微专题3 双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法与CRISPR/Cas9基因编辑技术
题型1 利用双标记基因和影印接种技术筛选含有目的基因的受体细胞
大肠杆菌pBR322质粒含有标记基因：氨苄青霉素抗性基因(ampr)和四环素抗性基因(tetr)，外源DNA插在BamH Ⅰ位点处。将细菌涂布在含有氨苄青霉素(amp)的固体平板上进行第一轮筛选，未转化的则不能生长，转化成功的能长出菌落。上述转化成功的受体细胞有两种类型，即含重组质粒的细胞和含空载质粒的细胞。为了进一步区分这两类受体细胞，需要采用图示的方法进行第二轮筛选，由于外源DNA片段在BamH Ⅰ位点的重组导致质粒的tetr基因失活，含重组质粒的受体细胞呈amprtets表型(上标“r”代表抗性，“s”代表敏感)；而含空载质粒的受体细胞则为amprtetr表型。因此，含重组质粒的受体细胞只能在amp平板上生长，含空载质粒的受体细胞可出现在同时含amp和tet的平板上。
例1 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌， 之后受体细胞的类型(对两种抗生素表现出抗性r或敏感性s)不包含( )
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
例2 某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制性内切核酸酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是__________；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为____________。该方法中农杆菌的作用是_______________________________________________
_______________________________________________________________。
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？________(填“是”或“否”)。为什么？__________________________________。
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
题型2 利用蓝白斑显色法筛选含有目的基因的受体细胞
很多大肠杆菌的质粒上含有LacZ标记基因，其表达的β－半乳糖苷酶可将一种无色的化合物(X－gal)分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带ampr和LacZ两个标记基因，外源DNA插在LacZ标记基因内部的任何限制酶切割位点处。将细菌涂布在同时含有amp和X－gal的固体培养基上，在长出来的菌落中，蓝色菌落的为含空载质粒的受体细胞，白色菌落的为含重组质粒的受体细胞。
例3 (2024·衢州质检)非洲猪瘟病毒可对养猪业构成严重威胁，该病毒是一种双链DNA病毒，可编码多种蛋白质。非洲猪瘟病毒表面的主要结构蛋白p22蛋白，可以诱导猪产生抗体。工业上可利用转基因技术生产p22蛋白疫苗，并制备相应的单克隆抗体。请回答下列有关问题：
(1)p22蛋白疫苗的制备和鉴定，与p22蛋白基因及质粒有关的限制酶酶切位点如下图所示，已知不同种限制酶切割出的黏性末端不同。
(LacZ基因能表达出β－半乳糖苷酶，使无色的半乳糖苷分解，进而使菌落呈现蓝色)
①根据p22蛋白基因的序列设计一对引物，通过________技术扩增特定的DNA以获取目的基因；②构建重组DNA，利用________________限制酶(写出酶的名称)分别切割目的基因和质粒，以减少连接产物的种类并避免目的基因与质粒反向连接；③用重组质粒转化感受态细胞，并将受体细胞涂布在含氨苄青霉素的LB固体平板上，在37 ℃恒温培养箱培养12 h，挑取________的单菌落，将其转移至液体培养基扩大培养，一段时间后离心收集细胞，超声破碎后离心取上清液制备样品，利用________的方法对p22蛋白进行鉴定。
(2)抗p22蛋白的单克隆抗体制备及鉴定，p22蛋白可作为________对小鼠进行多次注射后，分离出小鼠脾细胞，利用________的仙台病毒促进该细胞与体外培养的骨髓瘤细胞融合；融合细胞经过多次筛选后得到的杂交瘤细胞具有的特点是____________________________________________________________；
将选出的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，待小鼠腹部膨胀明显，采集________，分离提取出单克隆抗体。
题型3 基因魔剪——CRISPR/Cas9基因编辑技术
例4 近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(见下图)。下列相关叙述错误的是( )
A.Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，作用是破坏磷酸二酯键
B.向导RNA与基因形成的双链区也要遵循碱基互补配对原则
C.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
D.若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为5′－UCCACAAUC－3′
例5 基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9有“基因魔剪”的美称，它的实质是用特殊的引导序列sgRNA将“基因剪刀——Cas9酶”精准定位到所需修饰的基因上然后进行编辑。2018年11月，一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿的诞生引发了国内外巨大的争议。
(1)有些细胞中没有编码Cas9酶的基因，可利用基因工程的方法构建____________，通过________等载体导入细胞。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列通过________可以彼此结合在一起，而Cas9酶是一种____________酶，可催化______键水解，实现对DNA序列的定向切割。
(2)露露和娜娜被编辑的基因是CCR5基因，为验证胚胎的CCR5基因是否成功被编辑，需要在胚胎发育早期，将细胞的微量全基因组DNA用________技术进行扩增，然后采用________技术检测目的基因以及转录出的mRNA是否存在，还需要对________蛋白进行检测。
微专题3 双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法
与CRISPR/Cas9基因编辑技术
例1 C [含有质粒载体的大肠杆菌中，有两种抗性，即ampr、tetr ，A不符合题意；含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌，有氨苄青霉素抗性，但没有四环素抗性，即ampr、tets，B不符合题意；不存在有四环素抗性、氨苄青霉素敏感性的类型，C符合题意；含有环状目的基因的大肠杆菌，没有抗性，即amps、tets，D不符合题意。]
例2 (1)Ti质粒 T DNA 感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)防止目的基因和质粒自身环化，防止目的基因与质粒反向连接
(3)否 含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏
(4)
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例3 (1)PCR HindⅢ和BamH Ⅰ 白色 抗原－抗体杂交
(2)抗原 灭活 能无限增殖且产生大量特异性抗体 腹水
解析 (1)PCR技术是体外扩增DNA的技术，可以得到大量的DNA；结合图示可知，利用HindⅢ和BamH Ⅰ对质粒和目的基因进行切割，可以防止质粒及目的基因自身环化以及质粒与目的基因反向连接。重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，在含氨苄青霉素的LB固体平板上含重组质粒的菌株和含普通质粒的菌株都可以生长，由于重组质粒的LacZ基因被破坏，菌落呈白色，因此在含氨苄青霉素的LB固体平板上挑选白色菌落即为含重组质粒的目的菌株；抗原－抗体杂交可以对p22蛋白进行鉴定，即若p22蛋白基因成功表达，则抗原－抗体杂交呈阳性。(2)要制备抗p22蛋白的单克隆抗体，可将p22蛋白作为抗原，灭活的仙台病毒可以促进动物细胞的融合；多次筛选得到的杂交瘤细胞，既能无限增殖，又能产生大量特异性抗体；小鼠腹腔可以对杂交瘤细胞进行体内克隆，待小鼠腹部膨胀明显，采集腹水，分离提取出单克隆抗体。
例4 C [核糖体是蛋白质合成的场所，因此Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，作用是破坏磷酸二酯键，A正确；向导RNA与基因形成的双链区碱基对之间遵循碱基互补配对原则，B正确；向导RNA通过转录形成，需要RNA聚合酶的催化，而逆转录酶催化以RNA为模板合成DNA的过程，C错误；由于目标DNA中的α链可与向导RNA中的识别序列的互补链进行碱基互补配对，因此若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为5′－UCCACAAUC－3′，D正确。]
例5 (1)重组DNA分子 质粒、动植物病毒及噬菌体 碱基互补配对 限制(限制性内切核酸) 磷酸二酯
(2)PCR 核酸分子杂交 CCR5
解析 (1)基因工程步骤的核心是构建重组DNA分子。载体有质粒、动植物病毒及噬菌体等。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对可以彼此结合在一起。Cas9酶是一种限制酶(限制性内切核酸酶)，作用部位为磷酸二酯键。(2)将细胞的微量全基因组DNA用PCR技术进行扩增，以增加CCR5基因的数量。检测目的基因以及转录出的mRNA是否存在采用核酸分子杂交技术。实验的目的是为了验证胚胎的CCR5基因是否成功被编辑，因此还需要对CCR5蛋白进行检测。(共21张PPT)
微专题3
双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法与CRISPR/Cas9基因编辑技术
题型1 利用双标记基因和影印接种技术筛选含有目的基因的受体细胞
大肠杆菌pBR322质粒含有标记基因：氨苄青霉素抗性基因(ampr)和四环素抗性基因(tetr)，外源DNA插在BamH Ⅰ位点处。将细菌涂布在含有氨苄青霉素(amp)的固体平板上进行第一轮筛选，未转化的则不能生长，转化成功的能长出菌落。上述转化成功的受体细胞有两种类型，即含重组质粒的细胞和含空载质粒的细胞。为了进一步区分这两类受体细胞，需要采用图示的方法进行第二轮筛选，由于外源DNA片段在BamH Ⅰ位点的重组导致质粒的tetr基因失活，含重组质粒的受体细胞呈amprtets表型(上标“r”代表抗性，“s”代表敏感)；而含空载质粒的受体细胞则为amprtetr表型。因此，含重组质粒的受体细胞只能在amp平板上生长，含空载质粒的受体细胞可出现在同时含amp和tet的平板上。
例1 某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到ampr或tetr中会导致相应的基因失活(ampr表示氨苄青霉素抗性基因，tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌， 之后受体细胞的类型(对两种抗生素表现出抗性r或敏感性s)不包含( )
C
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
解析：含有质粒载体的大肠杆菌中，有两种抗性，即ampr、tetr ，A不符合题意；
含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌，有氨苄青霉素抗性，但没有四环素抗性，即ampr、tets，B不符合题意；
不存在有四环素抗性、氨苄青霉素敏感性的类型，C符合题意；
含有环状目的基因的大肠杆菌，没有抗性，即amps、tets，D不符合题意。
A.ampr、tetr B.ampr、tets
C.amps、tetr D.amps、tets
例2 某质粒上有Sal Ⅰ、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ三种限制性内切核酸酶切割位点，同时还含有四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请回答下列问题：
(1)将目的基因导入植物细胞，采用最多的方法是农杆菌转化法。其中用到的质粒是 ；该质粒含有一段特殊的DNA片段，称为 。该方法中农杆菌的作用是________________________________________________
________________________________________________________________。
Ti质粒
T- DNA
感染烟草细胞，把目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
(2)在构建重组质粒时，和只用一种酶切割目的基因的两端及质粒相比，选用Hind Ⅲ和Sal Ⅰ两种酶的好处是_______________________________________
_______________________________________________________________。
(3)含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖，农杆菌中是否已含有目的基因？ (填“是”或“否”)。为什么？_________________________________________。
防止目的基因和质粒自身环化，防止目的
基因与质粒反向连接
否
含有目的基因的质粒中四环素抗性基因被破坏
(4)将已经转化的农杆菌进行如下操作，筛选出符合要求的农杆菌。先把转化的农杆菌接种到A培养基中培养，长出菌落后，用无菌牙签挑取A上的单个菌落，分别接种到B(含氨苄青霉素)和C(含四环素和氨苄青霉素)两个培养基的相同位置上，一段时间后，菌落的生长状况如图所示。含目的基因的菌落位于B或C上的哪些菌落中？请在图中相应的位置上圈出来。
题型2 利用蓝白斑显色法筛选含有目的基因的受体细胞
很多大肠杆菌的质粒上含有LacZ标记基因，其表达的β－半乳糖苷酶可将一种无色的化合物(X－gal)分解成蓝色物质，使菌落呈现蓝色。重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带ampr和LacZ两个标记基因，外源DNA插在LacZ标记基因内部的任何限制酶切割位点处。将细菌涂布在同时含有amp和X－gal的固体培养基上，在长出来的菌落中，蓝色菌落的为含空载质粒的受体细胞，白色菌落的为含重组质粒的受体细胞。
例3 (2024·衢州质检)非洲猪瘟病毒可对养猪业构成严重威胁，该病毒是一种双链DNA病毒，可编码多种蛋白质。非洲猪瘟病毒表面的主要结构蛋白p22蛋白，可以诱导猪产生抗体。工业上可利用转基因技术生产p22蛋白疫苗，并制备相应的单克隆抗体。请回答下列有关问题：
(1)p22蛋白疫苗的制备和鉴定，与p22蛋白基因及质粒有关的限制酶酶切位点如下图所示，已知不同种限制酶切割出的黏性末端不同。
(LacZ基因能表达出β－半乳糖苷酶，使无色的半乳糖苷分解，进而使菌落呈现蓝色)
①根据p22蛋白基因的序列设计一对引物，通过 技术扩增特定的DNA以获取目的基因；②构建重组DNA，利用 限制酶(写出酶的名称)分别切割目的基因和质粒，以减少连接产物的种类并避免目的基因与质粒反向连接；③用重组质粒转化感受态细胞，并将受体细胞涂布在含氨苄青霉素的LB固体平板上，在37 ℃恒温培养箱培养12 h，挑取 的单菌落，将其转移至液体培养基扩大培养，一段时间后离心收集细胞，超声破碎后离心取上清液制备样品，利用 的方法对p22蛋白进行鉴定。
PCR
HindⅢ和BamH Ⅰ
白色
抗原－抗体杂交
(2)抗p22蛋白的单克隆抗体制备及鉴定，p22蛋白可作为 对小鼠进行多次注射后，分离出小鼠脾细胞，利用 的仙台病毒促进该细胞与体外培养的骨髓瘤细胞融合；融合细胞经过多次筛选后得到的杂交瘤细胞具有的特点是__________________________________________________________________；
将选出的杂交瘤细胞接种至小鼠腹腔，待小鼠腹部膨胀明显，采集 ，分离提取出单克隆抗体。
抗原
灭活
能无限增殖且产生大量特异性抗体
腹水
解析：(1)PCR技术是体外扩增DNA的技术，可以得到大量的DNA；结合图示可知，利用HindⅢ和BamH Ⅰ对质粒和目的基因进行切割，可以防止质粒及目的基因自身环化以及质粒与目的基因反向连接。重组质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，在含氨苄青霉素的LB固体平板上含重组质粒的菌株和含普通质粒的菌株都可以生长，由于重组质粒的LacZ基因被破坏，菌落呈白色，因此在含氨苄青霉素的LB固体平板上挑选白色菌落即为含重组质粒的目的菌株；抗原－抗体杂交可以对p22蛋白进行鉴定，即若p22蛋白基因成功表达，则抗原－抗体杂交呈阳性。
(2)要制备抗p22蛋白的单克隆抗体，可将p22蛋白作为抗原，灭活的仙台病毒可以促进动物细胞的融合；多次筛选得到的杂交瘤细胞，既能无限增殖，又能产生大量特异性抗体；小鼠腹腔可以对杂交瘤细胞进行体内克隆，待小鼠腹部膨胀明显，采集腹水，分离提取出单克隆抗体。
题型3 基因魔剪——CRISPR/Cas9基因编辑技术
例4 近年诞生的具有划时代意义的CRISPR/Cas9基因编辑技术可简单、准确地进行基因定点编辑。其原理是由一条单链向导RNA引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割(见下图)。下列相关叙述错误的是( )
C
A.Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，
作用是破坏磷酸二酯键
B.向导RNA与基因形成的双链区也要遵循碱
基互补配对原则
C.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
D.若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为
5′－UCCACAAUC－3′
解析：核糖体是蛋白质合成的场所，因此Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，作用是破坏磷酸二酯键，A正确；
向导RNA与基因形成的双链区碱基对之间遵循碱基互补配对原则，B正确；
向导RNA通过转录形成，需要RNA聚合酶的催化，而逆转录酶催化以RNA为模板合成DNA的过程，C错误；
由于目标DNA中的α链可与向导RNA中的识别序列的互补链进行碱基互补配对，因此若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为5′－UCCACAAUC－3′，D正确。
A.Cas9蛋白由相应基因指导在核糖体中合成，作用是破坏磷酸二酯键
B.向导RNA与基因形成的双链区也要遵循碱基互补配对原则
C.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
D.若α链剪切点附近序列为5′－TCCACAATC－3′，则相应的识别序列为5′－UCCACAAUC－3′
例5 基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。新一代基因编辑技术CRISPR/Cas9有“基因魔剪”的美称，它的实质是用特殊的引导序列sgRNA将“基因剪刀——Cas9酶”精准定位到所需修饰的基因上然后进行编辑。2018年11月，一对名为露露和娜娜的基因编辑婴儿的诞生引发了国内外巨大的争议。
(1)有些细胞中没有编码Cas9酶的基因，可利用基因工程的方法构建 ，通过 等载体导入细胞。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列通过
可以彼此结合在一起，而Cas9酶是一种 酶，可催化 键水解，实现对DNA序列的定向切割。
重组DNA分子
质粒、动植物病毒及噬菌体
碱基互补配对
限制(限制性内切核酸)
磷酸二酯
(2)露露和娜娜被编辑的基因是CCR5基因，为验证胚胎的CCR5基因是否成功被编辑，需要在胚胎发育早期，将细胞的微量全基因组DNA用 技术进行扩增，然后采用 技术检测目的基因以及转录出的mRNA是否存在，还需要对 蛋白进行检测。
PCR
核酸分子杂交
CCR5
解析：(1)基因工程步骤的核心是构建重组DNA分子。载体有质粒、动植物病毒及噬菌体等。CRISPR/Cas9中sgRNA分子的序列与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对可以彼此结合在一起。Cas9酶是一种限制酶(限制性内切核酸酶)，作用部位为磷酸二酯键。
(2)将细胞的微量全基因组DNA用PCR技术进行扩增，以增加CCR5基因的数量。检测目的基因以及转录出的mRNA是否存在采用核酸分子杂交技术。实验的目的是为了验证胚胎的CCR5基因是否成功被编辑，因此还需要对CCR5蛋白进行检测。专题特训3 双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法与CRISPR/Cas9基因编辑技术
(时间：30分钟分值：32分)
选择题：第1～8题，每小题4分，共32分。
题型1 利用双标记基因和影印接种技术筛选含有目的基因的受体细胞
1.如图表示某种质粒，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示不同限制性内切核酸酶的酶切位点。为了便于筛选，目的基因合适的插入位点是( )
① ②
③ ①和③
2.图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性内切核酸酶EcoR Ⅴ的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是( )
甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒
乙类菌落扩大培养后可用于生产
丙类菌落可能导入了含反向连接目的基因的质粒
用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上
3.下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。转化大肠杆菌后，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C、D四种菌落，其生长情况如下表(注：“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，含有重组质粒的菌落是( )
平板类型 菌落类型 无抗生素 氨苄青霉素 四环素 氨苄青霉素＋四环素
菌落A ＋ ＋ ＋ ＋
菌落B ＋ ＋ － －
菌落C ＋ － － －
菌落D ＋ － ＋ －
菌落A 菌落B
菌落C 菌落D
题型2 利用蓝白斑显色法筛选含有目的基因的受体细胞
4.大肠杆菌的质粒上含有LacZ基因，其编码的产物β半乳糖苷酶在Xgal和IPTG同时存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。如图为利用该质粒进行的转基因过程，请据图判断菌落①②③的颜色分别是( )
蓝色 白色 白色 蓝色 蓝色 白色
蓝色 白色 蓝色 白色 蓝色 白色
5.大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于LacZ基因中。在特定的选择培养基中，若LacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若LacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的说法正确的是( )
试管1中应加入限制酶处理
试管2中用Ca2＋处理，将重组载体导入不含LacZ基因的大肠杆菌中
若大肠杆菌的菌落为蓝色，则质粒未导入大肠杆菌
培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量卡那霉素
题型3 CRISPR/Cas9基因编辑技术
6.CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(SgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是( )
SgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
若要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从目标DNA分子上去除，通常需设计两个序列不同的SgRNA
CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA序列越短，脱靶率越低
向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
7.2020年诺贝尔化学奖授予了两位女科学家以表彰她们在基因编辑研究领域做出的卓越贡献。这两位科学家巧用CRISPR/Cas9基因剪刀，以极高的精度编辑了动物、植物和微生物的DNA，CRISPR/Cas9基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是( )
Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶
DNARNA杂交区域不存在TA碱基对
在单链向导RNA中也存在碱基互补配对
人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割
8.CRISPR/Cas9是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒(DNA)及外源DNA，其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可以对目标DNA上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA片段，如图所示。下列叙述错误的是( )
识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同
在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶
大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒(DNA)及外源DNA互补的RNA序列
Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子
专题特训3 双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法与
CRISPR/Cas9基因编辑技术
1．B [由题意可知，为了方便筛选，可以把目的基因插入到质粒的某个特殊基因中，因此排除③，又因为ori是复制的必需基因，因此排除①，可以选择ampr和tetr作为插入基因的位置，B正确。]
2．A [根据题图分析可知，甲类菌落既具有氨苄青霉素抗性，又具有四环素抗性，其可能同时转入了P0和P1质粒，也可能只转入了P0质粒，A正确；乙类菌落不具有四环素抗性，但具有氨苄青霉素抗性，其可能转入了P1质粒，但还需要进一步的鉴定，例如抗原－抗体杂交后，才能进行扩大培养用于生产，B错误；丙类菌落既不具有四环素抗性，也不具有氨苄青霉素抗性，说明其不含质粒，C错误；应该用接种环将菌落接种到其他平板上，D错误。]
3．B [分析题图可知：构建重组DNA分子时，目的基因插入的位置在四环素抗性基因(tetr)中间，破坏了四环素抗性基因(tetr)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)没有被破坏。因此含有重组质粒的菌落在添加了四环素的培养基中不能生长，而在添加氨苄青霉素的培养基中能生长，故选B。]
4．B
5．B [试管1中应加入DNA连接酶处理，A错误；试管2中用Ca2＋处理，使大肠杆菌成为感受态细胞，这样可将重组载体导入不含LacZ基因的大肠杆菌中，B正确；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，C错误；由题干信息可知，标记基因是氨苄青霉素抗性基因，因此培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量氨苄青霉素，D错误。]
6．B [由图可知，SgRNA可通过与特定基因位点的碱基互补配对，来引导Cas9蛋白到该位点进行切割，即SgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，而Cas9蛋白的功能与限制酶相似，A错误；CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA的序列越短，可识别的DNA上的特定碱基序列越短，越容易发生“脱靶”现象，即脱靶率越高，C错误；向导RNA是以DNA的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA聚合酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸，D错误。]
7．B [分析题意可知，Cas9蛋白功能类似于基因工程中限制酶的作用，Cas9能够切割DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A正确；DNA分子的碱基组成是A、T、G、C，RNA的碱基组成是A、U、G、C，故DNA－RNA杂交区域存在T－A碱基对，B错误；据图可知，向导RNA有折叠成双链的片段，故在单链向导RNA分子中也存在碱基互补配对，C正确；向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，所以人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割，D正确。]
8．D [识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同，都是A—U、T—A、C—G、G—C，A正确；在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶将DNA片段连接起来，B正确；Cas9能特异性的切断目标DNA分子中脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。](共18张PPT)
专题特训3
双标记基因、影印接种、蓝白斑显色法与CRISPR/Cas9基因编辑技术
(时间：30分钟 满分：32分)
B
题型1 利用双标记基因和影印接种技术筛选含有目的基因的受体细胞
1.如图表示某种质粒，其中ori为复制必需的序列，ampr为氨苄青霉素抗性基因，tetr为四环素抗性基因，箭头表示不同限制性内切核酸酶的酶切位点。为了便于筛选，目的基因合适的插入位点是( )
01
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类题
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06
07
08
A.① B.②
C.③ D.①和③
解析：由题意可知，为了方便筛选，可以把目的基因插入到质粒的某个特殊基因中，因此排除③，又因为ori是复制的必需基因，因此排除①，可以选择ampr和tetr作为插入基因的位置，B正确。
2.图1表示某重组质粒的构建过程，质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)，并且含有限制性内切核酸酶EcoR Ⅴ的酶切位点。为筛选出含有重组质粒P1的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到甲、乙、丙三类菌落，三类菌落形态相同，其生长情况如图2。下列叙述正确的是( )
A
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类题
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07
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A.甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒
B.乙类菌落扩大培养后可用于生产
C.丙类菌落可能导入了含反向连接目的基因的质粒
D.用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上
解析：根据题图分析可知，甲类菌落既具有氨苄青霉素抗性，又具有四环素抗性，其可能同时转入了P0和P1质粒，也可能只转入了P0质粒，A正确；
乙类菌落不具有四环素抗性，但具有氨苄青霉素抗性，其可能转入了P1质粒，但还需要进一步的鉴定，例如抗原－抗体杂交后，才能进行扩大培养用于生产，B错误；
丙类菌落既不具有四环素抗性，也不具有氨苄青霉素抗性，说明其不含质粒，C错误；
应该用接种环将菌落接种到其他平板上，D错误。
A.甲类菌落可能同时导入了P0和P1质粒
B.乙类菌落扩大培养后可用于生产
C.丙类菌落可能导入了含反向连接目的基因的质粒
D.用玻璃刮刀将无抗生素平板上的菌落按位置接种到其他三个平板上
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02
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类题
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3.下图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。转化大肠杆菌后，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C、D四种菌落，其生长情况如下表(注：“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，含有重组质粒的菌落是( )
B
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类题
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平板类型 菌落类型 无抗生素 氨苄青霉素 四环素 氨苄青霉素＋四环素
菌落A ＋ ＋ ＋ ＋
菌落B ＋ ＋ － －
菌落C ＋ － － －
菌落D ＋ － ＋ －
A.菌落A B.菌落B
C.菌落C D.菌落D
解析：分析题图可知：构建重组DNA分子时，目的基因插入的位置在四环素抗性基因(tetr)中间，破坏了四环素抗性基因(tetr)，氨苄青霉素抗性基因(ampr)没有被破坏。因此含有重组质粒的菌落在添加了四环素的培养基中不能生长，而在添加氨苄青霉素的培养基中能生长，故选B。
A.菌落A B.菌落B
C.菌落C D.菌落D
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类题
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08
●某科研小组利用质粒(图甲)和目的基因(图乙)构建重组DNA分子。下列分析错误的是( )
C
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03
类题
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07
08
A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
解析：限制酶HindⅢ和PstⅠ在质粒上各有一个识别切割位点，用HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段，A正确；
AluⅠ的识别、切割位点位于目的基因中，用AluⅠ酶切割外源DNA会破坏目的基因，B正确；
选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA，质粒中的两个标记基因均会被破坏，C错误；
选择HindⅢ和PstⅠ同时切割质粒和外源DNA，会破坏质粒中的氯霉素抗性基因，保留四环素抗性基因，所以导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长，D正确。
A.用限制酶HindⅢ和PstⅠ切割质粒，可得到2条DNA片段
B.不能用AluⅠ酶切割质粒和外源DNA的原因是AluⅠ酶会破坏目的基因
C.构建重组DNA时，需选择SmaⅠ酶和PstⅠ酶同时切割质粒和外源DNA
D.导入了重组DNA的细菌能在含四环素的培养基上生长而不能在含氯霉素的培养基上生长
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类题
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题型2 利用蓝白斑显色法筛选含有目的基因的受体细胞
4.大肠杆菌的质粒上含有LacZ基因，其编码的产物β－半乳糖苷酶在X－gal和IPTG同时存在时，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色。如图为利用该质粒进行的转基因过程，请据图判断菌落①②③的颜色分别是( )
B
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类题
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A.蓝色 白色 白色
B.蓝色 蓝色 白色
C.蓝色 白色 蓝色
D.白色 蓝色 白色
5.大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于LacZ基因中。在特定的选择培养基中，若LacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若LacZ基因被破坏，则菌落呈白色。关于图中操作的说法正确的是( )
B
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03
类题
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07
08
A.试管1中应加入限制酶处理
B.试管2中用Ca2＋处理，将重组载体
导入不含LacZ基因的大肠杆菌中
C.若大肠杆菌的菌落为蓝色，则质粒
未导入大肠杆菌
D.培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量卡那霉素
解析：试管1中应加入DNA连接酶处理，A错误；
试管2中用Ca2＋处理，使大肠杆菌成为感受态细胞，这样可将重组载体导入不含LacZ基因的大肠杆菌中，B正确；
若大肠杆菌的菌落为蓝色，则导入大肠杆菌的是普通质粒，C错误；
由题干信息可知，标记基因是氨苄青霉素抗性基因，因此培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量氨苄青霉素，D错误。
A.试管1中应加入限制酶处理
B.试管2中用Ca2＋处理，将重组载体导入不含LacZ基因的大肠杆菌中
C.若大肠杆菌的菌落为蓝色，则质粒未导入大肠杆菌
D.培养基中除必需的营养物质外，还应加入适量卡那霉素
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类题
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题型3 CRISPR/Cas9基因编辑技术
6.CRISPR/Cas9系统主要由向导RNA(SgRNA)和Cas9蛋白两部分组成，SgRNA可引导Cas9蛋白到特定基因位点进行切割，其机制如图所示。下列说法正确的是( )
B
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类题
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A.SgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA
分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
B.若要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从目标
DNA分子上去除，通常需设计两个序列不同的SgRNA
C.CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA序列越短，脱靶率越低
D.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
解析：由图可知，SgRNA可通过与特定基因位点的碱基互补配对，来引导Cas9蛋白到该位点进行切割，即SgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，而Cas9蛋白的功能与限制酶相似，A错误；
CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，SgRNA的序列越短，可识别的DNA上的特定碱基序列越短，越容易发生“脱靶”现象，即脱靶率越高，C错误；
向导RNA是以DNA的一条链为模板通过转录形成的，可以在RNA聚合酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸，D错误。
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类题
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A.SgRNA通过碱基互补配对原则识别目标DNA分子，Cas9蛋白的功能与DNA连接酶相似
B.若要利用CRISPR/Cas9技术将一个基因从目标DNA分子上去除，通常需设计两个序列不同的SgRNA
C.CRISPR/Cas9技术编辑基因有时会因SgRNA错误结合而出现“脱靶”现象，一般SgRNA序列越短，脱靶率越低
D.向导RNA可以在逆转录酶的催化下合成，合成的原料包括四种核糖核苷酸
7.2020年诺贝尔化学奖授予了两位女科学家以表彰她们在基因编辑研究领域做出的卓越贡献。这两位科学家巧用CRISPR/Cas9基因剪刀，以极高的精度编辑了动物、植物和微生物的DNA，CRISPR/Cas9基因组编辑系统工作原理如图所示，关于此技术的解释错误的是( )
B
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类题
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A.Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶
B.DNA－RNA杂交区域不存在T－A碱基对
C.在单链向导RNA中也存在碱基互补配对
D.人为改变向导RNA的序列可实现对特定
基因的切割
解析：分析题意可知，Cas9蛋白功能类似于基因工程中限制酶的作用，Cas9能够切割DNA，是一种能使磷酸二酯键断裂的酶，A正确；
DNA分子的碱基组成是A、T、G、C，RNA的碱基组成是A、U、G、C，故DNA－RNA杂交区域存在T－A碱基对，B错误；
据图可知，向导RNA有折叠成双链的片段，故在单链向导RNA分子中也存在碱基互补配对，C正确；
向导RNA能识别并结合特定的DNA序列，所以人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割，D正确。
A.Cas9为一种能使磷酸二酯键断裂的酶
B.DNA－RNA杂交区域不存在T－A碱基对
C.在单链向导RNA中也存在碱基互补配对
D.人为改变向导RNA的序列可实现对特定基因的切割
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8.CRISPR/Cas9是大肠杆菌等细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的部分病毒(DNA)及外源DNA，其原理是由一条单链向导RNA引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割。CRISPR/Cas9基因编辑技术是通过设计向导RNA中20个碱基的识别序列，可以对目标DNA上几乎任何一个位置进行删除或添加特定的DNA片段，如图所示。下列叙述错误的是( )
D
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类题
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A.识别序列形成杂交区的过程与转录过程
的碱基配对方式相同
B.在被切割后的目标DNA中添加特定的
DNA片段需要DNA连接酶
C.大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒
(DNA)及外源DNA互补的RNA序列
D.Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子
解析：识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同，都是A—U、T—A、C—G、G—C，A正确；
在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶将DNA片段连接起来，B正确；
Cas9能特异性的切断目标DNA分子中脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
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A.识别序列形成杂交区的过程与转录过程的碱基配对方式相同
B.在被切割后的目标DNA中添加特定的DNA片段需要DNA连接酶
C.大肠杆菌等细菌细胞内能合成与入侵病毒(DNA)及外源DNA互补的RNA序列
D.Cas9能专一性破坏双链DNA分子中碱基之间的氢键来切割DNA分子
