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授课教师：XXX
植物细胞工程
第1节
第2章 细胞工程
学习目标
通过对植物细胞工程技术基本原理的分析，形成结构与功能观
生命观念
运用流程图概括植物组织培养、植物体细胞杂交技术的基本操作程序，培养归纳与概括、模型与建模的科学思维习惯
科学思维
通过进行菊花的组织培养，培养探究与创新能力
科学探究
哈里森用一滴淋巴液成功培养了蝌蚪的神经元，首创了动物组织体外培养法
1907年
科金用真菌的纤维素酶分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
1960年
米尔斯坦和科勒获得能稳定遗传的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
1975年
斯图尔德等发现胡萝卜的体细胞可以分化为胚，为细胞全能性理论提供了强有力的支持。
1958年
卡森诱导烟草原生质体融合，培育出第一株体细胞杂交植物
1971年
科技探索之路——细胞工程发展历程
世界上第一只体细胞克隆羊多莉诞生，随后多种克隆动物相继问世。
汤姆森和吉尔哈特获得可体外培养的人胚胎干细胞
我国科学家首次培育了体细胞克隆猴。
科技探索之路——细胞工程发展历程
山中伸弥获得诱导多能干细胞
1996年
1998年
2006年
2017年
细胞工程
指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过某种工程学手段，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。
按操作对象分
植物细胞工程
动物细胞工程
从社会中来
“其芽茸茸，其叶青青，犹绿衣郎，挺节独立，可敬可慕。迨夫花开，凝晴露，万态千妍，薰风自来，四坐芬郁，岂非入兰室乎！”
但是兰花种子通常发育不全，在自然条件下萌发率极低；传统分株繁殖的方式，又存在繁殖周期长、繁殖率低等问题，如果靠自然繁殖，兰花的价格可想而知了。
如何能让名贵的兰花大量、快速地繁殖，从而走入寻常百姓家呢？
利用植物组织培养技术可以大量、快速地培育兰花。
一、植物组织培养技术
指将离体的植物器官、组织或细胞（称为外植体）等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其形成完整植株的技术。
细胞增殖方式只涉及有丝分裂
1.概念
植物细胞的全能性。
2.原理
接种外植体
诱导愈伤组织
诱导生芽
诱导生根
移栽成活
细胞的全能性
新教材必修1-P121——细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性。
选择性必修3-P34 ——细胞经分裂和分化后，仍然具有产生完整生物体或分化成其他各种细胞的潜能，即细胞具有全能性。
分裂
分化
分裂
分化
共同
组成
生物个体
受精卵
干细胞
体细胞
2.细胞具有全能性的原因：高度分化的细胞仍含有该物种的全部遗传信息，具有发育成完整个体所需要的全套基因。
细胞的全能性
3、体现全能性的标志：
实例：胡萝卜韧皮部细胞发育成完整植株
受精卵发育成个体（动植物）
蜜蜂受精卵发育成工蜂，卵细胞发育成雄峰
用一片叶子、一片花瓣、一粒花粉繁殖出新的植株
4、不体现全能性的实例：
5、为什么生物体内细胞并没有表现出全能性，而是分化成为不同的组织器官？
基因在特定的时间和空间条件下选择性表达的结果
细胞→ 完整个体或其他各种细胞
芽原基只能发育为芽，叶原基只能发育为叶
(1)外植体：用于植物组织培养的离体的植物器官、组织或细胞。
(2)脱分化：已经分化的细胞，经过诱导，失去其特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程。
(3)愈伤组织：排列疏松、无规则，高度液泡化、不定形的薄壁组织团块。
(4)再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化出根或芽等器官的过程。
外植体
脱分化
愈伤组织
（未分化状态）
再分化
胚状体
根
再生植株
芽
(5)胚状体：离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，因而统称为体细胞胚或胚状体。
植物组织培养技术的过程
比较内容 脱分化 再分化
过程 外植体→愈伤组织 愈伤组织→幼苗
形成体特点 排列疏松、不定形的薄壁组织团块 有根、茎
需要条件 ①离体； ②适宜的营养； ③生长素/细胞分裂素的比例适中； ④不需光照 ①离体；
②适宜的营养；
③生长素/细胞分裂素的比例高或低诱导生根或生芽；
④光照
脱分化与再分化的比较
探究·实践 菊花的组织培养
①植物细胞一般具有 ；
全能性
②在一定的激素和营养等条件的诱导下，已经分化的细胞可以经过 ， 和 ，形成 ，长出 ，进而发育成 ；
脱分化
再分化
胚状体
芽和根
完整的植株
③植物激素中 和 是启动 、 和 的关键激素，它们的 、 等都会影响植物细胞的发育方向；
生长素
细胞分裂素
细胞分裂
脱分化
再分化
浓度
比例
①了解植物组织培养的基本原理；
②了解生长素和细胞分裂素的浓度、用量的比例对菊花愈伤组织形成和分化的影响；
③尝试进行植物组织培养。
1.实验原理
2.实验目的
探究·实践 菊花的组织培养
3.材料用具
①外植体：
幼嫩的菊花茎段
(容易诱导形成愈伤组织)
②体积分数为70%的酒精：
对手、超净工作台、外植体进行消毒
③质量分数为5%左右的次氯酸钠溶液:
对外植体进行消毒
④无菌水:
清洗外植体
⑤培养基
水（去离子水）
无机营养（大量元素、微量元素）
有机营养（蔗糖、维生素、氨基酸）
天然附加物
植物激素（生长素、细胞分裂素等）
一、植物组织培养技术
菊花的组织培养
（1）
制备
外植体
消毒：
切割：（无菌操作）
酒精
30S
无菌水
2-3次
次氯酸钠溶液
30min
材料：
幼嫩的菊花茎段
2-3次
无菌水洗
消毒与无菌水冲洗
切割与接种
用酒精擦拭双手和超净工作台台面。将流水充分冲洗后的外植体。
将消过毒的外植体置于无菌的培养皿中，用无菌滤纸吸去表面的水分。用解剖刀将外植体切成0.5~1cm长的小段。
一、植物组织培养技术
菊花的组织培养
超净工作台或接种箱
产生愈伤组织
在酒精灯火焰旁，将外植体的1/3~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中。用封口膜或瓶盖封盖瓶口，并在培养瓶上作好标记。
将接种了外植体的锥形瓶或植物组织培养瓶置于18~22℃的培养箱中培养。在培养过程中，定期观察和记录愈伤组织的生长情况。
（2）接种到诱导愈伤组织培养基
脱分化 避光
形成愈伤组织
有光时，往往容易形成维管组织，而不易形成愈伤组织。
一、植物组织培养技术
菊花的组织培养
培养15~20d后，将生长良好的愈伤组织转接到诱导生芽的培养基上。长出芽后，再将其转接到诱导生根的培养基上，进一步诱导形成试管苗。
（3）接种到诱导生芽培养基
（4）接种到诱导生根培养基
接种室
若先生根后面就不易生芽
生长素和细胞分裂素的比例和浓度都会影响植物细胞的发育方向
低→利于芽的分化
细胞分裂素
生长素
高→利于根的分化
适中→利于愈伤组织的形成
一、植物组织培养技术
菊花的组织培养
移栽前先打开封口膜或瓶盖，让试管苗在培养箱内生长几日。用流水清洗掉根部的培养基后，将幼苗移植到消过毒的虹石或珍珠岩等环境中，待其长壮后再移栽入土。每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花。
试管苗
移栽
培养室
一、植物组织培养技术
结果分析与评价
1.在植物组培过程中，为什么要进行一系列的消毒，灭菌，并且要求无菌操作？
用于植物组织培养的培养基同样适合某些微生物的生长，如一些细菌、真菌等的生长。培养物一旦受到微生物的污染，就会导致实验前功尽弃，因此要进行严格的无菌操作。
2.为什么切取胡萝卜根的形成层，其他部分也能培养成小植株吗？
胡萝卜根形成层容易诱导成愈伤组织，其他部分如叶、花也能培养成小植株，只是稍微困难些。
一、植物组织培养技术
结果分析与评价
1、导致外植体被污染的原因可能有：培养基、接种工具灭菌不彻底；外植体消毒不彻底；操作过程不符合无菌操作要求等。
2、观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出了愈伤组织。从刚接种的外植体到长出愈伤组织一般需要2周左右的时间。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成芽和根的比例和时间.
3、做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要做好实验记录，可以分组配制不同的培养基，如诱导愈伤组织的培养基、诱导生芽的培养基等，还可以进行不同配方的比较。
外植体
脱分化
愈伤组织
（未分化状态）
再分化
胚状体
根
再生植株
芽
一、植物组织培养技术
植物组织培养的条件
①离体
②无菌
③培养基：有机物、无机盐、植物激素、水、琼脂（固体培养基）
蔗糖：提供能量、调节渗透压。
植物激素：主要是生长素和细胞分裂素。
植物激素的比例不同，实验结果不同。
生长素/细胞分裂素适中→促进愈伤组织的形成。
生长素<细胞分裂素→利于芽的分化
生长素>细胞分裂素→利于根的分化
一、植物组织培养技术
植物组织培养的条件
要培育出如图所示的番茄—马铃薯利用传统有性杂交方法能实现吗？为什么？
不能，因为不同种生物之间存在着生殖隔离。
于是，这些科学家试图用这两种植物的体细胞进行杂交，来实现这一美妙的设想。
二、植物体细胞杂交技术
1.概念
将不同来源的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的技术。
细胞A
细胞B
原生质体B
原生质体A
融合原生质体
杂合细胞AB
愈伤组织
再分化
杂合植株
植物细胞融合
植物组织培养
脱分化
二、植物体细胞杂交技术
过程
A细胞
B细胞
A原生质体
B原生质体
①去除细胞壁，获得原生质体
方法：酶解法
纤维素酶和果胶酶
注意：
去除细胞壁的植物细胞是否需要保证渗透压稳定？
需要，可以加入山梨醇和甘露醇来稳定渗透压！防止细胞吸水涨破或失水皱缩。
二、植物体细胞杂交技术
过程
再生出细胞壁
②诱导原生质体融合
原理：细胞膜具有流动性
方法：物理方法&化学方法
关键环节
物理方法：电融合法、离心法
化学方法：聚乙二醇（PEG）法
高Ca2+-高pH融合法
二、植物体细胞杂交技术
过程
再生出细胞壁
②诱导原生质体融合
注意
融合后杂种细胞需要经过筛选才能获得所需要的杂种细胞！
关键环节
A
B
A
B
融合
筛选
A
A
A
B
BB
A
B
A
B
二、植物体细胞杂交技术
3.原理
细胞膜具有一定的流动性
植物细胞的全能性
4.两个标志
（1）植物细胞融合完成的标志：
再生出新的细胞壁
（2）植物体细胞杂交完成的标志：
培育成新植物体
白菜—甘蓝、普通小麦—长穗偃麦草等。
打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种。
5.实例
6.意义
番茄-马铃薯(理想图)
植物体细胞杂交后代的遗传变化
项目 体细胞杂交 P1：2n(AaBb) 与 P2：2m(CcDd)
生殖类型
变异类型
染色体数
染色体组数
基因组成
无性繁殖，育种过程中不遵循孟德尔定律
染色体数目变异
两亲本染色体数之和。2n+2m
两亲本染色体组数之和。2+2
两亲本基因型之和。AaBbCcDd
若亲本植株可育，则杂种植株可育。杂种植株是不同于亲本的新物种。
本堂小结
概念
植物细胞融合
原生质体制备
过程
变异类型
植物组织培养
原生质体融合
原理
育种类型
原理
过程
花药离体培养
细胞全能性
操作步骤
脱分化
再分化
外植体
根、芽、胚状体
愈伤组织
外植体消毒
接种
切块
形成愈伤组织
诱导生芽生根
植物体细胞杂交
植物组织培养
植物细胞工程
优缺点
一、概念检测
练习与应用
1.下图是利用甲、乙两种植物的各自优势，通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是（ ）
A.进行a处理时能用胰蛋白酶
B.b是诱导融合后得到的杂种细胞
C.c是培养后得到的具有耐盐性状的幼芽
D.进行d选择时要将植株种在高盐环境中
√
一、概念检测
练习与应用
2.科学家在制备原生质体时，有时使用蜗牛消化道提取液来降解植物细胞的细胞壁。据此分析，蜗牛消化道提取液中可能含有什么成分
纤维素酶和果胶酶
二、拓展应用
"番茄—马铃薯"杂种植株没有如科学家所想象的那样，地上结番茄，地下长马铃薯，这是为什么
"番茄—马铃薯"没有像人们预想的那样地上结番茄、地下长马铃薯，主要原因是∶生物体内基因的表达不是孤立的，它们之间是相互调控、相互影响的，所以"番茄—马铃薯"杂种植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质，但这些遗传物质的表达相互干扰，它们不能再像马铃薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达，杂种植株自然就不能地上结番茄、地下长马铃薯了。
