3.2 基因工程的基本操作程序（第2课时）（共34张PPT）2024-2025学年人教版高中生物学选择性必修3

(共34张PPT)
第2节 基因工程的
基本操作程序
第2课时
说出基因表达载体的结构及构建过程。
能简述将目的基因导入不同受体细胞的方法。
能阐明从分子水平和个体水平检测目的基因的方法。
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
利用PCR获取和扩增
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（DNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
PCR扩增目的基因的过程
能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
不能。
构建基因表达载体（核心工作）
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因（不能稳定遗传）。
思考
1.构建基因表达载体的目的：
思考：各个元件有什么作用？
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
一、基因表达载体的构建——核心步骤
2.基因表达载体的组成
02
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
必须插到启动子和终止子之间
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的下游
功能：终止转录
四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
启动子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
③再利用 将含目的基因的DNA片段拼接到 的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子（基因表达载体）。
目的基因
限制酶切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
①首先用一定的 切割载体（质粒），使它出现一个切口。
②然后用 限制酶或能产生 末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
限制酶
同种
相同
DNA连接酶
载体
目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。
3.基因表达载体的构建过程
思考：使用一种DNA限制酶进行切割（单酶切），是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割（双酶切），防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。
思考·讨论
用什么限制酶切割最合适？
双酶切，防止环化
(1)不破坏目的基因原则：
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：
图甲中可选择PstⅠ，或者PstⅠ和EcoRI;而不选择SmaⅠ。
质粒作为载体必须具备标记基因，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
PstⅠ和EcoRI
目的基因
基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
1.基因工程中的基因表达载体≠载体：
基因表达载体与载体相比增加了 。
2.目的基因插入位点不是随意的：
注意事项
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
思 考
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不完全相同。
常用方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
二、将目的基因导入受体细胞
含目的基因的DNA 溶液
——花粉管通道法
1.目的基因导入植物细胞
①用_____________将______________________直接注入______中；
微量注射器
含目的基因的DNA溶液
子房
② 在植物受粉后的一定时间内，剪去______，将____________滴加在___________上，使目的基因借助_____________进入_______。
柱头
DNA溶液
花柱切面
花粉管通道
胚囊
——花粉管通道法
1.目的基因导入植物细胞
简便经济，但要求花朵较大
受体细胞：
受精卵
转化：
实质是基因重组。
——农杆菌转化法
1.目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌特点
a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数_____________没有侵染能力；
双子叶植物
裸子植物
单子叶植物
b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（_______________）转移到被侵染的细胞，并且将其_______________________________。
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
可转移的DNA
整合到该细胞的染色体DNA上
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
表现出新性状的植株
植物组织培养
第一次导入
第二次导入
第一次拼接
第二次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
Ti质粒
T—DNA
目的基因
构建基因表达载体
重组
Ti质粒
转入农杆菌
导入植物细胞
（2）农杆菌转化法的过程
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。
思考1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
思考2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养。
2.将目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
原因：①体积大，易操作；
②易表现出全能性。
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
病毒侵染法
注射器
受精卵
固定吸管
原核细胞（常选择大肠杆菌）
（1）受体细胞：
（2）常用方法：
Ca2+处理
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
感受态细胞
吸收
3.目的基因导入微生物细胞
繁殖快
单细胞
遗传物质少
易培养
大肠杆菌
感受态细胞
Ca2+
混合
表达载体
缓冲液
溶于
吸收DNA，完成转化
(3)应用实例：
利用转基因大肠杆菌生产药物
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性（原核细胞中没有高尔基体和内质网等），需要在体外进行再加工。
转录
翻译
加工
思考：如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
一般不能产生原来的蛋白质。
原因：
①原核生物细胞里没有相应的机制来去除内含子；
②原核生物没有真核的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
相应机制剪切内含子
转录出来的序列
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 构建目的基因表达载体→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→感受态→导入基因表达载体
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
思考
分子水平
（抗原—抗体杂交）
三、目的基因的检测与鉴定
个体水平
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
1.检测目的基因是否导入受体细胞
2.检测目的基因是否转录
（PCR等技术检测）
3.检测目的基因是否翻译
（PCR等技术检测）
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
如：检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
(1)通过PCR等技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
(是否扩增出目的基因)
（一）分子水平的检测
M：marker；1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
1.检测目的基因是否导入受体细胞
（2）DNA分子杂交技术
碱基互补配对
原理
探针
目的基因
带标记的基因探针（可以是DNA或RNA），与目的基因DNA单链在一定条件下互补配对，结合成双链，从而出现杂交带。
① 首先取出转基因生物的基因组DNA。
② 将含目的基因的DNA片段用放射性同位素（荧光分子或化学发光催化
剂）等作标记，以此做探针。
③ 使探针和转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明目的基因
已插入染色体DNA中。
基因探针：一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸
序列。可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA，
探针的长度可以包括整个基因，或基因的一部分。
（2）DNA分子杂交技术
2.检测目的基因是否转录
（1）RT-PCR扩增
转基因生物
提取RNA
RNA作为模板
逆转录
cDNA
PCR操作、电泳
是否扩增出目的基因
（2）RNA分子杂交技术
——通过抗原-抗体杂交检测
3.检测目的基因是否翻译
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
杂交
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
——检测目的基因是否表现出相应的性状
如：检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
（二）个体水平的检测
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
个体水平检测：抗性以及抗性程度
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
利用PCR获取和扩增
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物);
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。