第3课时 基因工程的其他基本操作程序
基础过关练
题组一 构建重组DNA分子
1.如图是利用基因工程技术构建重组表达载体的过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶。下列相关叙述错误的是( )
A.需要用限制酶PstⅠ和EcoRⅠ来切割质粒
B.表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能复制
C.任何基因表达载体中都必须要有抗青霉素基因作为标记基因
D.表达载体中目的基因的上游有启动子
2.如图甲、乙、丙分别是目的基因、质粒载体、重组DNA(重组质粒)的三个示意图,限制酶有BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。要获得理想的可表达目的基因的重组DNA,最佳的限制酶组合方式是( )
甲 乙
丙
A.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体
题组二 目的基因导入受体细胞
3.将目的基因导入大豆茎尖分生区细胞和小鼠受精卵,常用的方法分别是( )
A.显微注射法、农杆菌转化法
B.显微注射法、花粉管通道法
C.农杆菌转化法、显微注射法
D.花粉管通道法、显微注射法
4.转化是指目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。下列有关说法错误的是( )
A.大肠杆菌转化实验中可使用Ca2+处理以提高转化效率
B.目的基因导入受体细胞前必须构建基因表达载体以便稳定存在
C.基因枪法可将目的基因导入植物叶绿体等细胞器中
D.农杆菌转化法中需要进行两次体外拼接和两次导入
题组三 检测目的基因及其表达产物
5.如图是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。转化大肠杆菌后,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C、D四种菌落,其生长情况如表(注:“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,含有重组质粒的菌落是( )
菌落 类型 平板类型
无抗 生素 氨苄青 霉素 四环素 氨苄青霉素 +四环素
菌落A + + + +
菌落B + + - -
菌落C + - - -
菌落D + - + -
A.菌落A B.菌落B C.菌落C D.菌落D
6.基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术,芯片制作和使用过程如图所示:
下列叙述错误的是( )
A.探针和样品都必须是单链
B.基因芯片上具有多种不同序列的探针
C.探针和样品上都需携带相同的荧光标记
D.洗脱的目的是去除未与探针杂交的样品
题组四 基因工程的操作程序概览
7.(易错题)下列有关基因工程基本操作程序的叙述,正确的是( )
A.目的基因检测时所用的核酸探针是指与目的基因相同的特定双链DNA
B.基因组文库的基因含有某物种的部分基因
C.若基因比较小且核苷酸序列已知,则可直接通过化学方法合成
D.抗生素合成基因作为标记基因,可鉴别目的基因是否导入受体细胞
8.如图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述正确的是( )
A.②的构建需要限制酶和DNA聚合酶
B.应用DNA探针技术,可检测④细胞中目的基因是否表达
C.一般情况下⑤只要表现出抗虫性状,就表明植株发生了可遗传变异
D.光学显微镜下观察③细胞的Ti质粒是筛选标志之一
9.甜玉米与普通玉米相比,甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢,可溶性糖含量高,汁多质脆,富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值,科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白的转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中,所用DNA片段和Ti质粒的识别位点如图所示。
说明:强启动子是一段有特殊结构的DNA片段;BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ、SacⅠ代表不同的限制酶;T-DNA是农杆菌的Ti质粒上的DNA片段。
(1)为了特异性扩增P基因序列,可采用 技术,一般要加入的原料为 。
(2)强启动子是一段有特殊结构的DNA片段,能被 识别并结合,驱动基因的转录。
(3)构建超量表达P基因载体,需选用 限制酶的组合和DNA连接酶。将重组Ti质粒转入农杆菌,需先将农杆菌用 处理。
(4)将玉米愈伤组织经农杆菌液浸泡,超量表达P基因会随T-DNA ,从而获得转基因植物细胞。
能力提升练
题组 基因工程的基本操作程序
1.菊花是一种双子叶植物,易感桃蚜。桃蚜不但直接影响植物生长,还是多种植物病毒的传播媒介。雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,某科研团队运用农杆菌转化法获得了转GNA基因菊花。下列有关叙述不正确的是 ( )
A.受体细胞可以选择菊花叶片细胞或桃蚜细胞
B.将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上构建基因表达载体
C.菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞
D.应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度
2.将山核桃miRNA169基因转入拟南芥中,可促进拟南芥提前开花,部分流程如下图。下列叙述错误的是( )
A.过程①通常需要逆转录酶催化
B.过程②中可利用PCR技术扩增并筛选出目的基因
C.过程③中转化农杆菌一般需要农杆菌的Ti质粒作为表达载体
D.过程④收获转化的种子需经植物组织培养才能获得提前开花的植株
3.自然界中很少出现蓝色的花,天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图),通过农杆菌转化法导入白玫瑰中,在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。下列说法正确的是( )
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中需转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表达时分别以T-DNA的不同链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰细胞质基因组中防止基因扩散
4.法尼醇X受体(FXR)又称胆汁酸受体,研究表明,FXR在调节肝脏再生和抑制肝脏肿瘤方面发挥了关键作用。斑马鱼具有与人类高度相似的基因组,其胚胎和幼鱼身体透明,在毒理学和药理学研究方面有其独特优势。研究人员建立模型动物,用于FXR相关药物筛选。请回答下列问题:
(1)已知限制酶XhoⅠ的识别序列具有回文对称的特点(即一条链从左向右读和另一条链从右向左读的序列是相同的),若一段核苷酸序列为“-ATCTCGAGCGGG-”,则对该段核苷酸序列进行剪切的XhoⅠ限制酶识别的核苷酸序列(6个核苷酸)为 ;限制酶破坏的键为 。
(2)如图为NR1H4基因的两种引物序列,要将限制酶XhoⅠ和BamHⅠ的识别位点添加到NR1H4基因两端,加入限制酶识别位点的位置应在图中的 (填序号)处;进行PCR扩增,经过 轮循环后,可得到两端有酶切位点的目的基因片段。
上游引物:5'-①TGCAGCATCATGCTTGTGGAAG②-3'
下游引物:5'-③TCATCGTGTGAACCACAATGCTC④-3'
(3)将重组质粒导入用 处理过的大肠杆菌体内,扩大培养后,提取质粒。再将重组质粒借助 (填仪器名称)注入斑马鱼 细胞内。
(4)在重组质粒上,含有氨苄青霉素抗性基因和增强绿色荧光蛋白基因。在斑马鱼培养过程中,应以 作为标记基因筛选出在肝脏中特异性表达的个体;斑马鱼在此实验中作为模型动物方便进行筛选,原因是 。
5.19世纪末,巴斯德开创了第一次疫苗革命,其特点是接种灭活或减毒的病原微生物。20世纪70年代开始,现代生物技术的迅猛发展,开创了第二次疫苗革命,使疫苗的研制进入分子水平。图1是通过基因工程制备乙型肝炎表面抗原(HbsAg)从而获得乙肝疫苗的过程,数字①~⑦为相关步骤。
图1
在图1步骤①和③中,需要用合适的限制酶切割乙肝表面抗原基因和质粒。乙肝表面抗原基因及质粒的部分限制酶的识别序列及位置如图2。启动子是质粒中基因得以正常表达所必需的部分。LacZ基因控制合成某种酶,该酶能将无色染料X-gal变成蓝色,最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色。
图2
(1)在图1步骤④中,使用的基因工程工具酶是 ,将一个乙肝表面抗原基因与一个质粒重组的过程中,游离的磷酸基团数目减少 个。
(2)根据图2,为了避免自身环化及便于筛选,切割质粒选用的限制酶是 ,获得乙肝表面抗原基因选用的限制酶是 。
(3)为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞,需要将大肠杆菌接种到含 的固体培养基上,挑选 的菌落纯化培养。
(4)若运用PCR技术检测乙肝表面抗原基因是否导入,需根据目的基因的序列设计 ,
利用待检DNA为模板进行PCR。PCR过程包括多次循环,每个循环分为3个步骤: → →延伸。
(5)利用基因工程生产乙肝疫苗比灭活的乙肝病毒的疫苗安全性更 ,原因是 。
答案与分层梯度式解析
基础过关练
1.C 限制酶SmaⅠ的识别序列位于目的基因中,因此,表达载体构建时不能用限制酶SmaⅠ,应用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,A正确;表达载体中的抗青霉素基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代,B正确;基因表达载体中标记基因的种类有很多,不一定都是抗青霉素基因,C错误。
2.D 只用EcoRⅠ切割目的基因和质粒载体,二者会产生相同的黏性末端,用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接、自身环化,A错误。用Bgl Ⅱ和EcoRⅠ切割目的基因,目的基因两端会出现由EcoRⅠ切割出的相同末端;用Bgl Ⅱ和EcoRⅠ切割质粒载体,质粒载体两端会出现由Bgl Ⅱ和EcoRⅠ切割出的不同末端,则用Bgl Ⅱ和EcoRⅠ切割目的基因与质粒载体,目的基因与质粒载体无法连接,B错误。用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体,会导致RNA聚合酶的移动方向与图丙相反,C错误。用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和质粒载体,RNA聚合酶的移动方向与图丙相同,D正确。
3.C 大豆是双子叶植物,农杆菌转化法是将目的基因导入双子叶植物细胞常用的方法;显微注射法是将目的基因导入动物细胞最常用的方法。
4.D 用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使其成为感受态细胞,有利于重组的基因表达载体导入其中,提高转化效率,A正确。要让基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代;同时,使目的基因能够表达和发挥作用,需要构建基因表达载体,这一步是基因工程的核心步骤,B正确。农杆菌转化法有两次拼接过程,即Ti质粒与目的基因之间的拼接(体外拼接)、携带目的基因的T-DNA与植物细胞的染色体DNA之间的拼接(体内拼接);有两次导入过程,即基因表达载体导入农杆菌、农杆菌导入植物细胞,D错误。
5.B 构建重组质粒时,目的基因插入的位置是四环素抗性基因(tetr)中间,破坏了四环素抗性基因(tetr),氨苄青霉素抗性基因(ampr)没有被破坏。因此含有重组质粒的菌落在添加了四环素的培养基中不能生长,而在添加氨苄青霉素的培养基中能生长,故选B。
6.C 基因芯片是利用核酸分子杂交原理进行基因检测的,探针和样品都必须是单链,同时应该在样品(无荧光标记)上放置荧光标记的探针,从而才能通过样品中是否出现荧光来判定是否有特定序列,A正确,C错误。基因芯片技术是一种可同时检测不同基因片段的新型检测技术,故基因芯片可以放置多种探针,检测多种不同序列,B正确。样品和探针杂交后,需要进行洗脱,将未与探针结合的样品去除,避免影响信号检测,D正确。
7.C 基因组文库的基因含有某物种的全部基因,cDNA文库的基因含有某物种的部分基因,B错误。载体上的抗生素抗性基因作为标记基因,可用于检测目的基因是否导入受体细胞,D错误。
8.C ②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶,A错误;检测细胞中目的基因是否表达需要利用抗原-抗体杂交技术,B错误;一般情况下⑤只要表现出抗虫性状,就表明植株发生了可遗传变异,C正确;光学显微镜下无法观察到质粒,该基因工程可以在个体水平上进行鉴定,即植株的叶片是否具有抗虫效果,D错误。
9.答案 (1)PCR 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP) (2)RNA聚合酶 (3)BamHⅠ和SacⅠ CaCl2溶液 (4)整合到玉米细胞的染色体DNA上
解析 (1)为了特异性扩增P基因序列,可采用PCR技术。聚合酶链式反应技术简称PCR技术,是一种在DNA聚合酶作用下体外扩增特异DNA片段的技术,需要能量和原料等,dNTP(dATP,dTTP,dGTP,dCTP)能为子链延伸过程提供能量和原料。(3)在构建基因表达载体时,要想使P基因在玉米植株中超量表达,切割目的基因时需要把强启动子和P基因连在一起切割下来,因此需要用到BamHⅠ和SacⅠ切割;HindⅢ、EcoRⅠ、NotⅠ切割会破坏目的基因。将重组Ti质粒转入农杆菌时,可以用CaCl2溶液处理农杆菌使之成为感受态细胞,易于重组Ti质粒导入。
能力提升练
1.A 要获得转GNA基因菊花,应将GNA基因转入菊花细胞,不能转入桃蚜细胞,A错误;Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞中,并且整合到受体细胞染色体DNA上,根据这一特点,构建基因表达载体时,应将目的基因GNA插入Ti质粒的T-DNA上,B正确;菊花外植体产生的酚类化合物能吸引农杆菌移向受体细胞,有利于目的基因成功导入,C正确;已知雪花莲凝集素基因GNA的表达产物能有效抑制桃蚜生长,故可应用抗虫接种实验,检测转基因菊花对桃蚜的抗性及抗性的程度,D正确。
2.D 过程①为RNA在逆转录酶的催化作用下得到cDNA的过程,A正确;过程②中可利用PCR技术扩增并筛选出目的基因,B正确;过程④收获转化的种子,直接在土壤中培养就能获得提前开花的植株,不需要经植物组织培养,D错误。
3.C 题述获得蓝色玫瑰的方案中,靛蓝能够稳定显色,不受pH的影响,故该方案中无需转入能调控液泡pH的基因,A错误。将目的基因导入植物细胞可采用农杆菌转化法,农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上,D错误。
4.答案 (1)-CTCGAG- 磷酸二酯键 (2)①③ 3 (3)CaCl2溶液 显微操作仪 受精卵 (4)增强绿色荧光蛋白基因 斑马鱼胚胎和幼鱼身体透明,可直接观察肝脏的荧光
解析 (1)根据回文对称的特点,限制酶XhoⅠ识别的含6个核苷酸的序列是-CTCGAG-。(2)PCR引物的3'端碱基为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,要将限制酶XhoⅠ和BamHⅠ的识别位点添加到NR1H4基因两端,应将相应序列添加到引物5'端,即①③处。(3)经CaCl2溶液处理过的大肠杆菌成为感受态细胞,重组质粒容易进入。将重组质粒注入动物受精卵才能发育为转基因动物,该过程应用了显微注射技术。(4)由于标记基因在重组质粒上,所以利用标记基因可筛选出成功导入目的基因的斑马鱼。由于斑马鱼胚胎和幼鱼身体透明,以增强绿色荧光蛋白基因作为标记基因,便于筛选出在肝脏中特异性表达的个体,看到肝脏发出绿色荧光的斑马鱼即是转基因成功的斑马鱼。
5.答案 (1)DNA连接酶 4 (2) BamHⅠ和HindⅢ BclⅠ和HindⅢ (3)氨苄青霉素和无色染料X-gal 未被染成蓝色(或白色) (4)引物 变性 退火 (5)高 基因工程生产的乙肝疫苗成分中只含病毒蛋白,不含病毒核酸,不会出现病毒侵染的情况
解析 (1)图1中过程④为利用表达载体构建重组DNA分子中的目的基因与质粒的连接,使用的基因工程工具酶是DNA连接酶,DNA连接酶可以将不同来源的2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来;一个乙肝表面抗原基因(含有2个游离的磷酸基团)与一个质粒(被切开的质粒含有2个游离的磷酸基团)重组的过程中(图1的步骤④),游离的磷酸基团数目减少4个。(2)分析目的基因和质粒如下图所示:目的基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点,因此不能用EcoRⅠ切割外源DNA分子;用限制酶BclⅠ切割质粒会破坏启动子,因此切割质粒选用的限制酶是BamHⅠ和HindⅢ(BclⅠ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同)。
(3)LacZ基因控制合成某种酶,该酶能将无色染料X-gal变成蓝色,最终能在含无色染料X-gal的培养基上将含该基因的菌落染成蓝色。为筛选含有乙肝表面抗原的大肠杆菌细胞,需要将大肠杆菌接种到含氨苄青霉素和无色染料X-gal的培养基上,白色大肠杆菌菌落(未被染成蓝色的菌落)为所需菌种。
(4)若运用PCR技术,需根据目的基因的序列设计引物,引物的作用是使耐高温的Taq DNA聚合酶能够从引物的3'端进行子链的延伸。PCR过程包括多次循环,每个循环分为3个步骤:变性(高温使得DNA双链解旋成两条DNA单链,DNA的两条单链作为模板)→退火(便于引物与DNA单链结合)→延伸(合成新的DNA互补链)。(5)结合题图可知,利用基因工程生产的乙肝疫苗只含有蛋白质成分,而灭活的乙肝病毒的疫苗含有蛋白质和核酸,仍有可能出现病毒侵染的情况,故利用基因工程生产的乙肝疫苗比灭活的乙肝病毒的疫苗安全性更高。
15(共41张PPT)
1.基因工程(重组DNA技术):有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中,使后者
获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术。基因工程打破了常规育种难以突破的物种间
的界限。
2.理论基础
(1)DNA是遗传物质的证明。
(2)“中心法则”的确立和完善,阐明了遗传信息的传递和表达的机制。
(3)遗传密码的破译。
第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性
知识点 1 基因工程的概念和理论基础
必备知识 清单破
1.限制性内切核酸酶(限制酶)
知识点 2 基因工程的工具
来源 主要来自细菌等微生物
作用 (1)识别双链DNA上特定的核苷酸序列;
(2)催化其中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键水解;
(3)使DNA双链在特定的位置断开
识别序列 通常是4~8个核苷酸对(6个核苷酸对最为常见);
不同限制酶的识别序列一般各不相同
作用结果 黏性末端:DNA末端有凸出的单链部分;
平末端:DNA末端没有单链部分
特别提醒
(1)限制酶能破坏外源DNA,可防止外源DNA的入侵。
(2)细菌自身DNA经过相应的化学修饰不会被自身含有的限制酶破坏。
2.DNA连接酶
(1)功能:将2个DNA分子的双链通过磷酸二酯键分别连接起来,形成一个重组DNA分子。
(2)种类
E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用特点 仅能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端
3.载体(通常是质粒,也可以是动植物病毒、噬菌体)
(1)作用:能与外源DNA相连接并将其送入受体细胞中进行扩增。
(2)特征
特征 作用
含有复制起点 能够独立自主复制并稳定存在
含有一种或多种限制酶的识别序列 方便外源基因插入载体中
具有筛选作用的标记基因 能够通过表型鉴别含有载体的细胞
特别提醒 载体应对受体细胞无害,以便受体细胞能正常增殖。
(3)常用载体——质粒
①在细菌内可以独立自主复制。
②有多种限制酶识别序列。
③具有标记基因,如氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因,可使用含有这两种抗生素的培
养基筛选含有此质粒的细菌。
特别提醒 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之
外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
1.实验原理
(1)幼嫩的植物材料经过冷冻后再研磨,细胞结构容易被破坏;十二烷基硫酸钠(SDS)能使核蛋
白变性并与DNA分离;乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性,防止核DNA被酶解。
(2)DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度高,且Na+与DNA形成钠盐;DNA钠盐不溶于酒精而某
些蛋白质能溶于酒精,提取液中加入95%的冷酒精,能使DNA钠盐形成絮状沉淀物而析出。
(3)鉴定:
知识点 3 DNA的粗提取和鉴定
2.方法步骤
1.获取目的基因
(1)真核、原核基因的结构
①真核、原核基因的结构的比较
知识点 4 基因工程的基本操作程序
真核基因 原核基因
示意图
编码序列 不连续:外显子+内含子 连续
启动子 位于基因的“上游”,有RNA聚合酶结合的位点,控制转录的开始 终止子 位于基因末端,RNA聚合酶到达时,释放出RNA产物,转录结束 ②真核细胞基因的特点
a.不同基因内含子和外显子的数目及长度不同。
b.内含子和外显子均会被转录成RNA,再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等
RNA加工过程,形成可以直接用于翻译的mRNA。
易错强调 区别启动子与起始密码子、终止子与终止密码子
(1)启动子、终止子:位于DNA上,转录开始或终止的信号。
(2)起始密码子、终止密码子:位于mRNA上,翻译开始或结束的位点。
(2)获取目的基因的方法
①化学合成法:将核苷酸按照特定顺序一个一个地连接起来合成目的基因。化学合成法需要
已知目的基因全部序列,且成本较高,适于合成序列较短的基因。
②借助载体建立基因文库(常用方法)
a.基因组文库:某种生物的基因组DNA切成适当大小 分别与载体组合 导入微生物细
胞 克隆。
b.cDNA文库:特定的组织或细胞中提取并纯化全部mRNA 在逆转录酶等酶的催化下,以
mRNA为模板合成互补的DNA(cDNA) 分别与载体组合 导入微生物细胞 克隆。
特别提醒
(1)不同组织细胞的cDNA文库是不同的。
(2)同一组织细胞在不同的发育阶段,cDNA文库也会有差异。
③PCR技术体外扩增特定的DNA(常用方法)
a.条件
b.过程
c.产物鉴定方法:凝胶电泳(具体见知识点5)。
2.利用表达载体构建重组DNA分子——基因工程的核心
(1)表达载体:使目的基因既能扩增又能表达出相应蛋白质的载体。表达载体包含适当的转
录和翻译信号。
(2)构建重组DNA分子过程:用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的
DNA片段以及表达载体→利用DNA连接酶将目的基因与表达载体连接起来。
微生物细胞 植物细胞 动物细胞
常用方法 CaCl2溶液处理法 农杆菌转化法 显微注射法
受体细胞 原核细胞 体细胞等 受精卵
过程 低温、Ca2+处理 ↓ 感受态细胞 ↓ 低温条件下感受态细胞 与重组DNA分子混合 外源DNA转入细胞 目的基因插入Ti质粒
的T-DNA中
重组Ti质粒 农杆菌 植物细胞 ↓ 目的基因随T-DNA整 合到植物染色体DNA上 ↓ 获得表现出新性状的植株 重组DNA片段通过
显微操作仪注射到受精卵中
3.将目的基因导入受体细胞
4.检测目的基因及其表达产物
(1)检测DNA——确定目的基因在受体细胞中是否稳定存在
①借助载体上的标记基因检测。
②PCR技术检测
根据目的基因的序列设计PCR引物
↓
利用待检DNA为模板进行PCR
↓
通过电泳或DNA测序技术鉴定PCR产物
③核酸分子杂交:利用核酸探针检测特异的核苷酸序列,核酸探针是带有放射性或荧光标记
的具有特定核苷酸序列的DNA或RNA。利用探针检测目的基因的简要方法:
用化学方法使待检的DNA变性成单链并固定在硝酸纤维素膜上
↓
加入探针
↓
适当条件下探针与互补的目的基因片段形成双链
↓
漂洗硝酸纤维素膜去除未互补结合的探针
↓
检测硝酸纤维素膜的放射性或荧光,判断待检DNA中是否含有目的基因
(2)RNA、蛋白质及个体水平上的检测——确定目的基因是否正确表达
①mRNA:核酸分子杂交技术,判断目的基因在受体细胞内是否成功转录。
②蛋白质:抗原-抗体杂交技术,判断目的基因在受体细胞内是否成功表达。
③个体:观察测定个体是否表现出目的基因控制的特定性状并稳定遗传,是判断转基因成功
的直接证据。
1.实验原理
(1)PCR经过多次循环变性、退火、延伸三个步骤,可获得大量目的基因或DNA片段。
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA是带有负电的生物大分子。带电粒子在电场作用下,向着与其携带电荷相反的电极
迁移,这个过程就是电泳。
②PCR的产物可利用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中,DNA的迁移速率主要受DNA片段
长度的影响。在电场强度一定时,DNA分子越大,向正极迁移速率越慢。
③DNA本身无色,可使用亚甲基蓝将DNA染成蓝色。
知识点 5 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
2.实验过程及结果
知识辨析
1.同一基因在基因组文库和cDNA文库中的长度可能不同。这种说法正确吗
正确。cDNA是由成熟的mRNA逆转录合成的,其中不含有基因的调控序列启动子和终止
子,也不含有内含子。同一基因在cDNA文库中的长度应短于其在基因组文库中的长度。
2.真核基因内部的编码序列是不连续的,分为外显子和内含子,其中外显子会被转录成RNA,
而内含子不能被转录。这种说法正确吗
不正确。外显子和内含子均会被转录成RNA,再经过切去内含子对应部位、连接外显子对
应部位等RNA加工过程,形成可以直接用于翻译的mRNA。
3.PCR技术中所用的原理、原料、酶等,与体内DNA复制相同。这种说法正确吗
不正确。PCR技术与体内DNA复制都遵循半保留复制的原理,但与体内DNA复制不同的是
PCR用到的原料是dNTP,酶是耐高温的Taq DNA聚合酶,不需要解旋酶。
4.DNA粗提取实验中,DNA钠盐溶于酒精,但某些蛋白质不溶于酒精,利用这一原理,可以分离
DNA钠盐与蛋白质。这种说法正确吗
不正确。DNA钠盐不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精。
提示
提示
提示
提示
5.DNA Marker是一种已知长度和含量的标准DNA片段,在电泳中能作为参照物;不同的DNA
Marker所含DNA片段长度相同但含量不同。这种说法正确吗
不正确。DNA Marker是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物,在电泳中能作为参
照物;不同的DNA Marker所含DNA片段长度和含量是不同的。
6.将重组DNA分子导入动物细胞,常使用CaCl2溶液处理法,并以受精卵作为受体细胞。这种
说法正确吗
不正确。将重组DNA分子导入动物细胞,常使用显微注射法,并以受精卵作为受体细胞。
7.运用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达出相应蛋白质时,应以目的基因为抗原,制
备能与其特异性结合的并能被放射性或荧光标记的抗体。这种说法正确吗
不正确。运用抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达出相应蛋白质时,应以目的基因
表达出的蛋白质为抗原(而非以目的基因为抗原),制备能与其特异性结合的并能被放射性或
荧光标记的抗体。
提示
提示
提示
定点 1 与DNA相关的几种酶的比较
关键能力 定点破
DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA分子 单个的脱氧核苷酸 DNA分子
作用结果 将两个DNA片
段连接成一个重
组DNA分子 将DNA分子从
内部剪切成片
段,形成具有黏
性末端或平末端
的DNA片段 形成新的DNA
分子 将双链DNA分
子局部解旋为单
链
典例 下列有关酶的叙述,正确的是( )
A.DNA连接酶以DNA的一条链为模板,将单个脱氧核苷酸连接起来
B.限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子
C.DNA聚合酶可将两个DNA分子片段间的缝隙从5'到3'端连接起来
D.逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶
B
解析 DNA连接酶连接两个DNA分子片段,A错误;游离的脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用
下连接到正在合成的DNA子链上,C错误;逆转录酶是以RNA为模板指导脱氧核苷酸连接合
成DNA的酶,D错误。
1.比较PCR技术和体内DNA复制的不同点
定点 2 PCR技术的原理及过程
体内DNA复制 PCR技术
解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋
场所 细胞内(主要在细胞核内) PCR仪内
酶 解旋酶、DNA聚合酶 耐高温的Taq DNA聚合酶
温度条件 细胞内温和条件 需控制温度,在较高温度下进行
结果 DNA分子 DNA片段或目的基因
2.PCR的过程及其影响因素
变性 退火 延伸
目的 高温断开氢键,使
DNA解旋形成单链 引物与目的基因结
合,形成氢键 Taq DNA聚合酶以引
物为起点合成子链
影响 因素 分析 (1)氢键数量越多,温
度相应越高; (2)温度不能过高,防
止Taq DNA聚合酶失
活 (1)温度:过高引物难
以结合、过低非特异
性结合增加; (2)时间:退火时间过长易引起原模板链结合 (1)温度:保证酶的最
大活性;
(2)时间:根据子链的
长短控制时间
3.PCR的结果分析
(1)PCR原理示意图
①第二次循环结束后,体系中的DNA单链有a、b、c三种。
a表示原DNA的单链,共2条。
b是以a为模板合成的子链,每循环一次增加两条,n次循环后b有2n条。
c表示以b为模板合成的子链。
②循环n(n>2)次之后,PCR体系中仍只存在3种DNA,如图分别为(a+b)、(b+c)、(c+c),其中(c+
c)为等长DNA,其数目应为2n-2n。
特别提醒 在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段(两条核苷酸链等长的DNA分子)。
③每一条子链都以引物为起点进行延伸,故新合成的子链数=消耗的引物数。
④PCR体系需要两种引物,且两种引物同时使用,故消耗某种特定引物的数量=消耗的引物数/2。
(2)PCR中的数量关系汇总
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1
同时含两种引物的DNA分子数 0=21-2 2=22-2 6=23-2 2n-2
共消耗引物的对数 1=21-1 3=22-1 7=23-1 2n-1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0=21-2 0=22-4 2=23-6 2n-2n
典例 如图为利用逆转录方法和PCR技术扩增目的基因片段的过程示意图。据图分析,下列
说法错误的是 ( )
A.在第3轮循环结束后,两条链等长的DNA占1/4
B.⑤过程使用70~75 ℃的温度处理既可以防止DNA变性,也可以促进子链的延伸
C.④过程两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
D.第4轮④过程中消耗15对引物
D
思路点拨 图中①表示逆转录,核酸酶H可水解RNA链,②表示以DNA单链为模板形成DNA
双链,③表示变性,④表示退火,⑤表示延伸,③④⑤表示PCR的一次循环。
解析 在第3轮循环结束后,产生的DNA分子数目为23=8,其中两条链等长的DNA数目是23-2
×3=2,可见,两条链等长的DNA占1/4,A正确;第4轮循环新合成了16条子链,因而需要16个引
物,即④过程中消耗8对引物,D错误。
1.根据目的基因两端的限制酶识别位点确定限制酶的种类
甲 乙
定点 3 限制酶的选择原则
(1)应选择识别位点位于目的基因两端的限制酶, 以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ。
(2)不能选择识别位点位于目的基因内部的限制酶, 以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ。
(3)为避免目的基因与质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和
质粒,如图甲、乙可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
2.根据质粒的特点确定限制酶的种类
(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的末端。
(2)质粒作为载体必须具备标记基因等,所以选择的限制酶尽量不要破坏这些结构, 应至少含
有一个完好的标记基因。
(3)所选限制酶的识别位点不应位于复制起点处,以防破坏复制起点,如果所选限制酶的识别
位点不止一个,则切割重组后可能会丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点,则切割重组后
的片段进入受体细胞后不能自主复制。
(4)所选限制酶的识别位点应位于启动子与终止子之间,如图中Hind Ⅲ会破坏启动子,EcoRⅠ
会破坏终止子,而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。
3.参考Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶
若质粒上标出T-DNA片段,则所选限制酶的识别位点应位于T-DNA片段中,从而有利于将目
的基因嵌入T-DNA片段中(Ti质粒的T-DNA片段易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染
色体DNA中)。
典例 图1、图2中箭头表示相关限制酶的识别位点。下列说法正确的是 ( )
图1 图2
D
A.选用BamHⅠ和EcoRⅠ同时切割目的基因和质粒,可得到符合要求的重组DNA
B.不同种限制酶切割DNA产生的黏性末端一定不能互补
C.用图中质粒和外源DNA构建重组质粒,可使用SmaⅠ切割
D.使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA,可能会发生质粒或者目的基因的自身环化
解析 选用BamHⅠ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒,质粒出现两个不同的黏性末端,而目的基
因两侧出现两个相同的黏性末端(如图),两者不能连接形成重组DNA,A错误;
某些不同的限制酶切割DNA能够产生相同的黏性末端,这些黏性末端可以互补,B错误;由于
目的基因内部和抗生素抗性基因内部都含有SmaⅠ的识别位点,故用图中质粒和外源DNA构
建重组质粒,不能使用SmaⅠ切割,C错误;使用EcoRⅠ同时处理质粒和外源DNA,可能会发生
质粒或者目的基因的自身环化,一般用两种限制酶切割质粒和外源DNA,防止自身环化,D正确。
1.表达载体上标记基因的标记原理
(1)载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性
基因等。
(2)目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(3)当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后,抗生素抗性基因在受体细胞内表达,使受
体细胞具有抵抗相应抗生素的能力。
(4)在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素,就可以筛选出成功转入载体且标记基因表达
的受体细胞。
具体示例:
定点 4 界定“标记基因”与“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”在目的基因检测中的
作用
2.“标记基因”筛选后还需应用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”确认目的基因是否
转入:经上述步骤筛选得到的受体细胞含有有特定标记基因的质粒,然而,该质粒上是否成功
嵌入了目的基因还不确定,故仍需利用“PCR技术”或“核酸分子杂交技术”检测受体细胞
的质粒上是否含有目的基因。
核酸分子杂交技术具体检测原理如图:
典例 科学家将苏云金芽孢杆菌中的Bt毒蛋白基因(抗虫基因)导入棉花的愈伤组织细胞,鉴定
后,将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验,发现棉花植株并
无抗虫性状,科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作,下列分析错误的是
( )
A.提取细胞中的蛋白质,采用抗原-抗体杂交技术进行检测,若能检测到Bt毒蛋白,则可能是抗
虫基因表达效率低
B.若经A检测确定细胞中无Bt毒蛋白,可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的RNA,若测到Bt
毒蛋白的mRNA,则可能是抗虫基因能转录,但不能正常翻译
C.若经B检测确定细胞中无Bt毒蛋白的mRNA,可采用核酸分子杂交技术检测细胞中的DNA,
若能检测到抗虫基因,则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分子中
D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因,则可能只是载体DNA分子导入受体细胞
D
思路点拨 目的基因及其表达产物的检测思路
解析 抗原和抗体能特异性结合,可提取细胞中的蛋白质,采用抗原-抗体杂交技术进行检测,
若能检测到Bt毒蛋白,说明抗虫基因能表达;但棉花植株并无抗虫性状,则可能是抗虫基因表
达效率低,合成的Bt毒蛋白太少,A正确。核酸分子杂交技术的原理是碱基互补配对,检测细
胞中的RNA,若能检测到Bt毒蛋白的mRNA,说明抗虫基因能转录;细胞中无Bt毒蛋白,说明抗
虫基因不能正常翻译,导致棉花植株并无抗虫性状,B正确。核酸分子杂交技术检测细胞中的
DNA,若能检测到抗虫基因,而抗虫基因又不能表达,则可能是抗虫基因反向插入载体DNA分
子中,C正确。由题干信息“鉴定后,将含抗虫基因的受体细胞组织培养获得棉花植株”可
知,导入受体细胞的是重组DNA分子,D错误。第四章 基因工程
第一节 基因工程赋予生物新的遗传特性
第1课时 基因工程的工具、DNA的粗提取和鉴定
基础过关练
题组一 基因工程的概念和工具
1.科学家们经过多年的努力,创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A.定向提取生物体的DNA分子
B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.定向地改造生物的遗传性状
2.(易错题)限制酶、DNA连接酶是基因工程的工具酶,以下说法正确的是( )
A.T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,不具有专一性
B.限制酶只能切割双链DNA片段,不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,所以也能剪切自身的DNA
3.据图判断,下列有关工具酶功能的叙述,错误的是( )
A.DNA连接酶可以连接b处
B.DNA聚合酶可以连接a处
C.解旋酶可以使b处解开
D.限制酶可以切断a处
4.质粒是基因工程中最常用的载体,有关质粒的说法正确的是( )
A.质粒不仅存在于细菌中,某些病毒也具有
B.细菌的基因只存在于质粒上
C.质粒为小型环状DNA分子,存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中
D.质粒是基因工程中的重要工具酶之一
5.下列关于基因运输工具——载体,必须具备的条件之一及理由均正确的是( )
A.能够复制,以便目的基因插入其中
B.具有一种或多种限制酶识别序列,便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因,便于重组DNA的筛选
D.对受体细胞无害,便于重组DNA的筛选
6.下列有关如图所示的黏性末端的说法,错误的是( )
甲 乙 丙
A.甲、乙、丙黏性末端是由三种不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重组DNA分子,但甲与丙的黏性末端不同
C.DNA连接酶的作用位点是a处
D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是CAATTG
7.已知一双链DNA分子,用限制酶Ⅰ切割得到长度为120 kb( kb:千碱基对)片段;用限制酶Ⅱ切割得到40 kb和80 kb两个片段;同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时,得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段。据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况为( )
A B
C D
8.图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。请思考回答下列问题:
图1
图2
(1)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的化学本质是 ,其单体是 。
(2)EcoRⅠ限制酶的识别序列是 ,EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的识别序列不相同,说明限制酶具有 性。
(3)由图2可知,当限制酶在它识别序列的 切开时,产生的末端是平末端;要将图1中的末端再连接起来,需要用 酶(填酶的具体名称)。
(4)1970年,人们在细菌中发现了第一个限制酶,而在该细菌中没有此限制酶的识别序列,推测该限制酶在细菌细胞中的作用可能是 。
题组二 DNA的粗提取和鉴定
9.“DNA的粗提取和鉴定”实验的基本过程:裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A.裂解:使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离:可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀:可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定:加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
10.研究人员比较了不同储藏条件对棉叶DNA纯度及提取率(提取率越高,获得的DNA越多)的影响,实验结果如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A.利用乙二胺四乙酸二钠(EDTA)处理棉叶,能使核蛋白变性并与DNA分离
B.新鲜棉叶的DNA纯度最高,提取DNA的量也最多
C.冷冻保存3 d组的DNA提取效果优于冷鲜保存3 d
D.用二苯胺试剂鉴定,蓝色最浅的是冷冻3 d处理后提取的DNA
11.某实验小组进行“DNA的粗提取和鉴定”实验,如图为实验流程。下列相关叙述正确的是( )
取材→破碎细胞→获得滤液→去除杂质→进一步提纯→DNA鉴定
A.取材时可选用猪血、洋葱、香蕉、菜花等富含DNA的材料进行实验
B.可将洋葱置于清水中,细胞吸水破裂后将DNA释放出来
C.提纯时在滤液中加入体积是滤液两倍的冷酒精溶液会出现白色絮状物
D.DNA鉴定时可通过是否加入二苯胺试剂设置对照实验来观察实验现象
答案与分层梯度式解析
基础过关练
1.D 基因工程是指有意识地把一个人们所需要的基因转入另一个生物体中,使后者获得新的遗传性状或表达所需要产物的技术,也就是定向地改造生物的遗传性状。
2.B T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端,又可以连接平末端,具有专一性,A错误。限制酶只能切割双链DNA片段,烟草花叶病毒的核酸是RNA,故限制酶不能切割,B正确。DNA连接酶能将DNA片段连接成一个重组DNA分子,DNA聚合酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键,C错误。限制酶主要从原核生物中分离纯化而来,但是因为原核生物自身DNA经过相应的化学修饰而不会被限制酶破坏,所以限制酶不能剪切原核生物自身的DNA,D错误。
3.A DNA连接酶、DNA聚合酶和限制酶的作用部位均为磷酸二酯键,因此作用于图中a处,解旋酶作用于氢键(b),A错误。
4.C 质粒为小型环状DNA分子,存在于拟核(或细胞核)外的细胞质基质中,质粒不是酶,病毒中没有质粒,A、D错误,C正确;细菌的基因主要存在于拟核中,少量存在于质粒中,B错误。
5.C 载体要能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因,A错误;载体要具有一种或多种限制酶识别序列,以便外源基因插入其中,B错误;携带外源DNA片段的载体进入受体细胞后,能够在受体细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA进行同步复制,所以载体要对受体细胞无害,以便受体细胞能正常增殖,D错误。
6.D 切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列为GAATTC,切割产生乙的限制酶识别的核苷酸序列为CAATTG,切割产生丙的限制酶识别的核苷酸序列为CTTAAG,故甲、乙、丙黏性末端是由三种不同的限制酶切割产生的,A正确,D错误。丙所示黏性末端(TTAA)与甲、乙所示黏性末端(AATT)不同,故甲、乙在DNA连接酶的作用下可形成重组DNA分子,但甲、丙不能形成重组DNA分子,B正确。DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键,a处是磷酸二酯键,C正确。
7.D 分析DNA长度可知120=40+80=(10+30)+80,即该DNA分子为环状DNA,含有1个限制酶Ⅰ识别位点,切割得到长度为120 kb片段;含有2个限制酶Ⅱ识别位点,切割得到40 kb和80 kb两个片段;同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时,得到10 kb、80 kb和30 kb 3个片段,说明限制酶Ⅰ的识别位点位于限制酶Ⅱ切割后的40 kb片段中,D正确。
8.答案 (1)蛋白质 氨基酸 (2)GAATTC 专一 (3)中轴线 E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接 (4)切割外源DNA,起到防御作用
解析 (1)EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的化学本质是蛋白质,蛋白质是生物大分子,其单体是氨基酸。(2)分析题图1可知,EcoRⅠ限制酶的识别序列是GAATTC,SmaⅠ限制酶的识别序列是CCCGGG,EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的识别序列不相同,说明限制酶具有专一性。(3) DNA连接酶可以连接两个DNA片段,要将图1中的黏性末端再连接起来,可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶。
9.D DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,在2 mol/L的NaCl溶液中的溶解度高,根据此原理可将混合物中的多糖、蛋白质等与DNA分离,B正确;DNA钠盐不溶于酒精,而某些蛋白质溶于酒精,可以反复多次用酒精沉淀出DNA,提高DNA纯度,C正确;用二苯胺试剂鉴定DNA时,加入二苯胺试剂后经过95 ℃水浴锅加热才能呈现蓝色,D错误。
10.C 用十二烷基硫酸钠(SDS)处理棉叶,能使核蛋白变性并与DNA分离;乙二胺四乙酸二钠(EDTA)能抑制DNA酶活性,防止核DNA被酶解,A错误。结合题图可知,新鲜棉叶提取的DNA纯度最高,但提取率不是最高,因此新鲜棉叶提取DNA的量不是最多的,B错误。与冷鲜保存3 d组相比,冷冻保存3 d组提取的DNA纯度相当、DNA提取率明显较高,因此,冷冻保存3 d组的DNA提取效果优于冷鲜保存3 d,C正确。冷冻3 d处理后提取的DNA量是最多的,因此用二苯胺试剂鉴定,蓝色最深的是冷冻3 d处理后提取的DNA,D错误。
11.C 哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核,不能用猪血作DNA粗提取的实验材料,A错误;洋葱细胞是植物细胞,其细胞壁有保护和支撑的作用,不会吸水涨破,B错误;DNA不溶于95%的冷酒精,提纯时在滤液中加入体积是滤液两倍的冷酒精溶液,静置3~5 min后会出现白色絮状物(DNA),C正确;DNA鉴定时可通过是否加入DNA粗提物来设置实验组和对照组,两组都需加入二苯胺试剂观察实验现象,D错误。
8第2课时 获取目的基因、PCR技术及凝胶电泳鉴定
基础过关练
题组一 基因的结构及获取目的基因的方法
1.研究者用一个mRNA分子与包含其对应基因的基因组DNA杂交,在电子显微镜下观察到如图所示的分子杂交结果。根据实验结果推断,问号箭头所指的那段DNA最有可能属于( )
A.终止子 B.启动子
C.外显子 D.内含子
2.下图为人胰岛素基因结构模式图,下列叙述正确的是( )
A.启动子是RNA聚合酶结合的部位
B.cDNA文库和基因组文库的基因中均含有内含子
C.人胰岛α细胞的cDNA文库中可找到该基因
D.细胞内DNA复制时,只对编码区进行复制
3.在基因比较小,核苷酸序列又已知的情况下,获得该基因的最佳方法是( )
A.以4种脱氧核苷三磷酸为原料人工合成
B.用mRNA为模板逆转录合成DNA
C.从基因组文库中筛选
D.从生物材料中直接分离
4.下列关于基因文库的叙述,错误的是( )
A.同一生物不同发育阶段构建的基因组文库一般相同
B.在cDNA文库和基因组文库中,同一基因的长度不同
C.水稻基因组文库中的每个受体菌都含有水稻全部的基因
D.构建基因组文库时可使用限制酶和DNA连接酶
题组二 利用PCR技术扩增DNA片段
5.有关PCR技术,下列叙述不正确的是( )
A.是聚合酶链式反应,是在DNA聚合酶作用下,在体外扩增DNA片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷三磷酸
D.PCR过程包括多次循环,每次循环分为变性、退火、延伸3个步骤
6.以下为PCR扩增过程示意图。据图分析,下列说法正确的是( )
A.②过程发生的变化是引物与单链DNA结合
B.催化③过程的酶是DNA聚合酶,能催化形成氢键
C.在解旋酶的催化下,DNA经①过程形成2条DNA单链
D.引物的长度较短或G与C含量较低,可适当提高退火温度
7.如果要用PCR扩增以下DNA模板中的基因1,需要的一对引物(引物Ⅰ、引物Ⅱ)序列分别是( )
5'CTTCGAAATTC-基因1-TCTCCCGATCGG-基
因2-ATCCTTTGCTCT3'
A.5'-CTTCGAAATTC-3'、5'-TCTCCCGATCGG-3'
B.5'-CTTCGAAATTC-3'、5'-CCGATCGGGAGA-3'
C.5'-GAAGCTTTAAG-3'、5'-AGAGCAAAGGAT-3'
D.5'-GAAGCTTTAAG-3'、5'-CCGATCGGGAGA-3'
题组三 凝胶电泳鉴定的原理及操作
8.带电颗粒在电场作用下,向着与其电性相反的电极移动,称为电泳。下列关于电泳的叙述,正确的是( )
A.电泳中带电粒子迁移速率只与所带电荷有关
B.电泳的过程要在一定的pH下进行,所以要使用缓冲液
C.DNA片段根据长度大小在凝胶上分开,形成连续的条带
D.切断电源后即可用肉眼观察到DNA条带在凝胶上的位置
9.下列关于核酸片段的扩增及电泳鉴定的相关叙述,正确的是( )
A.PCR反应缓冲液中一般要添加ATP,以激活耐高温的DNA聚合酶
B.mRNA也是核酸,因此可直接用PCR扩增仪扩增
C.PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合
D.琼脂糖凝胶电泳中的缓冲液中含指示剂,其可以在紫外灯下被检测出来
10.为优化目的基因(700 bp)的PCR条件,研究者设计不同的退火温度进行实验,产物的琼脂糖凝胶电泳结果如下图。据图分析,下列表述错误的是( )
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板,其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.退火温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳退火温度
11.(教材习题改编)研究人员用EcoRⅠ和SmaⅠ两种限制酶处理某DNA分子,图1为EcoRⅠ切割该DNA分子后的结果;图2是酶切后的凝胶电泳图谱,其中1号泳道是DNA Marker,2号、3号、4号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理、两种酶共同处理后的电泳结果。下列相关叙述错误的是( )
图1
图2
A.据图1可知EcoRⅠ的识别序列为5'-GAATTC-3',识别位点在G和A之间
B.据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在B端,且连着电泳槽的负极
C.据图2可知该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA
D.EcoRⅠ和SmaⅠ的识别位点最短相距约200 bp
能力提升练
题组一 PCR的过程及原理
1. (经典题)下列关于PCR技术的叙述正确的是( )
A.PCR技术所用Taq DNA聚合酶能耐高温,其最适温度是95 ℃
B.一个DNA片段经PCR扩增n次后需2n个引物
C.在第2轮循环产物中开始出现目标DNA片段
D.一个DNA片段经PCR扩增n次后含目标DNA片段2n-2n
2.如图是RT-PCR过程示意图,①和②表示逆转录酶催化的逆转录过程,③表示PCR过程。据图分析下列说法错误的是( )
A.逆转录酶具有DNA聚合酶的能力
B.③过程只需要引物b
C.RT-PCR不可直接检测基因表达水平
D.RT-PCR可检测某些RNA病毒
3.PCR技术的机理模式如图所示,①②③表示DNA上的相关区段,abcd分别为引物的两端。现利用该技术扩增片段②,下列描述中正确的是( )
A.图中b、d端为5'端,a、c端为3'端
B.设计相互容易发生互补配对的甲乙两种引物,可以提高扩增效率
C.区段②中G-C碱基对的比例大小会影响到退火过程,对变性和延伸影响不大
D.扩增得到m个含有区段②的DNA分子,需要消耗m-1个引物甲
4.PCR除用于扩增目的基因外,还可以在目的基因两端添加合适的限制酶识别序列,下列叙述正确的是( )
A.该图表示PCR循环中的变性环节
B.若要在扩增产物两端加上特定的限制酶识别序列,则可在引物的3'端设计添加
C.Taq DNA聚合酶催化相邻的两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键
D.用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶识别序列的产物
题组二 凝胶电泳鉴定的应用和结果分析
5.DNA测序时,将适量待测单链DNA模板、引物、四种脱氧核苷三磷酸(用放射性同位素标记)和DNA聚合酶分为四组,每组分别加入适量ddGTP、ddATP、ddCTP、ddTTP。在子链合成中如果利用的是dNTP则延伸继续,如果利用的是ddNTP则终止延伸。分离4支试管中所有子链片段,分泳道进行电泳(其分离原理仅依据分子量大小),用放射自显影法显示后结果如图,则此片段序列为( )
A.3'-GATCCGAAT-5' B.3'-TAAGCCTAG-5'
C.3'-GGAAACCTT-5' D.3'-TTCCAAAGG-5'
答案与分层梯度式解析
基础过关练
1.D 图中问号箭头所指的那段DNA没有与mRNA的碱基互补配对,说明无编码蛋白质的功能,故最有可能是内含子。
2.A 启动子位于基因的非编码区,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动转录,A正确。内含子和外显子均会被转录成RNA,再经过切去内含子对应部位、连接外显子对应部位等RNA加工过程,形成成熟的mRNA;cDNA是以成熟mRNA为模板逆转录合成的,故cDNA文库的基因中不含内含子;而基因组文库的基因中含有内含子,B错误。人胰岛β细胞合成胰岛素;而胰岛α细胞不合成胰岛素,也就没有胰岛素基因转录出的mRNA,则在人胰岛α细胞的cDNA文库中也就找不到胰岛素基因,C错误。细胞内DNA复制时,DNA分子中所有序列均被复制,即不管是编码区还是非编码区均被复制,D错误。
3.A 在目的基因比较小,核苷酸序列已知的情况下常采用化学合成法,A正确。
4.C 同一生物不同发育阶段的DNA一般相同,mRNA会有差异,因此,同一生物不同发育阶段构建的基因组文库(利用基因组DNA构建)一般相同,cDNA文库(利用成熟mRNA逆转录构建)会有差异,A正确;cDNA是由成熟mRNA逆转录产生的,其长度比正常的基因短,B正确;水稻基因组文库中的每个受体菌只含有部分水稻基因,C错误;构建基因组文库时,首先用限制酶切割DNA和质粒,然后用DNA连接酶将两者连接起来形成重组质粒,最后将不同的DNA片段分别导入不同的受体菌群,形成基因组文库,D正确。
5.C PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行,需提供DNA模板、两种引物、4种脱氧核苷三磷酸及耐高温的Taq DNA聚合酶等,C错误。
6.A PCR扩增过程中,①为变性,利用高温使DNA解旋,不需要解旋酶的催化,C错误;②为退火,需要冷却至50~60 ℃,使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,A正确;DNA聚合酶能催化形成的是磷酸二酯键,而不是氢键,B错误;引物的长度较短或G与C含量较低,可适当缩短退火时间,D错误。
7.B 将DNA分子的另一条链补全后,可设计得到如下图所示的引物。
8.B 电泳中带电粒子迁移速率与其所带电荷、分子大小、形状等有关,A错误;电泳的过程要在一定的pH下进行,电泳缓冲液的作用是在电泳过程中维持合适的pH,B正确;DNA片段根据长度大小在凝胶上分开,形成不连续的条带,C错误;DNA本身是无色的,DNA条带在凝胶上的位置需要染色后再进行观察,D错误。
9.C PCR反应缓冲液中不需要添加ATP,A错误;mRNA不能直接用PCR扩增仪扩增,需要先逆转录为cDNA,再用PCR扩增仪扩增,B错误;凝胶中的DNA分子通过染色,可以在紫外灯下被检测出来,D错误。
10.B 实验设计应遵循对照原则与单一变量原则,故对照组可用无菌蒸馏水代替模板,其他成分相同,A正确;PCR技术中,反应最终的电泳条带的宽度、亮度与PCR扩增产物的含量呈正相关,B错误;退火温度会影响引物与模板的结合,进而影响PCR扩增产物的纯度,C正确;据图可知,58 ℃条件下条带宽度最大,故该温度是本实验中扩增该基因的最佳退火温度,D正确。
11.B 图1中DNA双链片段被切割成两段,由图1可知EcoRⅠ的识别序列是5'-GAATTC-3',断开的部位在G和A碱基之间,A正确;DNA片段长度会影响其在电泳时的迁移速率,DNA分子越大,迁移就越慢,据图2可知琼脂糖凝胶的加样孔在A端,B错误;2号、3号分别是EcoRⅠ单独处理、SmaⅠ单独处理后的电泳结果,两个泳道均只出现一种DNA片段,且碱基对数均为1 000,说明该DNA分子可能是含1 000个碱基对的环状DNA,C正确;图2中4号是EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶共同处理后的电泳结果,显示800 bp和200 bp两种条带,1 000=800+200,说明在该DNA分子中,两种限制酶的识别位点最短相距约200 bp,如图所示,D正确。
能力提升练
1.D PCR技术所用Taq DNA聚合酶能耐高温,在子链的延伸(72 ℃左右)中发挥作用,A错误;每合成一条子链需要一个引物,PCR扩增n次后有2n个DNA分子,2n+1条DNA单链,其中有两条是母链,所以经PCR扩增n次后需(2n+1-2)个引物,B错误;在第3轮循环产物中开始出现目标DNA片段,C错误;一个DNA片段扩增n次后有2n个DNA分子,目标DNA片段=2n-2n,D正确。
2.B 由题意及图示可知,逆转录酶能催化合成cDNA,即具有DNA聚合酶的能力,A正确。③表示PCR过程,需要引物a、b,B错误。RT-PCR可检测基因的转录情况,从而推知基因的表达水平,不可直接检测基因表达水平,C正确。RT-PCR过程是先由RNA逆转录得到cDNA,再以cDNA模板进行PCR扩增,故可用于检测某些RNA病毒,D正确。
3.D DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链,利用PCR技术扩增片段②,根据子链的延伸方向可知模板上的b、c端为5'端,a、d端为3'端, A错误。两种引物之间不能发生碱基互补配对,以防止引物之间结合形成双链,影响引物与DNA模板链的结合,B错误。区段②中G-C碱基对的比例越大,热稳定性越高,对变性、退火和延伸都有影响,C错误。每一条子链都以引物为起点进行延伸,故新合成的子链数=消耗的引物数;PCR体系需要两种引物,且两种引物同时使用,故消耗某种特定引物的数量=消耗的引物数/2;扩增得到m个含有区段②的DNA分子,需要消耗引物甲(2m-2)/2=m-1(个),D正确。
4.D 图中引物与模板链碱基互补配对,该图表示PCR循环中的退火环节,A错误;PCR引物的3'端碱基为结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,如图所示:
可将限制酶识别序列添加到引物的5'端,以实现在目的基因两端添加限制酶识别序列的目的,用图中引物扩增两个循环后即可获得添加限制酶识别序列的产物,B错误,D正确;延伸时,在Taq DNA聚合酶催化下,dNTP作为扩增的原料会依次连接到正在形成的子链的3'端,相邻的dNTP间形成磷酸二酯键,C错误。
归纳总结 可将限制酶识别序列添加到引物的5'端,以实现在目的基因两端添加限制酶识别序列的目的。
5.A 题图电泳图谱中出现9种不同长度的条带,说明存在9种不同长度的子链;根据电泳方向可知,从上往下DNA分子量逐渐减小,且根据题意只要ddNTP掺入链端,该链就停止延长可知,最长的子链3'端的碱基为G,依此类推,最短的子链3'端碱基为T,可得此片段序列为5'-TAAGCCTAG-3',即A正确。
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