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第3章 基因工程
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2门世2有
3厚
DNA是遗传物质
三个理论基础
DNA双螺旋结构和中心法则的确定
遗传密码破译
一个概念
基因工程（重组DNA技术）
基因工程
限制酶
DNA连接酶
三种工具
载体
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
四个操作步骤
将目的基因导人受体细胞
目的基因的检测与鉴定
各种应用
崛起的缘由
蛋白质
工程
基本原理
基本途径第三章单元检测
(时间：90分钟，总分100分)
一、选择题(每小题2.5分，共50分)
1．(2023·重庆市江津中学校联考期末)探究实践是普通高中生物学整个学习过程中必不可少的活动，通过探究实践来达到验证、提取、鉴别、计数等目的，下列有关探究实践的相关叙述中正确的是( A )
A．纤维素为唯一碳源的固体培养基中添加刚果红可以初步分离和鉴定纤维素分解菌
B．利用稀释涂布平板法和平板划线法可以统计土壤中细菌的数量
C．在DNA的粗提取和鉴定中，DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最大
D．在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小和构象有关
答案：A
解析：纤维素分解菌能够产生纤维素酶，并将纤维素分解成纤维二糖和葡萄糖，并为其提供碳源，不能分解纤维素的微生物几乎不能在以纤维素为唯一碳源的培养基上生存，纤维素与刚果红形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物无法形成，培养基中会出现以这些菌为中心的透明圈，A正确；稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目，利用显微镜进行直接计数，也是一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法，B错误；在DNA的粗提取实验中，DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最大，C错误；在琼脂糖凝胶电泳中，DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，D错误。故选A。
2．(2024·江苏南通高二统考期末)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( C )
A．处理植物材料的研磨液含有SDS，可瓦解细胞膜，充分释放DNA
B．洋葱研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA水解酶的活性
C．用玻璃棒沿一个方向快速搅拌，卷起丝状物，可提高DNA的粗提取量
D．在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后呈蓝色
答案：C
解析：处理植物材料的研磨液含有SDS，可瓦解细胞膜，使细胞膜破裂，使蛋白质与DNA分离开来，从而充分释放DNA，A正确；洋葱研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟，可降低DNA水解酶的活性，防止DNA降解，B正确；用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌(快速搅拌会破坏DNA分子的完整性)，可提高DNA的粗提取量，C错误；在沸水浴的条件下DNA遇二苯胺会呈现蓝色，故在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，沸水浴后呈蓝色，D正确。故选C。
3．(2024·江苏省无锡市高二6月期末生物试题)下列关于DNA相关实验的叙述，错误的是( A )
A．利用DNA在酒精中溶解度较大的特性提取DNA
B．粗提取的DNA中可能含有蛋白质、脂质等杂质
C．用二苯胺试剂鉴定DNA时，沸水浴加热后呈蓝色
D．PCR产物一般可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定
答案：A
解析：DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精，利用这一原理，可以将DNA与蛋白质进一步的分离，A错误；粗提取的DNA纯度不高，可能含有没有分离彻底的蛋白质等杂质成分，B正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，C正确；不同的DNA片段在电泳时移动的速率不同，可以将PCR产物的电泳结果与标准DNA样品的电泳结果进行比对，从而鉴定PCR的产物，常采用琼脂糖凝胶电泳，D正确。故选A。
4．(2024·江苏扬州高二统考期末)大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA用三种限制酶处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是( C )
A．将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液，可用二苯胺试剂在沸水加热条件下鉴定DNA
B．电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理
C．根据电泳结果，质粒上一定没有限制酶I和Ⅱ的酶切位点，而有限制酶Ⅲ的切割位点
D．用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果
答案：C
解析：由于DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解度较大，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，所以将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂在沸水条件下进行鉴定，A正确；DNA带负电，电泳鉴定DNA利用了DNA在电场中会向着它所带电荷相反的电极移动的原理，B正确；因为质粒的本质是环状的DNA，限制酶Ⅰ和Ⅱ处理后电泳只有一条条带，可能是该质粒上有一个切割位点，也可能没有切割位点，C错误；凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，用琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒，被染色的质粒还需要通过紫外灯照射才能看到结果，D正确。故选C。
5．(2023·湖北孝感高二校联考期末)EcoRⅤ和XhoⅠ是两种限制酶，其识别和切割的DNA序列如图所示。下列有关叙述正确的是( D )
A．EcoRⅤ和NhoⅠ切割DNA片段分别产生黏性末端和平末端
B．EcoRⅤ和XhoⅠ两种限制酶能识别DNA的特定序列，并切割DNA的氢键
C．XhoⅠ切割DNA产生的末端用T4DNA连接酶连接时的效率较低
D．EcoRⅤ切割DNA产生的末端不能用E.coli DNA连接酶连接
答案：D
解析：由图可知，EcoRⅤ和XhoⅠ切割DNA片段分别产生平末端和黏性末端，A错误；限制酶识别DNA特定序列，并切割磷酸二酯键，B错误；T4DNA连接酶连接平末端时的效率较低，C错误；平末端不能用E.coli DNA连接酶连接，D正确。故选D。
6．(2024·浙江金华高二校联考期末)部分限制酶的识别序列及切割位点如下表(注：箭头表示切割位点)。下列叙述正确的是( B )
名称 识别序列及切割位点 名称 识别序列及切割位点
AatⅠ AGG↓CCTTCC↑GGA EcoRⅠ G↓AATTCCTTAA↑G
KpnⅠ G↓GTACCCCATG↑G BamHⅠ G↓GATCCCCTAG↑G
A.表中4种限制酶均是从DNA两端逐步剪切核苷酸
B．EcoRⅠ酶切后形成的黏性末端是5′AATT3′
C．KpnⅠ与BamHⅠ处理不同的DNA片段可获得互补的黏性末端
D．E.coli DNA连接酶可连接AatⅠ酶切后形成的片段
答案：B
解析：表中4种限制酶均是在DNA特定位置将DNA切割成片段，A错误；根据表中信息可知，EcoRⅠ识别的序列为GAATTC，并在GA之间切割磷酸二酯键，因此，该酶切后形成的黏性末端是5′AATT3′，B正确；KpnⅠ与BamHⅠ识别的碱基序列不同，形成的黏性末端不同，这两种酶处理不同的DNA片段获得的黏性末端没有互补关系，C错误；E.coli DNA连接酶可连接黏性末端，不能连接平末端，而AatⅠ酶切后形成的是平末端，D错误。故选B。
7．绿叶海天牛(简称甲)吸食滨海无隔藻(简称乙)后，身体就逐渐变绿，这些“夺来”的叶绿体能够在甲体内长期稳定存在，有科学家推测其原因是在甲的染色体DNA上可能存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因。为证实上述推测，以这种变绿的甲为材料进行实验，方法和结果最能支持上述推测的是( D )
A．提取甲的全部DNA，通过PCR技术能克隆出乙的编码叶绿体蛋白的核基因
B．通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA
C．给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性
D．用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带
答案：D
解析：通过PCR技术从甲体内的DNA中克隆出属于乙的编码叶绿体蛋白的核基因，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，A项错误；通过核酸分子杂交技术，在甲体内检测到乙的编码叶绿体蛋白的核基因转录出的RNA，这只能说明甲体内含有乙的编码叶绿体蛋白的核基因且发生了转录，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，B项错误；给甲提供14CO2，一段时间后检测到其体内的部分有机物出现放射性，这只能说明甲进行了光合作用，其中含有叶绿体，但不能说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，C项错误；用乙编码叶绿体蛋白的核基因做探针与甲的染色体DNA杂交，结果显示出杂交带，这说明甲的染色体DNA上存在乙编码叶绿体部分蛋白的核基因，D项正确。
8．(2023·重庆市江津中学校联考期末)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是( B )
A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板
B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录
D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的退火(复性)温度
答案：B
解析：第一轮PCR中，需要先合成一条链，再用这条链合成互补链，至少需要2个循环才能获得相应的大引物模板，A正确；第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，B错误；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录，C正确；为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，D正确。故选B。
9．(2024·云南省玉溪第三中学校考阶段练习)若将GFP基因与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入真核生物细胞内，表达出的蛋白质可被激发出绿色荧光。下列叙述正确的是( D )
A．构建的“融合基因”无需与其他DNA片段相连，可直接导入受体细胞
B．基因表达载体的制备需利用限制性内切核酸酶和DNA聚合酶
C．导入受体细胞内的“融合基因”需要两个启动子和两个终止子
D．利用该技术可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布
答案：D
解析：构建的“融合基因”需与运载体连接才可导入受体细胞，A错误；基因表达载体的制备需利用限制性内切核酸酶和DNA连接酶，B错误；导入受体细胞内的“融合基因”可看作一个基因，只需要一个启动子和一个终止子即可正常表达，C错误；利用该技术表达出的蛋白质可被激发出绿色荧光，可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布，D正确。故选D。
10．(2024·江西抚州高二统考期末)限制酶和DNA连接酶是重组DNA技术常用的工具酶，限制酶通常将DNA分子切割成带有黏性末端的DNA片段，而DNA连接酶可缝合带有黏性末端的DNA片段。据图分析，下列叙述正确的是( D )
A．图示三个黏性末端可由两种或三种不同的限制酶切割产生
B．图示中共有三种黏性末端，其中甲与乙黏性末端可以互补配对
C．a处和b处的核苷酸之间均需要DNA连接酶连接
D．催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子
答案：D
解析：切割产生甲的限制酶的识别序列为：GAATTC∥CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别序列为：CAATTG∥GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为：CTTAAG∥GAATTC，由此可见，图示三个黏性末端是由三种不同的限制酶催化产生的，A错误；由图可知，甲、乙的黏性末端相同，均为AATT—，丙的黏性末端为TTAA—，因此图示中共有两种黏性末端，其中甲与乙黏性末端可以互补配对，B错误；DNA连接酶能催化磷酸二酯键的形成，a处的核苷酸之间需要DNA连接酶连接，但b处(氢键)不需要，C错误；切割甲的限制酶的识别序列为：GAATTC∥CTTAAG，而甲、乙片段形成的重组DNA分子的序列可为：GAATTG∥CTTAAC，故催化甲形成的限制酶有可能不识别由甲、乙形成的重组DNA分子，D正确。
11．(2023·河南省南阳市高一下学期期末生物试题)多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以少量DNA为模板合成大量目标DNA片段，该过程与细胞内的DNA复制类似。下列关于PCR的叙述，错误的是( A )
A．PCR需要添加脱氧核糖核酸作为原料
B．PCR过程中子链的合成方向是5′→3′
C．PCR过程中存在DNA和蛋白质的结合
D．PCR的原理是DNA半保留复制，遵循碱基互补配对原则
答案：A
解析：PCR是一项体外扩增DNA分子的技术，产物是DNA，故需要添加脱氧核糖核苷酸作为原料，A错误；PCR扩增时，引物需要与模板的3′端结合，子链的合成方向是从子链的5′端向3′端延伸，B正确；PCR过程中有耐高温的DNA聚合酶与模板DNA的结合，其中耐高温DNA聚合酶的本质是蛋白质，故PCR过程中存在DNA和蛋白质的结合，C正确；PCR是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术，所利用的原理为DNA分子的复制，遵循碱基互补配对原则，D正确。
12．(2024·江苏南通高二统考期末)多重PCR是指在反应体系中加入多种引物，最终扩增出多种目的DNA片段的技术，如下图。相关叙述错误的是( B )
A．多重PCR加入的引物之间不能互补配对形成局部双链
B．不同对引物的退火温度差异越大，扩增的特异性越强
C．多重PCR扩增出的大小不一的DNA片段可用电泳检测
D．多重PCR可用于多种病原体感染的检测
答案：B
解析：多重PCR加入的不同引物的碱基排列顺序不能互补，如果互补，就会造成引物形成双链，不能与模板链结合，降低扩增的效率，A正确；一般而言，引物的GC含量越高，结合特异性越强，扩增的特异性越强，与退火温度关系不大，B错误；电泳技术可分离不同大小的DNA分子，故多重PCR扩增出的大小不一的DNA片段可用电泳检测，C正确；PCR鉴定病原体的原理是碱基互补配对，该体系中加入多种引物，最终扩增出多种目的DNA片段，故多重PCR可用于多种病原体感染的检测，D正确。
13．(2024·张家口市宣化第一中学校考阶段练习)在基因工程操作过程中，科研人员利用识别两种不同序列的限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果如下图所示。以下相关叙述中，错误的是( D )
A．该载体最可能为环状DNA分子
B．两种限制酶在载体上各有一个酶切位点
C．限制酶R1与R2的切点最短相距约200 bp
D．限制酶作用位点会导致氢键和肽键断裂
答案：D
解析：由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，A正确；由题可知，当仅用一种限制酶切割载体时，切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，B正确；由题可知，两种限制酶同时切割时则产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的酶切位点最短相距200 bp，C正确；限制酶切割DNA分子，破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
14．(2024·云南省玉溪第三中学校考阶段练习)番茄中的PG基因控制合成的多聚半乳糖醛酸酶，能破坏细胞壁使番茄软化。科学家将抗PG基因导入番茄细胞，其合成的mRNA能与PG基因合成的mRNA相结合，从而培育出抗软化的转基因番茄。下列叙述正确的是( C )
A．PG基因与抗PG基因的碱基序列完全相同
B．利用PCR技术不可检测抗PG基因是否正常转录
C．转基因番茄可能会由于花粉扩散导致基因污染问题
D．抗PG基因通过抑制PG基因的转录使其mRNA无法合成
答案：C
解析：根据题干信息可知，抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合，因此可以推测，PG基因和抗PG基因是同一段DNA分子序列，转录时模板链不同，所以PG基因与抗PG基因的碱基序列不完全相同，A错误；可以提取RNA，进行逆转录形成DNA，再进行PCR扩增，最后通过电泳检测PCR产物来判断抗PG基因是否正常转录，B错误；若抗PG基因整合到染色体DNA上，则花粉中可能含有抗PG基因，转基因番茄可能会由于花粉扩散到其他植物导致基因污染问题，C正确；抗PG基因合成的mRNA与PG基因合成的mRNA相结合，从而阻止了PG基因的mRNA的翻译过程，使细胞不能合成PG蛋白，D错误。故选C。
15．(2023·湖北省武汉重点中学高二下学期期末)除杂交瘤单克隆技术之外，制备单克隆抗体的常用方法还包括单个B细胞抗体技术，可通过下图所示的技术流程制备抗体用于治疗人类疾病。下列叙述正确的是( C )
A．应在95%氧气加5%二氧化碳的培养箱中对受体细胞进行培养
B．将基因表达载体导入受体细胞前需要用钙离子处理受体细胞
C．上述技术可一定程度避免机体对传统鼠源单克隆抗体的免疫反应
D．在杂交瘤单克隆抗体技术中，体外培养单个B淋巴细胞可以获得纯度较高的单克隆抗体
答案：C
解析：动物细胞培养对气体环境的要求为通常采用培养皿或松盖培养瓶，将其置于含95%空气加5%CO2的混合气体的培养箱中进行培养，O2是细胞代谢所必需的，CO2主要作用是维持培养液的pH，A错误；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法，将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法，需要用钙离子处理受体细胞，B错误；单克隆抗体制备流程先给小鼠注射特定抗原使之发生免疫反应，之后从小鼠脾脏中获取已经免疫的B淋巴细胞，直接获得B细胞进而产生抗体避免了免疫反应，C正确；通过从康复者外周血中的获取的单个B淋巴细胞提取目的基因进而通过转基因过程获得相应的抗体，这样抗体纯度更高，B淋巴细胞不能增殖，不能体外培养单个B淋巴细胞，D错误。故选C。
16．(2024·重庆高二重庆巴蜀中学校考期末)水蛭素是一种蛋白质，研究人员发现用赖氨酸替代水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性，相关流程如下图，据图分析正确的是( D )
A．上述研究中目前可行的直接操作对象是b
B．a→b→c的过程为基因的表达过程
C．理论上a的(5′→3′)第139至141个密码子可能发生改变
D．蛋白质工程进行中难度最大的操作并不是改造水蛭素基因
答案：D
解析：图示为蛋白质工程，蛋白质工程直接的操作对象是水蛭素基因，a表示mRNA，A错误；基因的表达过程是转录、翻译，即目的基因→a→b，B错误；分析题意，研究人员发现用赖氨酸替代水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性，故理论上a的(5′→3′)第47个密码子发生改变，C错误；蛋白质工程进行中难度最大的操作是根据蛋白质的功能设计蛋白质的结构，D正确。故选D。
17．(2023·湖北武汉高二校联考期末)已知某水生动物体内存在一种酶X，由363个氨基酸构成。科学家利用蛋白质工程技术将X中的133位的苏氨酸变为丝氨酸，将254位的精氨酸变为甘氨酸，改变后的蛋白质X′不仅仅具有原来X的催化功能还额外具有了转运蛋白的活性。下列相关说法正确的是( B )
A．蛋白质工程生产蛋白质是自然界本来就存在
B．改造该酶的实质是要改造控制该酶合成的基因
C．蛋白质工程也可以对蛋白质直接进行改造，操作时不需要构建基因表达载体
D．可以利用PCR技术从基因组中扩增出某目的基因，在PCR反应体系中至少需要2次扩增才能获得所需基因
答案：B
解析：基因工程和蛋白质工程均是对基因进行操作，基因工程合成的是天然存在的蛋白质，而蛋白质工程可以合成非天然存在的蛋白质，A错误；蛋白质工程的实质是通过改造基因来完成，因此改造该酶的实质是要改造控制该酶合成的基因，B正确；蛋白质工程的实质是对基因进行改造，从而实现对蛋白质的改造，在蛋白质工程中，改造后的基因需要导入受体细胞内才能表达出相应的蛋白质，故需要构建基因表达载体，C错误；基因组中不存在所需的基因，不能通过PCR技术直接扩增获得所需的基因，由于改造前的基因与改造后的基因控制的蛋白质在两处存在氨基酸的差异，若要通过PCR技术扩增改造为所需基因，需要设计相应的引物对相应位置的碱基序列进行改变，由于存在两处氨基酸的差异，因此获得所需基因不止通过两次复制，D错误。故选B。
18．(2024·云南省玉溪第三中学校考阶段练习)钱永健制造出蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)，这种技术称蛋白质工程。下列叙述正确的是( D )
A．只改造自然界已有的蛋白质分子，使之符合人类需要
B．由于其直接操作对象是蛋白质，因此无需构建基因表达载体
C．实质是通过改变氨基酸的空间结构从而改造蛋白质的功能
D．蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型
答案：D
解析：蛋白质工程不仅能对现有蛋白质进行改造，也可能制造出一种新的蛋白质，使之符合人类需要，A错误；蛋白质工程的直接操作对象是基因，因此被称为第二代基因工程，需要构建基因表达载体，B错误；实质是通过改变基因的碱基排列顺序从而改变蛋白质的结构，影响蛋白质的功能，C错误；蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型，进而检测其与所需的功能是否适应，而后进行相应的氨基酸和脱氧核苷酸序列的设计，D正确。故选D。
19．科学家利用现代生物技术将生长激素基因导入小鼠受精卵，得到了体型巨大的“超级小鼠”；采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。关于以上两则基因工程应用的说法，正确的是( D )
A．“超级小鼠”、转基因烟草发生的变异不可遗传
B．常用显微注射法将基因表达载体导入小鼠的体细胞中
C．构建基因表达载体常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
D．培育转基因植物时，农杆菌的作用是使目的基因导入植物细胞
答案：D
解析：“超级小鼠”、转基因烟草发生的变异是通过转基因技术实现的，属于基因重组，是可遗传的变异，A错误；常用显微注射法将基因表达载体导入小鼠的受精卵细胞中，B错误；构建基因表达载体常用的工具酶有限制酶、DNA连接酶，载体不属于工具酶，C错误。
20．上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛，他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30多倍。这标志着我国转基因研究向产业化的目标又迈进了一大步。下列有关的叙述中，正确的是( D )
A．所谓“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因
B．转基因动物是指体细胞中出现了新基因的动物
C．人们只在转基因牛的乳汁中获取人白蛋白，原因是只有转基因牛的乳腺细胞中含有人白蛋白基因
D．运用基因工程技术让牛合成人白蛋白，该技术将导致牛发生定向变异
答案：D
解析：“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中的人白蛋白基因合成出更多的人白蛋白，A错误；动物体细胞中出现新基因可能是发生了基因突变，培育转基因动物时，一般以受精卵作为受体细胞，培育出的转基因动物的体细胞都含有目的基因，B错误；转基因牛的细胞中都含有人白蛋白基因，人们只在转基因牛的乳汁中才能获取人白蛋白，原因是人白蛋白基因只在转基因牛的乳腺细胞中表达，C错误；基因工程可定向改造生物的性状，D正确。
二、非选择题(共50分)
21．(10分)(2023·浙江嘉兴高二统考期末)一些细菌在长期进化过程中形成一种免疫机制，称为CRISPR/Cas系统，可用来清除入侵的外源DNA，具体过程如图。其中，细菌CRISPR序列的间隔区可以储存入侵过的外源DNA信息，当相同外源DNA再次入侵时，gRNA能特异性识别其中的靶序列。美国昆虫学家尝试利用CRISPR/Cas9对蚊子进行基因编辑从而产生显性不育基因，使蚊子受精卵不能发育为成体，达到控制蚊子数量的目的。
回答下列问题：
(1)图中CRISPR序列指导合成gRNA(向导RNA)的过程称__转录__，gRNA通过与外源DNA的__特定碱基序列__碱基互补，从而识别外源DNA，进而引导Cas9(Cas9蛋白)切割核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
(2)下列关于CRISPR/Cas机制的叙述中，正确的是哪几项？__BCD__
A．gRNA与外源DNA相结合的片段中最多含有5种核苷酸
B．CRISPR位点使细菌具有类似二次免疫的特点
C．间隔区储存的序列越多样，细菌免疫能力越强
D．根据CRISPR/Cas原理可对某些基因进行“基因敲除”
(3)基因编辑改造蚊子的步骤包括下列5步，其先后顺序是__②④①③⑤__(用序号回答)。
①合成Cas9/gRNA复合物，对目的基因进行编辑
②蚊子的基因组进行测序，确定与生殖发育有关的基因
③实验室条件筛选出不育的转基因蚊子
④合成能与目的基因所对应的gRNA
⑤将转基因蚊子释放到野外发挥作用
(4)研究发现，雌蚊一生只能交配1次，而一只雄蚊可以与不同的雌蚊交配。据此应对__雄蚊__(填“雌蚊”或“雄蚊”)进行基因编辑。
(5)利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的技术中，构建“显性不育基因”这种变异属于__基因突变__(填“基因突变”“基因重组”或“染色体畸变”)。
答案：(1)转录 特定碱基序列 磷酸二酯键
(2)BCD
(3)②④①③⑤
(4)雄蚊
(5)基因突变
解析：(1)图中CRISPR序列指导合成gRNA的过程称为转录。gRNA通过与外源DNA的特定的碱基序列发生碱基互补配对，从而识别外源DNA，进而引导Cas9(Cas9蛋白)切割核苷酸之间的磷酸二酯键，进而实现了对外源DNA的切割。(2)gRNA与外源DNA相结合的片段为DNA和RNA杂合双链区，最多含有8种核苷酸，A错误；题意显示，细菌CRISPR序列的间隔区可以储存入侵过的外源DNA信息，当相同外源DNA再次入侵时，gRNA能特异性识别其中的靶序列，可见CRISPR位点使细菌具有类似二次免疫的特点，B正确；间隔区储存的序列越多样则转录出的gRNA序列多样，则其识别的外源DNA种类多样，因而细菌免疫能力越强，C正确；根据CRISPR/Cas原理可对某些基因进行“基因敲除”，因为该过程中实现了对DNA的特定部位的剪切，D正确。故选BCD。(3)根据题意，编辑改造蚊子的步骤应为：②蚊子的基因组进行测序，确定与生殖发育有关的目标基因、④合成与目标基因能碱基互补配对的gRNA、①合成Cas9/gRNA复合物，对目标基因进行编辑、③实验室条件筛选出不育的转基因蚊子、⑤将转基因蚊子释放到野外发挥作用。即对蚊子进行改造的步骤为②④①③⑤。(4)雌蚊一生只能交配1次，而一只雄蚊可以与不同的雌蚊交配。据此应对雄蚊子进行基因编辑，因为雄蚊能产生足够多的后代，进而可对基因编辑的结果进行合理推测。(5)利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的技术中，与编辑前的基因相比，显性不育基因碱基对的数量增添、缺失，或者某一位点的碱基被替换，但其所在染色体上的位置不变，因此，构建“显性不育基因”这种变异属于基因突变。
22．(10分)(2024·湖北武汉高二校联考期末)IKK激酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿IKK基因编码区第1 183位碱基T突变为C，导致IKK上第395位酪氨酸被组氨酸代替。为研究该患儿发病机制，研究人员利用纯合野生鼠应用大引物PCR定点诱变技术培育出SCID模型小鼠(纯合)，主要过程如图甲、乙。分析回答下列问题：
(1)在PCR反应体系中，除需加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入 耐高温的DNA聚合酶(Taq酶、热稳定DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(dNTP) 等。
(2)在图甲获取突变基因过程中，需要以下3种引物：
引物A 5′－CCCAACCGGAAAGTGTCA－3′(下划线字母为突变碱基)
引物B 5′－TAAGCTTCGAACATCCTA－3′(下划线部分为限制酶HindⅢ识别序列)
引物C 5′－GTGAGCTCGCTGCCCCAA－3′(下划线部分为限制酶SacⅠ识别序列)
则PCR1中使用的引物有__引物A和引物B__，PCR2中使用的引物有__引物C__和图中大引物的__②__(填“①”或“②”)链。
(3)PCR的反应程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 S,58 ℃ 30 S,72 ℃ 50 S,30个循环。在循环之前的94 ℃ 3 min处理为预变性；循环中72 ℃处理的目的是
__使4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA链__。
(4)研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，请你设计完成获得SCID模型鼠的实验步骤：
①杂交亲本：__F0×野生鼠__，杂交得F1；
②F1雌、雄鼠随机交配得F2；
③提取F2每只小鼠的基因组DNA，采用分子生物学方法，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，则__IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带__的为模型鼠。
答案：(1)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶、热稳定DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(dNTP)
(2)引物A和引物B 引物C ②
(3)使4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下，合成新的DNA链
(4)F0×野生鼠 IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带
解析：(1)在PCR反应体系中，除需加入引物、IKK基因、缓冲液、Mg2＋等外，还需加入耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)原料等。(2)在PCR1中，获取的是大引物，大引物中含有突变基因，所以应含有引物A，在基因的右端有限制酶HindⅢ识别的序列，所以要用到引物B；在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶SacⅠ识别的序列，所以要用到引物C；而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有HindⅢ识别的序列，从图中看，它是大引物的②链。(3)在PCR循环之前的94 ℃、3 min处理为预变性，使DNA双链解开；循环中72 ℃处理的目的是使Taq酶从引物起始通过碱基互补配对进行互补链合成。(4)①研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠F0，并确认突变基因已经稳定同源替代IKK基因，若要获得SCID模型鼠，可让F0与野生鼠杂交得F1；②F1雌雄鼠随机交配得F2；③模型鼠中应含有突变基因，但不含IKK基因，故提取F2每只小鼠的基因组DNA，利用IKK基因探针和突变基因探针进行筛选，若IKK基因探针检测未出现杂交带，突变基因探针检测出现杂交带的则为模型鼠。
23．(10分)(2024·云南省玉溪第三中学校考阶段练习)烟草是有重要经济价值的双子叶植物，易受TMV(烟草花叶病毒)感染而大幅度减产。绞股蓝细胞中含有抗TMV基因，能抵抗TMV感染。研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，操作流程如图所示。回答下列问题：
(1)过程①是__逆转录__，涉及的碱基互补配对有__4/四__种，过程②采用的方法是PCR，为了方便目的基因与Ti质粒连接，在__引物的5′端__添加合适的限制酶识别序列。
(2)PCR技术的原理是__DNA复制__，一般包括__变性、复性__和延伸三个步骤，延伸的过程是以__单链DNA__为模板，在耐高温的DNA聚合酶的催化下，按照碱基互补配对原则将4种游离的脱氧核苷酸连接到__引物的3′端__。
(3)过程④最常用的方法是__农杆菌转化法__，过程⑤用到的细胞工程技术是__植物组织培养__。获得的转基因植株需要进行__环境安全__的检测才能投入生产。
答案：(1)逆转录 4/四 引物的5′端
(2)DNA复制 变性、复性 单链DNA 引物的3′端
(3)农杆菌转化法 植物组织培养 环境安全
解析：(1)①是以RNA为模板合成DNA的过程，即逆转录，涉及碱基互补配对有A与T、U与A、G与C、C与G，共4种。为了方便目的基因与质粒的连接，可在引物的5′端添加限制酶识别序列，使目的基因和载体能够产生相同的黏性末端。(2)PCR全称为聚合酶链式反应，其原理为DNA复制，一般包括变性、复性、延伸三个步骤。延伸是指在引物的作用下，以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原则将4种游离的脱氧核苷酸连接到引物的3′端，故子链延伸的方向为5′到3′端。(3)过程④是将目的基因导入受体细胞的过程，农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法。⑤是将受体细胞培育为再生植株的过程，用到的细胞工程技术是植物组织培养。获得的转基因植株需要进行环境安全的检测才能投入生产，以避免造成基因污染。
24．(10分)(2023·湖北孝感高二校联考期末)异丁醇具有燃值高、能量密度高等优点，其开发和利用对优化我国能源结构和保护环境有非常重要的意义。科研人员构建了一种表达载体pUC18(如图1)导入酵母菌，用于过量表达ILV2、ILV5、ILV3、AR010基因，以期实现大规模生产异丁醇。图2是酵母细胞中葡萄糖代谢产生异丁醇、乙醇和乙酸的示意图，其中基因ADHs和ALDs分别控制E酶和F酶的合成。回答下列问题：
(1)将基因ILV2、ILV5、ILV3和AR010依次插入到质粒上的目的基因插入位点，选用高表达启动子pTEF1和__终止子__作为调控序列。pTEF1是__RNA聚合酶__识别并结合的位点。
(2)科研人员先将pUC18转化到大肠杆菌细胞中，以便筛选、保存和扩增重组质粒。重组质粒上的__原核__(填“真核”或“原核”)生物复制原点使pUC18能在大肠杆菌中扩增。已知氨苄青霉素抑制细菌细胞壁的合成，pUC18中氨苄青霉素抗性基因的作用是__作为标记基因用于筛选出含有重组质粒(或目的基因)的大肠杆菌细胞__。
(3)提取完整的重组pUC18并导入组氨酸缺陷型酿酒酵母细胞中，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，该过程称为微生物的__选择__培养。除必要的营养物质外，该选择培养基中需要添加的物质是__C__。
A．组氨酸 B．氨苄青霉素
C．琼脂
(4)根据图示酵母细胞葡萄糖的代谢途径，为了进一步提高异丁醇的产量，应对基因__ADHs和ALDs__进行改造使其表达产物减少。
答案：(1)终止子 RNA聚合酶
(2)原核 作为标记基因用于筛选出含有重组质粒(或目的基因)的大肠杆菌细胞
(3)选择 C
(4)ADHs和ALDs
解析：(1)启动子和终止子应该分别插入到基因的首端和末端。将基因ILV2、ILV5、ILV3和AR010依次插入到质粒上的目的基因插入位点，选用高表达启动子pTEF1和终止子作为调控序列。pTEF1作为启动子，能驱动转录过程，是RNA聚合酶识别并结合的位点。(2)科研人员先将pUC18转化到大肠杆菌细胞中，以便筛选、保存和扩增重组质粒，由于大肠杆菌是原核生物，因此在大肠杆菌细胞中重组质粒上的原核生物复制原点使pUC18能在大肠杆菌中扩增。已知氨苄青霉素抑制细菌细胞壁的合成，pUC18中氨苄青霉素抗性基因可作为标记基因用于筛选出含有重组质粒(或目的基因)的大肠杆菌细胞，则能在含青霉素的培养基上生长的大肠杆菌是转基因成功的大肠杆菌。(3)提取完整的重组pUC18并导入组氨酸缺陷型酿酒酵母细胞中，将菌株接种在培养基中以获得单菌落，该过程称为微生物的选择培养，其原理是成功导入该质粒的酵母细胞能生长，据此选择出来；该培养基中除必要的营养物质外，还需要添加的物质是琼脂，因为菌落是在固体培养基上生长出来的，因此需要在培养基中加入凝固剂。(4)根据酵母细胞中葡萄糖的代谢途径可知，若要提高异丁醇的产量，可抑制基因ADHs和ALDs的表达，这样可以使更多的营养物质转化成异丁醇。
25．(10分)如图所示为A、B、C三种质粒和一个含目的基因D的DNA片段示意图。图中AmpR为氨苄青霉素抗性基因，Tc为四环素抗性基因，LacZ为蓝色显色基因，EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，质粒上限制酶括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请回答相关问题：
(1)据图分析，质粒A、C一般不能作为载体的理由分别是__(质粒A)缺少标记基因、(质粒C)复制原点会被限制酶切割__。若要获取目的基因，应该选用限制酶__PvuⅠ__切割。
(2)将图中的目的基因与质粒B进行重组。在基因工程的操作过程中，需要检查目的基因是否重组到质粒中，应使用限制酶__EcoRⅠ__酶切重组质粒，完全酶切后，进行电泳检测。若电泳图谱中出现长度为1.1 kb和5.6 kb，或者__3.1__kb和__3.6__kb的片段，则可判断质粒B已与目的基因重组成功。
(3)若选择自身不含LacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，则如何筛选成功导入重组质粒的受体细胞？__在含有氨苄青霉素的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌__。目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质，其遗传学基础是__自然界的生物共用一套遗传密码子__。
答案：(1)(质粒A)缺少标记基因、(质粒C)复制原点会被限制酶切割 PvuⅠ
(2)EcoRⅠ 3.1 3.6
(3)在含有氨苄青霉素的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌 自然界的生物共用一套遗传密码子
解析：(1)由题图可知，质粒A缺乏标记基因，质粒C中PvuⅠ的切割位点位于复制原点，故一般不能选择质粒A、C作为载体。由于目的基因的两端都有限制酶PvuⅠ的切割位点，而限制酶EcoRⅠ会破坏目的基因，故要获取目的基因，应该选用限制酶PvuⅠ切割。(2)目的基因中除了有酶PvuⅠ的切割位点外，还存在限制酶EcoRⅠ的切割位点，由于目的基因的长度为4.0 kb，若用PvuⅠ切割重组质粒则得不到1.1 kb的片段，所以应用限制酶EcoRⅠ切割。由于目的基因和载体用一种酶进行切割，重组质粒(含2个EcoRⅠ酶切位点)会出现正向连接和反向连接两种类型，质粒B中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.1 kb，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切位点之间的距离可能是0.1＋(4－3)＝1.1 kb或0.1＋3＝3.1 kb，重组质粒长度为2.7＋4＝6.7 kb，故EcoRⅠ酶切后，电泳图谱中出现长度为1.1 kb和5.6 kb的片段或者3.1 kb和3.6 kb的片段，说明重组质粒构建成功。(3)由题意可知，重组质粒中的LacZ基因会被破坏，但保留氨苄青霉素抗性基因，故若选择自身不含LacZ基因并对抗生素敏感的大肠杆菌作为受体细胞，在含有氨苄青霉素的培养基上培养经过导入处理的大肠杆菌，则未成功导入重组质粒的大肠杆菌无法存活，而成功导入重组质粒的可以存活，能形成白色菌落的即为导入重组质粒的大肠杆菌。由于自然界的生物共用一套遗传密码子，故目的基因能在大肠杆菌细胞内表达出相同的蛋白质。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)第3章 本章整合
1．(2024·吉林卷，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是( )
A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快
D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案：A
解析：琼脂糖凝胶的浓度会影响DNA分子在凝胶中的迁移率和分辨率，琼脂糖凝胶的浓度通常是根据所需分离的DNA片段大小来选择的。对于较大的DNA片段，比如基因组DNA或质粒DNA，通常选择较低浓度的琼脂糖凝胶，因为它们需要更大的孔径来有效迁移。而对于较小的DNA片段，比如PCR产物或酶切片段，则需要选择较高浓度的琼脂糖凝胶，以提供更好的分辨率和分离效果，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，当溴酚蓝到凝胶2/3处时(可看蓝色条带)，则停止电泳，B错误；在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子需染色后，才可在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来，D错误。
2．(2024·山东卷，13)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是( )
A．整个提取过程中可以不使用离心机
B．研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰
答案：A
解析：在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4 ℃的冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正确；研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰，D错误。故选A。
3．(2024·安徽卷，14)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C．DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D．将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
答案：D
解析：研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可分离DNA，B正确；DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而改变，因此可用不同浓度的NaCl溶液对DNA进行粗提取，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，二苯胺试剂用于鉴定DNA，D错误。
4．(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( C )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接
答案：C
解析：酶3切割后得到的是平末端，应该用T4DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。故选C。
5．(2023·湖北卷，4)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案：D
解析：若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；SphⅠ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。故选D。
6．(2023·浙江卷，19)某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3－GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( B )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因的表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3－GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
答案：B
解析：分析图中可知，启动子在左侧，GFP基因整合在Gata3基因的右侧，启动子启动转录后，可以使GEP基因转录，Gata3基因的启动子能控制GFP基因的表达，A错误；因启动子在左侧，转录的方向向右，合成的mRNA从左向右为5′→3′，刚好是翻译的方向，所以翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；整合GFP基因后，核酸片段变长，2号个体只有大片段，所以是Gata3－GFP基因纯合子，4号个体只有小片段，是野生型，C错误；用引物1和引物3进行PCR扩增，扩增出的片段大小差异较小，无法较好的区分片段，D错误。故选B。
7．(2024·山东卷，25)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越________(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有________种。载体信息如图甲所示，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－__________－3′和5′－________－3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是________(填序号)。
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为________，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
答案：(1)低 256 GTTT CAAT
(2)卡那霉素 SacⅠ ④ (3)1/4
解析：(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为256。根据图甲所示的载体信息，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－GTTT－3′和5′－CAAT－3′。
(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoRⅠ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合突变的植株。
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T－DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T－DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
8．(2024·全国甲卷，12)某同学采用基因工程技术在大肠杆菌中表达蛋白E。回答下列问题。
(1)该同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是____________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是____________。
(2)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是______________。
(3)将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是__________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列(与模板链互补)是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码从GGG开始，部分密码子见表。若第一个核苷酸G缺失，则突变后相应肽链的序列是______________________。
氨基酸 密码子
赖氨酸 AAG
精氨酸 AGA
丝氨酸 AGC
脯氨酸 CCA
CCC
亮氨酸 CUG
甘氨酸 GGC
GGG
终止 UGA
答案：(1)变性 氢键
(2)避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4DNA连接酶
(3)细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
(4)甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸
解析：(1)PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是变性，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是氢键。
(2)构建重组质粒时，与单一酶酶切相比，采用的双酶切方法，可以形成不同的黏性末端，双酶切可以避免目的基因和质粒的反向连接、目的基因和质粒的自身环化。酶c单酶切后形成平末端，需用T4DNA连接酶连接。
(3)大肠杆菌细胞最常用的转化方法是：首先用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，可利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒。
(4)蛋白E基因中的一段DNA编码序列是GGGCCCAAGCTGAGATGA，编码链与模板链互补，模板链与mRNA互补，因此mRNA上的序列为GGGCCCAAGCUGAGAUGA，若第一个核苷酸G缺失，则mRNA上的序列变为GGCCCAAGCUGAGAUGA，肽链序列是甘氨酸－脯氨酸－丝氨酸。
9．(2024·广东卷，21)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图一)。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b)。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为________，理由是________________________。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为______________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路________。
答案：(1)碳源、氮源
(2)PT7、PBAD和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
解析：(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
(2)题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端－nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
(4)由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
(5)由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
10．(2024·河南卷，11)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(I～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________(答出2点即可)。
答案：(1)磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达
(2)C－G、A－T、U－A
(3)N基因的两条链 不能扩增出目的基因
(4)不污染环境、增加土壤养分
解析：(1)限制酶切割的化学键为磷酸二酯键。在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，不破坏N基因，且能保证N基因正常表达。
(2)RNA的碱基组成有A、U、G、C，DNA的碱基组成为A、T、G、C，向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G－C和C－G、A－T、U－A。
(3)用引物P1和P2进行PCR可扩增N基因，验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是N基因的两条链；用该模板与引物P3和P4进行PCR，因为P3不能与N基因模板链结合，实验结果是不能扩增出DNA片段。
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