计数法
1.稀释涂布平板法
（1）原理：
当样品的稀释度足够___时，培养基表面生长的一个____，来源于__________中的一个____；通过计数平板上的____数，就能推测出样品中大约含有多少_____。
高
单菌落
样品稀释液
活菌
菌落
活菌
（2）计数原则
①选择菌落数为_______的平板计数
30-300
②同一稀释度下，应至少对___个平板进行重复计数，然后求出______；
3
平均值
样品的______将直接影响平板上的菌落数目；
稀释度
三、微生物的数量测定
（3）结果分析：
①统计的菌落数往往比活菌的实际数目____；
原因：__________________________________________
______________
②统计结果一般用_______而不是用活菌数来表示；
少
当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
菌落数
（4）计算公式：
每g样品中的菌落数＝(C÷V)×M
C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数
V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)
M代表稀释倍数
例：某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每g样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1mL) ( )
A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4
B
案例【导学案P15】:两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。
2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、
212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。
你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？
甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
乙：其中一个平板计数结果与其他两个相差太大，操作过程可能出现了错误。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果差别很大的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地将结果舍弃后进行计数。
2.显微镜直接计数
——直接计数法
（1）方法：
利用特定的___________或_____________在______下观察、计数，然后再计算_________的样品中微生物的数量；
细菌计数板
血细胞计数板
显微镜
一定体积
血细胞计数板常用于_______________________________等的计数
相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子
细菌计数板可对_________________进行观察和计数；
细菌等较小的细胞
（2）优点：
快速直观
（3）缺点：
①统计的结果一般是活菌数和死菌数的总和，不能区分死菌与活菌。
②个体小的细菌在显微镜下难以观察。③不适于对运动细菌的计数
计数区
放大后的计数室
(4)计数方法：
每毫升原液所含细菌数＝
每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数
注意：统计结果一般是活菌数和死菌数的总和。（“染色排除法”）
2.直接计数法——显微镜直接计数
三、微生物的数量测定
内容 直接计数法 间接计数法
主要用具
计数依据
优点
缺点
显微镜、细菌计数板
或血细胞计数板
涂布器、培养基
细菌个数
培养基上菌落数
计数方便、操作简单
计数的是活菌
不能区分死菌与活菌
操作较复杂且有一定误差
三、微生物的数量测定
常用微生物分离方法比较【导学案P14】
比较 平板划线法 稀释涂布平板法
工具
原理
特点
结果
共同点 接种环
涂布器
在数次划线后培养，可以分离到由一个细菌细胞繁殖而来的肉眼可见的细胞群体，即菌落。
在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
方法简单，但不适宜计数
单菌落更易分开，可以计数，但操作复杂。
①都能分离纯化菌种；②都是在固体培养基上进行的。③观察菌落特征
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
（一）提出问题（实验目的）
（1）从土壤中分离出能够分解尿素的细菌。
（2）统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌。
（二）实验原理
绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用___________________的_____培养基，可以从土壤中分离出_________的细菌。
组分 含量
KH2PO4 1.4g
Na2HPO4 2.1g
MgSO4·7H2O 0.2g
葡萄糖 10.0g
尿素 1.0g
琼脂 15.0g
H2O 定容至1000mL
脲酶
以尿素作为唯一氮源
选择
分解尿素
CO(NH2)2+H2O
脲酶
2NH3+CO2
（三）实验流程：
样品稀释涂布平板
微生物的培养与观察
菌落计数
土壤取样
制备培养基
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1、土壤取样①取样地点要求：酸碱度接近中性的潮湿土壤。细菌适宜在该环境中生长。②取样过程：铲去表层土（一般3cm左右）。细菌绝大部分分布在距地表3～8cm的土壤层。③注意事项：取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后，一定要洗手。2、制备培养基①选择培养基：以尿素为唯一氮源。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g琼脂15.0g蒸馏水1000ml②牛肉膏蛋白胨培养基：作为对照组，来判断选择培养基是否具有选择作用。
测细菌数：一般用104、105、106稀释液。
3、样品的稀释与涂布平板
不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30～300之间适于计数的平板。
在初次实验中，对于稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数？
思考
选择一个比较宽的范围，将1×103～1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养，以保证能从中选择出菌落数在30～300的平板进行计数。
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
①每个浓度至少设置4个平板，1、2、3平板是选择培养基（实验组，三个重复），4为牛肉膏蛋白胨培养基
（用以判断选择培养基是否具有选择作用）
②如何验证培养基中是否含有杂菌？
设置2个平板作为对照：
不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基
注意：实验时要对培养皿作好标记注明培养基类型、组别、培养时期、稀释度、培养物等
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
① 培养条件：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d。
② 观察：每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
③ 一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，如形状、大小和颜色等。
4、微生物的培养与观察
4、培养与观察
内容结论分析结论有无杂菌污染的判断（1）对照的培养皿中无菌落生长；（2）培养物中菌落数偏高；（3）菌落形态多样，菌落数偏高（1）未被杂菌污染；（2）被杂菌污染；（3）培养物中混入其他氮源选择培养基的筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目大于选择培养基的数目选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落样品的稀释操作得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板操作成功，能进行菌落的计数重复组的结果若选取同一种土样，统计结果应接近；如果结果相差太远，说明实验操作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因（四）结果分析与评价
CO(NH2)2
脲酶
+ CO2
2NH3
+ H2O
酚红指示剂将变红
pH↑
思考：如何对分离的尿素分解菌作进一步的鉴定？
以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
5.进一步探究
方法
在以尿素为唯一氮源的培养 基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红。这样，我们就可以初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
液体培养基：
可以直接看液体的变色情况。
固体培养基：
可以观察菌落周围是否出现红色环带，红色环带直径与菌落直径比值越大，说明分解能力越强。
四、探究实践：土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
课堂小结
1. 研究人员用无机盐、琼脂和石油配制的培养基从被石油污染的土壤中筛选出了一种石油降解菌。判断下列相关表述是否正确。
（1）这种培养基是一种选择培养基。（ ）
（2）利用这种石油降解菌可以降解石油。修复土壤。（ ）
（3）相对于未被污染的土壤,从被石油污染的土壤中更容易分离到石油降解菌。（ ）
√
√
√
练习与应用
一、概念检测
Q：筛选纤维素分解菌可以到什么环境中取样？
2.用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数,原因是（ ）
A. 菌落中的细菌数目是固定的
B. 平板上的一个菌落就是一个细菌
C. 通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D. 平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D
练习与应用
一、概念检测
1.反刍（chú）动物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物能分解尿素。请你设计一个实验从瘤胃中分离出能够分解尿素的微生物。
反刍动物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基，还应该参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。
二、拓展应用
练习与应用
2.地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中 40% ~ 60% 能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。对这些微生物的研究与应用，使人们能够利用秸秆等生产酒精，用纤维索酶处理服装面料等。已知刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不与水解后的纤维二糖、葡萄糖等发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物；而当纤维索被纤维素分解菌分解后，
复合物就无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈(如
下图所示)。请回答下列问题。
（1）现在要从土壤中分离纤维素分解菌，请你给出详细的实验方案。
提示：可以参考本节“探究·实践”中的设
计思路进行设计。
二、拓展应用
练习与应用
（2）你打算到什么环境中去寻找纤维素分解菌？为什么？
纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中，采集土样时，可以选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土等。
（3）有同学说,可以把滤纸埋在土壤中,经过一段时间后,再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌。请你评价这一做法。
这是人工设置适合纤维素分解菌生存
的环境,腐烂的滤纸上很可能有纤维素分解菌。
二、拓展应用
练习与应用
Thanks!
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