3-2 基因工程的基本操作程序 课件（44张PPT1份视频）高中生物学人教版（2019）选择性必修三
文档属性
| 名称 | 3-2 基因工程的基本操作程序 课件（44张PPT1份视频）高中生物学人教版（2019）选择性必修三 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 21.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-01-17 20:23:32 | ||
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文档简介
(共44张PPT)
§3-2 基因工程的基本操作程序
基因工程
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
第一步
目的基因的筛选与获取
目的基因的含义
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
培育抗虫棉的抗虫基因
来 源
苏云金杆菌
作用原理
通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
名 称
Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。
苏云金杆菌
培育抗虫棉的抗虫基因
相关信息
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
目的基因的筛选
方 法
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
举 例
在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Br基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
发 展
随着测序技术的发展，以及遗传序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
目的基因的获取
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。
现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
获取目的基因的方法有多种
获得目的基因的方法
人工合成
目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库来获取目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR含义
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
该技术由穆里斯等人于1985 年发明，为此，穆里斯于1993 年获得了诺贝尔化学奖。
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA复制和PCR反应的基本条件
条件 体内DNA复制 PCR反应 作用
模板 DNA母链 提供DNA复制的模板
原料 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
酶 解旋酶 高温代替 打开DNA双链
DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 需要 需要 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
其他 需要在一定的缓冲溶液中、通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
利用PCR获取和扩增目的基因
相关信息
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA 模板
4 种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA 聚合酶
扩增的过程
扩增的条件
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
变性(90℃以上)
目的基因DNA受热变性后解为单链
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
复性(50℃左右)
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
50℃
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
延伸
(72℃左右)
溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA 链。
72℃
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
循环多次。目的基因的量成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
利用PCR获取和扩增目的基因
仪 器
在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成。
鉴 定
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
第二步
基因表达载体的构建
基因表达载体的构建（核心工作）
构建目的
让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
目的基因
标记基因
启动子
本质：是一段有特殊序列结构的DNA片段。
位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。
作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
标记基因
启动子
终止子
复制原点
目的基因
说明：有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
基因表达载体的构建（核心工作）
构建目的
让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
目的基因
标记基因
启动子
终止子
本质：也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
位置：位于基因的下游
作用：使转录在所需要的地方停下来。
标记基因
启动子
终止子
复制原点
目的基因
基因表达载体的构建（核心工作）
构建方法
限制酶切割位点
启动子
终止子
复制原点
标记基因
质粒
用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
限制酶
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
连接酶
重组
DNA 分子
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子。
基因表达载体构建模式图
第三步
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
花粉管通道法
我国科学家独创。
应用举例：抗虫棉的培育过程中，采用该法将Bt基因导入了棉花细胞。
操作方法：有多种，如：
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
农杆菌转化法
转化的含义：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
农杆菌的特点：
是一种在土壤中生活的微生物。
能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
Ti 质粒
T-DNA
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
农杆菌转化法
原理：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
方法：根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。例如：
将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
成果：随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
将目的基因导入受体细胞——动物细胞
显微注射法
常用受体细胞：
动物受精卵
最常用的方法：
利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
将目的基因导入受体细胞——微生物
细菌转化法
生物：
在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
方法：
一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
第四步
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
目 的
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。
方法步骤
分子水平的检测：
通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。
个体生物学水平的鉴定：例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
基因工程的基本操作
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获得目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作流程图
到社会中去
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt 抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。
在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
【提示】这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平;2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
到社会中去
科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为几个方面。
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一;现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如 CrylAa和 CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%~30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花;在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
电泳鉴定：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
目的要求
了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。相关试剂的配方参见本书附录 3。
微量离心管
调节旋钮
推动杆
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
微量
移液器
琼脂糖凝胶电泳装置
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
移液：用微量移液器按照右栏中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
PCR加样操作
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的TaqDNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
PCR反应体系的配方
注：模板DNA的用量为1gp～1μg
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
制备琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2% 的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
往凝胶加样孔内加样的操作
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
观察电泳鉴定结果
注意：
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析与评价
你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
【提示】可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
【提示】如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体;退火温度过低;DNA聚合酶的质量不好等。
预习：基因工程的应用
本课学习结束
农杆菌转化法
§3-2 基因工程的基本操作程序
基因工程
从社会中来
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）
第一步
目的基因的筛选与获取
目的基因的含义
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。
根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。
培育抗虫棉的抗虫基因
来 源
苏云金杆菌
作用原理
通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家通过实验，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
名 称
Bt抗虫蛋白基因，简称Bt基因。
苏云金杆菌
培育抗虫棉的抗虫基因
相关信息
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。
目的基因的筛选
方 法
从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一
举 例
在培育转基因抗虫棉之前，用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。研究表明，苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关。科学家不仅掌握了Br基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。因此，Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。
发 展
随着测序技术的发展，以及遗传序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
目的基因的获取
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家人工合成了目的基因。
现在，常用PCR特异性地快速扩增目的基因。
获取目的基因的方法有多种
获得目的基因的方法
人工合成
目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
通过构建基因文库来获取目的基因
利用PCR获取和扩增目的基因
PCR含义
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
该技术由穆里斯等人于1985 年发明，为此，穆里斯于1993 年获得了诺贝尔化学奖。
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA复制和PCR反应的基本条件
条件 体内DNA复制 PCR反应 作用
模板 DNA母链 提供DNA复制的模板
原料 4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
酶 解旋酶 高温代替 打开DNA双链
DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 需要 需要 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
其他 需要在一定的缓冲溶液中、通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
利用PCR获取和扩增目的基因
相关信息
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+。
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。
利用PCR获取和扩增目的基因
DNA 模板
4 种脱氧核苷酸
引物
耐高温的DNA 聚合酶
扩增的过程
扩增的条件
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
变性(90℃以上)
目的基因DNA受热变性后解为单链
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
复性(50℃左右)
两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
50℃
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
延伸
(72℃左右)
溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则加到引物的3’端，合成新的DNA 链。
72℃
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物。
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物。
利用PCR获取和扩增目的基因
扩增的过程
重复
循环多次。目的基因的量成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
利用PCR获取和扩增目的基因
仪 器
在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成。
鉴 定
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
第二步
基因表达载体的构建
基因表达载体的构建（核心工作）
构建目的
让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
目的基因
标记基因
启动子
本质：是一段有特殊序列结构的DNA片段。
位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。
作用：是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
标记基因
启动子
终止子
复制原点
目的基因
说明：有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
基因表达载体的构建（核心工作）
构建目的
让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；
使目的基因能够表达和发挥作用。
基因表达载体的组成
目的基因
标记基因
启动子
终止子
本质：也是一段有特殊序列结构的DNA片段。
位置：位于基因的下游
作用：使转录在所需要的地方停下来。
标记基因
启动子
终止子
复制原点
目的基因
基因表达载体的构建（核心工作）
构建方法
限制酶切割位点
启动子
终止子
复制原点
标记基因
质粒
用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口
用同一种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
限制酶
限制酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
连接酶
重组
DNA 分子
利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成了一个重组DNA分子。
基因表达载体构建模式图
第三步
将目的基因导入受体细胞
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
花粉管通道法
我国科学家独创。
应用举例：抗虫棉的培育过程中，采用该法将Bt基因导入了棉花细胞。
操作方法：有多种，如：
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
农杆菌转化法
转化的含义：是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
农杆菌的特点：
是一种在土壤中生活的微生物。
能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
Ti 质粒
T-DNA
将目的基因导入受体细胞——植物细胞
农杆菌转化法
原理：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。
方法：根据受体植物的不同，所用的具体转化方法有所区别。例如：
将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
成果：随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
将目的基因导入受体细胞——动物细胞
显微注射法
常用受体细胞：
动物受精卵
最常用的方法：
利用显微注射直接将目的基因注入动物的受精卵中，这个受精卵将发育成为具有新性状的动物。
将目的基因导入受体细胞——微生物
细菌转化法
生物：
在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌应用最为广泛。
方法：
一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
第四步
目的基因的检测与鉴定
目的基因的检测与鉴定
目 的
目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这也是检查转基因抗虫棉是否培育成功的一步。
方法步骤
分子水平的检测：
通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA；
从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。
个体生物学水平的鉴定：例如，通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
基因工程的基本操作
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获得目的基因
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
基因工程的基本操作流程图
到社会中去
转基因抗虫棉在世界范围内被广泛种植，有效控制了棉铃虫的种群数量，显著减少了农药的用量。面对棉铃虫的危害，有了抗虫棉是否就可以一劳永逸、高枕无忧呢？根据棉铃虫对传统农药产生抗性的发展历史，科研人员推测棉铃虫存在对Bt 抗虫蛋白产生抗性的可能。请你查阅资料，了解以下问题。
在实际种植过程中，棉铃虫是否对转Bt基因的抗虫棉产生了严重的抗性？证据是什么？
【提示】这是一个开放性的问题，需要学生查找资料来回答。随着田间监测数据的更科研论文发表，每年学生获得的证据是不一样的。例如，科研人员对长江流域种植的抗虫棉进行了监测，2011年的数据显示，大部分转基因抗虫棉品种的抗虫性属于中抗及高抗水平;2013年的数据表明，如果棉田周围存在大量天然庇护所，靶标害虫棉铃虫、红铃虫等基因的抗虫棉产生明显抗性。在我国、澳大利亚、印度等国的多个实验室中，通过毒抗性筛选，已经培育出多个高抗水平的转基因抗虫棉品种。教师要注意引导学生搜集的证据，如科研论文、权威的官方报道等。
到社会中去
科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
科研人员想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有很多，主要可以分为几个方面。
(1)基因策略。该策略是在分子水平上提高转基因抗虫棉的抗虫性和抗虫持久性，包括在棉花中转入多个杀虫基因、构建组织特异性表达的启动子、提高杀虫基因的表达量等。例如，最早种植的抗虫棉中只转入了一种Bt基因，抗性比较单一;现在经常将两种或两种以上的Bt基因(如 CrylAa和 CryIAc基因)同时转入棉花细胞，这样既可以提高杀虫活性，又可以延缓害虫抗性的产生和发展，还可以通过不同基因间的互补作用扩大抗虫范围。
到社会中去
科研工作者在发现棉铃虫出现抗性之前，就应该想办法应对。他们想出的延缓棉铃虫对Bt抗虫蛋白产生抗性的措施有哪些？这些措施的原理是什么？有效吗？
(2)田间策略。这是在种植时采取的措施，如提供庇护所、与其他作物轮作或套种等。例如，在澳大利亚和美国等地普遍采取的措施是在转基因棉田中，总面积的4%种植不使用任何杀虫剂的非转基因棉花，或在转基因棉田周围种植20%~30%面积的可使用化学杀虫剂的非转基因棉花;在印度，一些地区要求，在转基因棉田周围至少种植5行或者20%面积的非转基因棉花。我国除新疆棉区及大型农场需设计专门的庇护所外，其他棉区如长江、黄河流域棉区多采用多种作物混作的耕作制度(如将转基因抗虫棉与番茄、向日葵、高粱、玉米、辣椒等棉铃虫寄主作物混作)，这些作物可以构成天然的庇护所，一般无须种植非转基因棉花作为庇护所。这样做的原理是为少部分害虫提供一个正常的取食环境，始终保持一定的敏感目标害虫种群。这样，即使目标害虫对转基因抗虫棉产生了抗性，但是因为其与敏感目标害虫交配，后代抗性基因会发生分离，所以抗性目标害虫的种群也不至于迅速增加。
(3)国家宏观调控策略。该策略包括实施分区种植管理、加强抗性监测、进行严格的安全性评价等。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
实验原理
扩增：利用PCR可以在体外进行DNA片段的扩增。PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
电泳鉴定：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
目的要求
了解PCR和电泳鉴定的基本原理。
尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
材料用具
PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）、4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。相关试剂的配方参见本书附录 3。
微量离心管
调节旋钮
推动杆
卸枪头按钮
体积刻度
吸液杆
微量
移液器
琼脂糖凝胶电泳装置
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
移液：用微量移液器按照右栏中的配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
PCR加样操作
10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的TaqDNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
PCR反应体系的配方
注：模板DNA的用量为1gp～1μg
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
离心：待所有的组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10 s，使反应液集中在管的底部。
反应：参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
制备琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量分数为0.8%～1.2% 的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
制备凝胶：将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜。
加样：将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
往凝胶加样孔内加样的操作
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
方法步骤
电泳：接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。
观察记录：取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
观察电泳鉴定结果
注意：
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
【探究·实践】DNA片段的扩增及电泳鉴定
结果分析与评价
你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
【提示】可以通过在紫外灯下直接观察DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
【提示】如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体;退火温度过低;DNA聚合酶的质量不好等。
预习：基因工程的应用
本课学习结束
农杆菌转化法