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课题名称 3.2 基因工程的基本操作程序（4课时） 课堂类型： 新课 □复习课 □习题课 实验课 □试卷讲评课 □其他：
学习者 分析 本节课的授课对象为高二年级的学生，学生经过“科学探索之路——基因工程的诞生和发展”和上一节“重组DNA技术的基本工具”的学习，而且经过之前对必修二的掌握，学生的生物基础知识较为扎实，思维的目的性、连续性和逻辑性已初步建立，所以已经具备学习“基因工程的基本操作程序”一节的基础。但本节内容较杂，知识抽象，并且学生缺乏科学技术的实践经验，所以对学生来说本节内容不易理解。因此在教学过程中，应在教师的引导下适时加强学生解决问题和运用概念图等生物学语言归纳结论等方面的能力。
教学目标 与本节内容对应的课程标准的“内容要求”是：阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。结合教材内容，确定本节的教学目标如下： 阐明PCR的原理，说出PCR反应所需要的条件和PCR反应的过程； 说出基因表达载体的组成； 列举将目的基因导入植物细胞、动物细胞和微生物细胞的方法； 列举检测与鉴定目的基因在受体细胞中是否稳定维持和表达其遗传特性的方法； 能够用流程图的形式概括出基因工程的基本操作程序； 针对人类生产或生活中的某一需求，能运用基因工程技术尝试设计获得某一转基因产品的方案； 能够基于对基因工程的原理和操作流程的认识，以理性的态度对待基因工程的研发和应用，认同我国科研工作者在基因工程领域取得的成就； 尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
教学重点 基因工程基本操作程序的四个步骤； DNA片段的扩增及电泳鉴定 落实教学重点的方法： 播放视频、板画流程、学生小组活动
教学难点 1、利用PCR获取和扩增目的基因； 2、DNA片段的扩增及电泳鉴定。 突破教学难点的方法： 播放视频、板画流程、学生小组活动
教学资源 选择 教师用书、教材、题单、天天练 技术手段的使用： 电子白板、板书、多媒体
课时： 3-4课时
核心问题 基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？ 基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
教学过程设计
3.2.1 基因工程的基本操作程序
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
播放视频，导入新课 在上节课中我们通过学习简单地了解了基因工程的三大基本工具，包括分子手术刀——限制性内切核酸酶（限制酶），可以通过识别特定的核苷酸序列并且切断特定部位的磷酸二酯键来进行目的基因的剪切，一般来说要想把目的基因剪下来需要用限制酶切割两次；目的基因获取以后还需要与运载体进行连接才能够进入到受体细胞，与运载体连接的工具是DNA连接酶，将两个DNA片段连接起来，包括两种类型：E.coliDNA连接酶只能连接互补的黏性末端；T4DNA连接酶既可以连接互补的黏性末端，也可以连接平末端；通过DNA连接酶将目的基因构建到运载体，也就是分子运输车上进行转运，其中运载体的种类有质粒、动植物病毒以及噬菌体，其中质粒是最常见的运载体，它是一种环状的DNA分子，存在于真核细胞和原核细胞中，作为基因工程的载体必须满足四个要求：不能对受体细胞有害；至少有一个或多个酶切位点，便于目的基因的插入；能够在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上随着受体的DNA同步复制；含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。 我国是棉花生产大国，转基因抗虫棉的诞生为我国带来极大的便利。教师播 放视频，激发学生学习兴趣。提问：培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤 今天我们进入基因工程的第二节内容：基因工程的基本操作程序。 按照我们对基因工程概念的理解，其大致过程应该可以概括为： 教师引导学生梳理上节课的知识点，加深印象。 播放视频，激发学生学习兴趣，认同科技发展已成为不同国家比拼的有效工具。 结合概念构建基因工程的大致流程。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
如何进行目的基因的筛选和获取？ 因此基因工程大致包括四个步骤，分别是目的基因的筛选与获取、目的基因表达载体的构建（这是核心步骤）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。我们按照操作顺序逐一进行分析： （一）目的基因 概念：目的基因指的是在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要目的基因肯定也是不同的。但主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。 比如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。 苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。这里的杀虫基因就是目的基因。 （二）筛选目的基因 那么，如何筛选目的基因呢？一般来说都是从已知结构和功能清晰的基因中进行 筛选。由于科学家对苏云金杆菌制成的生物杀虫剂已经有多年历史，且掌握了Bt基因的序列信息，对Bt基因的表达产物也了解得很透彻，且Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响。因此它是培育转基因抗虫棉较为适合的目的基因。 随着技术的发展，比如测序技术、序列数据库以及序列对比工具等，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这就为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会。 目的基因的获取 当我们筛选到了目的基因Bt基因，有什么方法可以获得它呢？ 人工合成：人工合成法只适用于基因比较小、核苷酸序列已知的目的基因，可以通过通过DNA合成仪用化学方法直接合成； 人工化学合成法 ：根据已知的氨基酸序列合成DNA （2）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。 利用PCR获取和扩增目的基因。 PCR获取和扩增目的基因 概念：PCR——指的是聚合酶链式反应 原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。 PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。 DNA复制所需的基本条件 我们简单回顾一下必修二DNA半保留复制的一些条件： 那么PCR技术是如何实现在体外进行大规模扩增DNA的呢？我们先通过视频简单了解一下，根据该视频可得出： Q：需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。 PCR的反应过程： 【复性时引物与DNA模板的结合是随机的，也存在解开的两条DNA单链的结合，但两条模板链重新结合的概率较低，原因是：①模板链一般比较长，比引物复杂得多，重新结合的概率较低。②加入引物的量足够多，而模板链数量少，引物与模板之间的碰撞结合机会，远远高于模板互补链之间的碰撞机会。】 4、列表比较PCR技术与DNA分子的复制过程： Q：PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？ 5、如何对产物进行鉴定？ 琼脂糖凝胶电泳——DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。 用PCR可以扩增mRNA吗？——不能！由于RNA不稳定，需要将RNA逆转录为cDNA，然后再进行扩增。 【练习】 1、下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（ B ） A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端 B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋 C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量 D.二者遵循的碱基互补配对原则相同 2.(2022·天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（ D ） A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端 B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段 C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因 D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4 明确基因工程的基本操作程序包括四个方面。 让学生认识到筛选合适的目的基因的重要性。 引导学生学习了解科学研究的方法。 让学生基于DNA复制的相关知识类比推出PCR反应所需要的条件，既可以培养他们的科学思维，又能深化他们对PCR原理的理解。 借助动态视频呈现PCR反应的过程，可以降低学习难度，也便于学生理解和掌握。 通过列表比较PCR技术与DNA复制，培养学生的比较分析能力，强化对该部分知识的掌握。 通过问题驱动引导学生思考PCR技术的具体操作问题，培养学生的科学思维。 即时训练即时评价。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？ 获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？我们 基因包括编码区和非编码区，其中编码区能够编码蛋白质的合成，非编码区不能编码蛋白质，但是可以调控遗传信息的表达，其中启动子和终止子就是位于非编码区。 启动子：一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。通俗来说启动子就是告诉起始密码子可以开始转录了。 终止子：位于基因的下游，也是一段有特殊序列的DNA片段，相当于红色信号灯，使转录在需要停止的地方停下来，终止子就是在告诉终止密码子可以终止转录了。 通过前面的学习我们知道下一步就是要让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使Bt基因能够表达和发挥作用，这就需要进行基因表达载体的构建，这一步是培育转基因抗虫棉的核心工作。如果我们以质粒为载体的话，那么此时的质粒中还需要有启动子、终止子、标记基因等。除此以外，由于这个载体必须要能够在受体细胞中自我复制，因此还会有一个复制原点。 如何构建基因的表达载体呢？其实就是将目的基因导入到载体质粒中去，因此第一步就是切，用限制酶切割质粒形成切口，然后用和切质粒一样的限制酶或用能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶进行连接就可以形成一个重组的DNA分子，这个重组的DNA分子就是基因表达载体。 2、前面说应该用同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？ —— 不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。 而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。 【练习】3.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ B ） A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸 B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件 C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达 D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别 【总结】 适当拓展基因的分子结构，让学生对后面了解载体可能具有的结构。 总结载体的各元件的作用。 结合动画和板书引导学生构建基因表达载体。 通过真实的素材图片强化学生的理解，引导学生思考切割以后的基因和质粒之间的连接存在的可能性有哪些。 即时训练即时评价。 总结限制酶的选择原则，加深学生的理解。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
构建好的基因表达载体如何导入到受体细胞中呢？ 通过用两种不同的限制酶同时对质粒和目的基因进行切割，就可以得到正向连接的基因表达载体，构建好的基因表达载体如何导入受体细胞呢？请大家阅读教材81-82页并回答下列问题： 1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法如何操作？各自适用于什么生物？ 2. 阅读课本P81内容，写出农杆菌转化法的思路 将目的基因导入受体细胞的过程中，受体细胞可以是哪些种类？——可以是植物细胞、动物细胞或微生物细胞。其中导入植物细胞的方法有花粉管通道法和农杆菌转化法，其中花粉管通道法是我国科学家独创的，其中农杆菌转化法是常用的将目的基因导入植物细胞的方法。将目的基因导入动物细胞一般用显微注射法，如果导入到微生物细胞则用Ca2+转化法。 将目的基因导入植物细胞 花粉管通道法： 原理：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。所以实质是将目的基因注入到了植物体的受精卵细胞中； 方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中 方法二：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。 农杆菌转化法 转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。 农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。农杆菌细胞内含有Ti质粒，侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。因此其操作流程大致为： 利用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞时，可以导入体细胞也可以导入到受精卵细胞中。 按道理来讲农杆菌转化法应该更适用于将目的基因导入双子叶植物和裸子植物中，但随着技术的发展，也可以用农杆菌侵染水稻和玉米等单子叶植物。 将目的基因导入动物细胞 如果不是想要抗虫棉或者抗病毒植物等，想要在猪体内获得表达出胰岛素的基因，即将人胰岛素基因导入到猪体内进行表达，因此就涉及到将目的基因导入动物细胞中。常用的方法是显微注射法。前面讲体细胞核移植技术的时候，我们提到用显微操作去核法除去卵母细胞的核，然后用显微注射法将供体细胞注射到供体卵母细胞中。将目的基因导入到动物体中时候常用受精卵细胞为受体细胞，原因：①体积大，易操作。②易表现出全能性，也就是容易培养成完整个体。也就是将人胰岛素基因的表达载体导入到猪的受精卵中，然后进行早期胚胎培养，再通过胚胎移植得到能够产生人胰岛素的猪。 将目的基因导入微生物细胞 我们在讲发酵工程的时候就讲过菌种的来源可以是基因工程，也就是将目的基因导入到菌种中。一般将目的基因导入微生物细胞常用的方法是Ca2+转化法，一般先用Ca2+处理微生物细胞，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。 微生物细胞常常指的是原核细胞，以大肠杆菌的利用最为频繁。选择大肠杆菌的目的是繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。 列表比较常用的三种方法： 学生自主阅读回答问题，驱动学生自主学习能力，培养学生的阅读能力、信息获取能力。 教师逐一引导学生分析各种方法，并对其细节部分进行点评。 通过列表比较三种常见的目的基因导入方法，加深学生的印象，培养学生的比较分析能力、综合理解能力。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？ 以Bt基因表达载体为例，将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？判断是否导入，也就是看受体细胞中是否有目的基因，是否表达也就要看是否表达出相关的蛋白质，可以从转录形成的mRNA和翻译成的蛋白质两个方面进行检测，这些都是从分子水平进行的检测；是否可以正常表达还需要从个体层面上检测，我们可以用棉铃虫来放在这个转基因的棉花植株上，看棉花是否抗棉铃虫，如果不被感染那就说明成功表达。 让学生结合学过的基因表达相关的知识推出检测与鉴定目的基因的几个水平，可以促进他们对这一操作环节的理解，发展思维能力。
总结 学以致用：如何制备能生产人胰岛素的大肠杆菌？ 引导学生对基因工程的基本操作程序有大致的了解。 培养学生的迁移应用能力和实验设计能力。
3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
回顾旧知，导入新课 前面的学习中我们已经知道基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的筛选和获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞以及目的基因的检测与鉴定。其中基因表达载体的构建是核心工作。 回顾旧知，将基因工程的基本操作程序连接成线。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
DNA片段的PCR扩增技术与电泳鉴定方法是如何进行的？ 如果我们在体外进行PCR技术扩增，以及对扩增的产物进行鉴定应该如何进行呢？我们知道体外扩增DNA片段的方法是PCR技术，由于PCR技术中的产物有的并不是纯净的目的基因片段，因此还需要进行鉴定，鉴定的方法用琼脂糖凝胶电泳法。我们先来了解一下实验的原理。 实验原理 DNA体外扩增的原理 PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。由于PCR技术通过高温加热使双链DNA双链解旋，该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解开双链的现象称为DNA的变性，在降温时，双链又可以重新形成，说明DNA的热变性是可逆的。 PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。 （二）DNA片段电泳鉴定的原理 1、DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。【由于绝大部分DNA是带负电荷的，因此在移动的时候会发现基本都是往正极移动】 2、在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。【其实应该也与所带电荷有关，在这个过程中如果DNA分子所带的电荷量都相等，DNA分子越大的话其实移动得越慢】 3、凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。 二、材料用具 1、仪器：PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等） 2、材料：4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等 三、实验过程 （一）PCR扩增过程 离心的目的：在前面加样的时候有的样品是在管壁上的，将其离心集中在离心管的底部，可以提高反应速率。 预变性的目的：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合 教师播放视频，学生对PCR技术的具体操作形成印象。 琼脂糖凝胶电泳过程 配置琼脂糖溶液：电泳缓冲液+琼脂糖——沸水浴至琼脂糖熔化——加入核酸染料； 制备凝胶：将琼脂糖溶液倒入模具——插入梳子形成加样孔——凝胶凝固——取出梳子将其放入电泳槽（电泳槽中的电泳缓冲液超过凝胶1mm） 加样：PCR产物+凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合【凝胶载样缓冲液指示剂的作用是用来指示电泳的进度，不能让DNA跑到凝胶以外的缓冲液中】——加样，留一个孔加标准参照物。 Marker标准参照物的作用：相当于一把标尺，会跑出很多条带，这些条带对应一定大小的核苷酸序列或者碱基序列，通过找到与样品平齐的带可判断样品的片段长度。 4、电泳、观察：1~5V/cm 电泳——300nm紫外灯下观察 教师播放视频，加深学生印象。 【注意事项】 1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。 2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。 3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。 4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。 5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。 【探讨·导学案P58】 探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？ (1)TaqDNA聚合酶失活或浓度过低。 (2)引物出现质量问题。 (3)Mg2＋浓度过低。 (4)变性时的温度低，变性时间短。 探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？【非特异性扩增即就是PCR扩增出来的条带不是所需要的】 (1)模板DNA出现污染。 (2)引物特异性不强或引物设计不合理或引物过短。【引物设计不合理导致PCR在退火复性阶段引物结合到多个基因位点上】 (3)Mg2＋浓度过高。【镁离子的作用是激活DNA聚合酶活性，如果浓度过高，DNA聚合酶的活性会发生改变】 (4)复性时的温度过低等。【GC含量是影响温度设置的原因之一，如果目的基因的GC含量高，而在未达到完全解链温度时，引物会以未完全解链的DNA为模板，进行PCR非特异性扩增。降低退火温度，DNA复性减缓，增加非特异性互补的机会，使得非特异性条带增多】 探讨点3. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？ 【提示】可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。 探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。 【提示】如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；退火温度过低【GC含量是影响温度设置的原因之一，如果目的基因的GC含量高，而在未达到完全解链温度时，引物会以未完全解链的DNA为模板，进行PCR非特异性扩增。降低退火温度，DNA复性减缓，增加非特异性互补的机会，使得非特异性条带增多】；DNA聚合酶的质量不好等。 针对本节的难点之一：PCR产物的电泳鉴定，先用传统的讲解法让学生对知识有了初步的认识，再以视频的形式直观地将琼脂糖凝胶电泳的具体操作映入学生脑海，激发学生的学习兴趣，强化学生对该内容的理解。 根据实验设计方案及实施的具体操作流程，预测其实验结果，并分析影响实验结果的因素。
问题情境 教学活动设计 （学习活动设计） 设计意图
练习 即时训练即时评价(共16张PPT)
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）仪器
（2）材料
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
3、材料用具
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、材料用具
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步骤（PCR）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
移液
离心
扩增
探究.实践
提高反应速率
预变性的目的：
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步骤（电泳鉴定）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
4、实验步骤（电泳鉴定）
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究.实践
探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？探讨点3. 你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。(1)TaqDNA聚合酶失活或浓度过低。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2＋浓度过低。(4)变性时的温度低，变性时间短。(1)模板DNA出现污染。(2)引物特异性不强、引物设计不合理、引物过短。(3)Mg2＋浓度过高。(4)复性时的温度过低等。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(1)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94 ℃的高温处理反应液5 min进行预变性。( )
(2)PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。( )
解析：PCR中离心的目的是让反应组分集中分布在离心管的底部。
(3)电泳鉴定PCR产物时，应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。( )
解析：电泳鉴定PCR产物时，应在一个加样孔中加入指示分子大小的标准参照物，其他加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。
√
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×
【基础过关】
【典例】下列关于PCR的说法，错误的是( )
A.PCR是体外复制DNA的技术
B.PCR过程中只需要一个模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料
C.TaqDNA聚合酶要具有耐高温的特点
D.PCR利用了DNA的热变性原理
解析：PCR是体外复制DNA的技术，A正确；PCR过程中需要一种模板DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料，还需要扩增缓冲液、TaqDNA聚合酶等，B错误；TaqDNA聚合酶具有耐高温的特点，C正确；PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，D正确。
B
【变式训练】用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
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