3.2.1 基因工程的基本操作程序(课件共50张PPT)

(共50张PPT)
一条小虫引发的科技大战
—中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实
普通棉花
转基因抗虫棉
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程
目录 /CONTENTS
01
02
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
03
将目的基因导入受体细胞
04
目的基因的检测与鉴定
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期
表达产物等的基因。
(2)实例：
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
1、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
筛选方法
从相关的
已知结构
和功能清晰
的基因中进行筛选
已知结构
科学家掌握了Bt基因的序列信息
功能清晰
Bt抗虫蛋白只在某类昆虫肠道的碱性环境中才表现出毒性，对人和牲畜无影响
2、目的基因的筛选
一、目的基因的筛选和获取2、目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪明确了目的基因后，该怎么获得它 序列数据库（如GenBank）核苷酸序列比对氨基酸序列比对序列比对工具（如BLAST）课本P96基于网络数据分析基因和蛋白质的序列信息01目的基因的筛选和获取（1）人工合成3、目的基因的获取在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪转基因抗虫棉一、目的基因的mRNA
单链DNA (cDNA）
双链DNA
(即目的基因)
逆转录
合成
逆转录法：
以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
目的基因
推测
推测
化学合成
人工化学合成法 ：
（1）人工合成目的基因（在DNA合成仪中合成）
根据已知的氨基酸序列合成DNA
基因比较小，核苷酸序列已知
01目的基因的筛选和获取苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。提取（2）利用PCR获取和扩增目的基因3、目的基因的获取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。一、01目的基因的筛选和获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的短单链核酸）一、01目的基因的筛选和获取思考：1.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的短单链核酸）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常为小的短单链核酸）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从引物的3′端开始延伸DNA链。一、思考：2. PCR技术与DNA复制过程比较？
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
01目的基因的筛选和获取思考：3.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？【导学案P51】5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’一、如图1、图2分别是PCR扩增技术相关过程，请思考回答下列问题：2．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理，请分别说明理由。 3．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？ 4．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？ 第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。2n－1对引物01目的基因的筛选和获取琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考：5、如何对产物进行鉴定？一、6、用PCR可以扩增mRNA吗？
不能！由于RNA不稳定，需要将RNA逆转录为cDNA，然后再进行扩增。
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是
A.二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
√
2.(2022·天津一中高二期中)下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是
A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
√
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
转录
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
蛋白质
翻译
思考：如果直接把目的基因导入受体细胞，可能会出现什么样的结果？
如何避免该结果的发生呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？
基因的结构
02基因表达载体的构建目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。（核心工作）启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点目的基因：能控制表达所需要的特殊性状终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。二、02基因表达载体的构建（核心工作）如何构建抗虫棉的基因表达载体？①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体二、使用一种限制酶进行切割Bt基因和pBI121质粒，共有几种连接情况？
请大家尝试用胶带模拟DNA连接酶进行操作。
探究 活动
载体与目的基因
反向连接
载体与目的基因
正向连接
目的基因与目的基因之间的连接
目的基因自身环化
载体自身环化
载体与载体之间的连接
使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
问题探讨
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
-G
-CTTAA
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
2、前面说应该用同一种限制酶切割载体和目的基因，现在又说应该用不同的限制酶切割载体和目的基因，两种说法是否冲突？
不冲突，用不同的酶是指不管是切割载体还是切割目的基因，最好都用两种限制酶切，保证不管是载体还是目的基因，其本身左右两侧的切口不同，不会自身环化。
而为了保证目的基因和载体能连接，就要求不管目的基因用的什么种类的限制酶切，载体也应该用同一种限制酶，比如目的基因用酶1和酶2切，则载体也应该用酶1和酶2切。
问题探讨
3.(2022·天津滨海新区高二期末)下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核
苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
√
图解限制酶的选择原则
核心归纳【导学案P53】
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
自主学习：阅读课本P81- P82 ，回答以下问题
1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些，各个方法如何操作？各自适用于什么生物？
2. 阅读课本P81内容，写出农杆菌转化法的思路
前情回顾
将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入微生物细胞
花粉管通道法
-- Ca2+处理法
-- 显微注射法
目的基因导入细胞方法
农杆菌转化法
我国科学家独创
常用
三、将目的基因导入受体细胞
目的基因
（1）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
适用生物：开花植物
1.目的基因导入植物细胞
三、将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化法：
转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
实质是基因重组。
1.目的基因导入植物细胞
农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌
农杆菌细胞内含有Ti质粒，侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
（可转移的DNA）
三、将目的基因导入受体细胞
构建表达载体
导入农杆菌
导入植物细胞
新性状植株
（2）农杆菌转化法操作程序
1.目的基因导入植物细胞
植物组织培养
Ti-DNA将目的基因插入植物细胞染色体DNA
将目的基因插入到Ti质粒上的T-DNA中
三、将目的基因导入受体细胞
032.目的基因导入动物细胞将目的基因导入受体细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物三、（1）常用方法：Ca2+处理法原核细胞（常选择大肠杆菌）目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（2）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。3.目的基因导入微生物细胞03将目的基因导入受体细胞Ca2+感受态细胞吸收三、种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
三、将目的基因导入受体细胞
四、目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
04
目的基因的检测与鉴定
思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
Bt目的基因
普通棉花
转基因抗虫棉
mRNA
Bt抗虫蛋白
分子水平
（个体水平）
转录
翻译
四、
04目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等四、
总结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
学以致用 如何制备能生产人胰岛素的大肠杆菌？
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
加工
成熟胰岛素
1.研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
(1)ap基因是培育抗冻番茄用到的目的基因。 ( )
(2)构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。( )
(3)只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。( )
×
×
√
一、概念检测（P83）
2，利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 ( )
A . PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B .变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C .复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D .延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP 和4种核糖核苷酸
D
二、拓展应用（P83）练习与应用1.研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。提示:外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插人。大多数情况下，插人的位点难以做到定点插人;插人的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。 2.八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtI表示)参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转人水稻，使水稻胚乳中富含B-胡萝卜素。由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
(1)科学家在培育“黄金大米”时，将crtI和psy基因导人含pmi基因的质粒中，构建了质粒 pSYN12424。该项研究的目的基因是 ，标记基因是 ，质粒pSYN12424的作用是_______________________________。
crtI基因和psy基因
pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
(2)在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列 为什么
不能。 如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
(3)请查找相关资料，了解科学家为什么要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广'黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。提示:维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝卜素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝卜素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝卜素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广'黄金大米’”的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。Thanks!
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