选择性必修3《生物技术与工程》课时跟踪检测（13） 基因工程的基本操作程序（解析版）
文档属性
| 名称 | 选择性必修3《生物技术与工程》课时跟踪检测（13） 基因工程的基本操作程序（解析版） |  | |
| 格式 | DOC | ||
| 文件大小 | 276.9KB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-02-11 10:05:27 | ||
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文档简介
选择性必修3《生物技术与工程》课时跟踪检测
（十三） 基因工程的基本操作程序
一、选择题
1．下列过程中没有涉及碱基互补配对原则的是( )
A．提取目的基因
B．目的基因与载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的表达和检测
解析：选C 目的基因的获取方法有从基因文库中获取、利用PCR扩增，其中用PCR扩增涉及碱基互补配对原则；目的基因与载体结合、目的基因的表达和检测都涉及碱基互补配对原则；将目的基因导入受体细胞不涉及碱基互补配对原则。
2．下列关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的叙述，错误的是( )
A．PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶
B．PCR过程需要DNA连接酶
C．PCR扩增区域由2个引物来决定
D．不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
解析：选B PCR在较高温度下进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶，不需要DNA连接酶，B错误；PCR扩增区域由2个引物来决定，C正确；不同大小的DNA在电场中迁移速率不同，D正确。
3．用限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，应选用如图中的Ti质粒是( )
注：图中箭头所指的位置是限制酶识别和切割的位点。
解析：选C Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应该将目的基因插入T-DNA上，则限制酶XbaⅠ和SacⅠ的切割位点都应该在T-DNA上，C项符合题意。
4．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列相关叙述正确的是( )
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节生长调节剂的配比可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体生物学水平检测
解析：选D 过程①表示基因表达载体的构建过程，即形成重组 Ti质粒的过程，需要使用限制酶和DNA连接酶，不需要纤维素酶和果胶酶，A错误；过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2 处理农杆菌，B错误；过程③④为再分化形成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和生长调节剂的配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织的目的，并由此再生出新植株， C错误；可通过进行个体生物学水平的检测判断转基因抗虫烟草是否培育成功，即让害虫吞食转基因烟草，观察害虫的存活情况进行判断，D正确。
5．在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是( )
A．导入植物细胞时均采用农杆菌转化法
B．转基因动物的获得多数运用基因枪法
C．大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理
D．导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物
解析：选C 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；显微注射法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法；大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理，使其成为感受态细胞；导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成早期胚胎，再经胚胎移植进入母体子宫内，其在母体子宫内发育成转基因动物。
6．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术
C．目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的
D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子
解析：选A 目的基因在真核细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上，A错误；通过抗原抗体杂交可以检测目的基因是否翻译成了蛋白质，检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术，B正确；目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的，如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，C正确；如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子，D正确。
7．利用PCR扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下相关叙述错误的是( )
A．变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性时引物a必须与引物b碱基互补配对
C．由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b
D．延伸时需要耐高温的DNA聚合酶催化
解析：选B 在PCR变性过程中高温破坏的是DNA分子的双螺旋结构，使其碱基对间的氢键断裂，A正确；复性时引物a、引物b需要与模板进行碱基互补配对，如果引物a和引物b发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，B错误；由于DNA复制方式为半保留复制，而引物为单链DNA片段，所以由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b，C正确；延伸时的温度为72 ℃左右，所以要用耐高温的DNA聚合酶催化子链合成，D正确。
8.如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是( )
A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B．不同基因表达载体的构建方法是不同的
C．图中启动子位于基因的上游，是DNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
解析：选C 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
9．下列有关聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因的叙述，错误的是( )
A．为方便构建重组质粒，在引物中需要适当添加限制酶的切割位点
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连
C．PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关
D．PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步
解析：选C 为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制酶的切割位点，A正确；设计引物时需要避免引物之间的碱基互补配对，以防止造成引物自身连接，B正确；复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其比例，还有靶基因序列的长度，如果引物中GC含量高，需要设定更高的复性温度，C错误；PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步，D正确。
10．(2024·湖南高考，改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是( )
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
解析：选B 利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5′－CTACCCGTGAT－3′，患者的测序结果为5′－CTACCTGTGAT－3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。
二、非选择题
11．某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，如图1表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图2表示质粒，其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)题(1)中不使用另外一种限制酶切割的原因是__________________，题(1)中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生________种不同的DNA片段。
(3)质粒中抗性基因的作用是__________________。成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含______(填“氨苄青霉素”或“四环素”)的培养基中进行培养。
(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是__________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)外源DNA和质粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的识别序列和切割位点，但限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，应该选用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA分子；使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接。(2)构建成功的重组质粒含有3个限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点，因此若用该酶切割构建成功的重组质粒能产生3种不同的DNA片段。(3)质粒中抗性基因的作用是筛选和鉴定目的基因；构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，但氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含四环素的培养基中进行培养。(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接 (2)SmaⅠ会破坏目的基因 3 (3)筛选和鉴定目的基因 四环素 (4)将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长
12．(2023·全国乙卷)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指________________________
________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为______，其作用是__________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是________________________________________________
______________________。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______________________(答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。(3)结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。(4)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，实验思路见答案。
答案：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同 (4)选择合适的载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光
13．(2024·全国新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是______________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是__________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是______________________________________(答出2点即可)。
解析：(1)限制酶(限制性内切核酸酶)能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。N基因表达需要RNA聚合酶与启动子结合启动转录，还需要终止子终止转录，在题述对应位置插入M1与M2片段，可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子在插入B1的基因组时被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA中存在碱基A、G、C、U，而B1基因组DNA中存在碱基A、G、C、T，RNA与DNA互补配对时也遵循碱基互补配对原则，可以形成的碱基对有G—C、C—G、A—T和U—A。(3)根据题意，为验证片段甲是否插入了细菌B1基因组中，应该以菌株B2的基因组DNA为模板进行PCR。该模板没有引物P4的结合位置，若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是无法扩增出目的产物。(4)解析略。
答案：(1)磷酸二酯键 可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达
(2)C—G、A—T、U—A (3)菌株B2基因组DNA 无法扩增出目的产物 (4)减少环境污染；实现废物利用(合理即可)
（十三） 基因工程的基本操作程序
一、选择题
1．下列过程中没有涉及碱基互补配对原则的是( )
A．提取目的基因
B．目的基因与载体结合
C．将目的基因导入受体细胞
D．目的基因的表达和检测
解析：选C 目的基因的获取方法有从基因文库中获取、利用PCR扩增，其中用PCR扩增涉及碱基互补配对原则；目的基因与载体结合、目的基因的表达和检测都涉及碱基互补配对原则；将目的基因导入受体细胞不涉及碱基互补配对原则。
2．下列关于PCR扩增DNA片段和电泳检测扩增产物实验的叙述，错误的是( )
A．PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶
B．PCR过程需要DNA连接酶
C．PCR扩增区域由2个引物来决定
D．不同大小的DNA在电场中迁移速率不同
解析：选B PCR在较高温度下进行，因此需要耐高温的DNA聚合酶，A正确；PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶，不需要DNA连接酶，B错误；PCR扩增区域由2个引物来决定，C正确；不同大小的DNA在电场中迁移速率不同，D正确。
3．用限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段。若利用该片段构建基因表达载体，应选用如图中的Ti质粒是( )
注：图中箭头所指的位置是限制酶识别和切割的位点。
解析：选C Ti质粒上的T-DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此构建基因表达载体时，应该将目的基因插入T-DNA上，则限制酶XbaⅠ和SacⅠ的切割位点都应该在T-DNA上，C项符合题意。
4．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列相关叙述正确的是( )
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节生长调节剂的配比可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体生物学水平检测
解析：选D 过程①表示基因表达载体的构建过程，即形成重组 Ti质粒的过程，需要使用限制酶和DNA连接酶，不需要纤维素酶和果胶酶，A错误；过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2 处理农杆菌，B错误；过程③④为再分化形成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和生长调节剂的配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织的目的，并由此再生出新植株， C错误；可通过进行个体生物学水平的检测判断转基因抗虫烟草是否培育成功，即让害虫吞食转基因烟草，观察害虫的存活情况进行判断，D正确。
5．在将目的基因导入受体细胞的相关操作中，叙述正确的是( )
A．导入植物细胞时均采用农杆菌转化法
B．转基因动物的获得多数运用基因枪法
C．大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理
D．导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成转基因动物
解析：选C 将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是农杆菌转化法；显微注射法是将目的基因导入动物细胞中最为有效的方法；大肠杆菌作为受体细胞时通常需要使用Ca2＋处理，使其成为感受态细胞；导入目的基因的动物受精卵在培养液中发育成早期胚胎，再经胚胎移植进入母体子宫内，其在母体子宫内发育成转基因动物。
6．下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B．检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术
C．目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的
D．如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子
解析：选A 目的基因在真核细胞中稳定遗传的关键是目的基因是否插入转基因生物的染色体DNA上，A错误；通过抗原抗体杂交可以检测目的基因是否翻译成了蛋白质，检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录可使用PCR等技术，B正确；目的基因表达的鉴定通常是在个体水平上进行的，如抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等，C正确；如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质，可确定目的基因上游含有启动子，D正确。
7．利用PCR扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。以下相关叙述错误的是( )
A．变性过程中断裂的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性时引物a必须与引物b碱基互补配对
C．由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b
D．延伸时需要耐高温的DNA聚合酶催化
解析：选B 在PCR变性过程中高温破坏的是DNA分子的双螺旋结构，使其碱基对间的氢键断裂，A正确；复性时引物a、引物b需要与模板进行碱基互补配对，如果引物a和引物b发生碱基互补配对，则不能与相应模板链结合，无法完成子链的延伸，B错误；由于DNA复制方式为半保留复制，而引物为单链DNA片段，所以由原来的母链为模板合成的两个新DNA分子中，只含有引物a或引物b，C正确；延伸时的温度为72 ℃左右，所以要用耐高温的DNA聚合酶催化子链合成，D正确。
8.如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法，错误的是( )
A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B．不同基因表达载体的构建方法是不同的
C．图中启动子位于基因的上游，是DNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
解析：选C 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
9．下列有关聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因的叙述，错误的是( )
A．为方便构建重组质粒，在引物中需要适当添加限制酶的切割位点
B．设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，而造成引物自连
C．PCR扩增时，复性所需温度的设定与引物的长度和碱基组成无关
D．PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步
解析：选C 为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制酶的切割位点，A正确；设计引物时需要避免引物之间的碱基互补配对，以防止造成引物自身连接，B正确；复性温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其比例，还有靶基因序列的长度，如果引物中GC含量高，需要设定更高的复性温度，C错误；PCR扩增一般需要经历多个循环，每个循环分为变性、复性和延伸3步，D正确。
10．(2024·湖南高考，改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则。以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为原脱氧核苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述错误的是( )
A．上述PCR反应体系中只加入一种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为T
解析：选B 利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干信息中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C。因此对照个体的测序结果为5′－CTACCCGTGAT－3′，患者的测序结果为5′－CTACCTGTGAT－3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D正确。
二、非选择题
11．某实验小组利用转基因技术培育耐盐水稻，如图1表示含有耐盐基因的外源DNA分子，图2表示质粒，其上含有BamHⅠ、SmaⅠ和HindⅢ三种限制酶的酶切位点。请回答下列问题：
(1)分析上图可知，欲构建重组DNA分子，应选用________________两种限制酶切割质粒和外源DNA分子，使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒的优点是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)题(1)中不使用另外一种限制酶切割的原因是__________________，题(1)中构建成功的重组质粒若用该酶切割能产生________种不同的DNA片段。
(3)质粒中抗性基因的作用是__________________。成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含______(填“氨苄青霉素”或“四环素”)的培养基中进行培养。
(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是__________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)外源DNA和质粒上都含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ和SmaⅠ的识别序列和切割位点，但限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中，因此构建基因表达载体时，应该选用限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA分子；使用两种不同的限制酶切割含目的基因的外源DNA和质粒可防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接。(2)构建成功的重组质粒含有3个限制酶SmaⅠ的识别序列和切割位点，因此若用该酶切割构建成功的重组质粒能产生3种不同的DNA片段。(3)质粒中抗性基因的作用是筛选和鉴定目的基因；构建基因表达载体时，四环素抗性基因被破坏，但氨苄青霉素抗性基因没有被破坏，因此成功导入了目的基因的受体细胞(受体细胞本身不含四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因)，不能在含四环素的培养基中进行培养。(4)从个体水平上鉴定耐盐基因是否成功表达的方法是将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长。
答案：(1)BamHⅠ和HindⅢ 防止质粒和目的基因的自身环化及质粒与目的基因的反向连接 (2)SmaⅠ会破坏目的基因 3 (3)筛选和鉴定目的基因 四环素 (4)将转基因水稻置于盐碱地中培育(或用一定浓度的盐水浇灌转基因水稻)，观察其能否正常生长
12．(2023·全国乙卷)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。丰富了荧光蛋白的颜色种类。回答下列问题。
(1)构建突变基因文库。科研人员将GFP基因的不同突变基因分别插入载体，并转入大肠杆菌制备出GFP基因的突变基因文库。通常，基因文库是指________________________
________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)构建目的基因表达载体。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如下所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为______，其作用是__________________________________；图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是________________________________________________
______________________。
(3)目的基因的表达。科研人员将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是_______________________(答出1点即可)。
(4)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。(2)一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。(3)结合题中信息可知，将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现有的大肠杆菌发绿色荧光，即GFP蛋白的荧光颜色，推测发绿色荧光的可能原因是GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同。(4)欲通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，可通过基因工程的方法将目的基因导入酵母菌，之后检测酵母菌是否发黄色荧光，如果发黄色荧光，则可证明YFP基因能在真核细胞中表达，实验思路见答案。
答案：(1)将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因 (2)终止子 启动子 被RNA聚合酶识别并结合，驱动GFP突变基因的转录 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来 (3)密码子具有简并性，GFP基因突变后编码的蛋白质与突变前相同 (4)选择合适的载体，利用合适的限制酶和DNA连接酶将YFP基因和载体连接起来，构建基因表达载体，之后将基因表达载体导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光
13．(2024·全国新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是______________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是__________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是______________________________________(答出2点即可)。
解析：(1)限制酶(限制性内切核酸酶)能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。N基因表达需要RNA聚合酶与启动子结合启动转录，还需要终止子终止转录，在题述对应位置插入M1与M2片段，可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子在插入B1的基因组时被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA中存在碱基A、G、C、U，而B1基因组DNA中存在碱基A、G、C、T，RNA与DNA互补配对时也遵循碱基互补配对原则，可以形成的碱基对有G—C、C—G、A—T和U—A。(3)根据题意，为验证片段甲是否插入了细菌B1基因组中，应该以菌株B2的基因组DNA为模板进行PCR。该模板没有引物P4的结合位置，若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是无法扩增出目的产物。(4)解析略。
答案：(1)磷酸二酯键 可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达
(2)C—G、A—T、U—A (3)菌株B2基因组DNA 无法扩增出目的产物 (4)减少环境污染；实现废物利用(合理即可)