(共15张PPT)
1.单菌落:在固体培养基上采用划线或稀释涂布的方法接种,通过培养获得的由一个细胞分裂
形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
知识点 1 目标微生物的分离和纯化
必备知识 清单破
方法 平板划线法 稀释涂布平板法
工具 接种环 涂布器
接种方法 蘸取菌液/挑取固体表面微生物→在平板上连续平行划线、扇形划线或多次连续平行划线 菌液梯度稀释→取不同稀释度菌液各0.1 mL加在平板上→涂布器均匀涂布
分离结果 在划线的尾部能得到单菌落 适当稀释度下得到单菌落
培养结果示例
用途 用于微生物的分离 用于微生物的分离、计数
2.分离微生物的方法——平板划线法和稀释涂布平板法
(1)平板划线操作的注意事项
①扇形划线接种:每划一条线都要将接种环在酒精灯的火焰上灭菌,然后再次从同一起点变
换方向划线。
②多次连续平行划线接种
a.划线可分3~4次进行,将培养皿旋转一定角度后,不需再次蘸取菌种,只需在上一次划线的末
端区域直接开始划线即可。
b.划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次从上一次划线的末端开始,能使细菌
的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
c.最后一次划线与第一次的划线不能相连的原因:如果最后一次划线与第一次划线相连,则增
加了细菌的数目,得不到纯化的效果。
③平板划线法都只用接种环蘸取一次菌液,每次划线前后都需要灼烧接种环。
(2)平板划线操作中的灼烧及其目的
项目 目的
蘸取菌液前灼烧 避免接种环上可能存在的微生物污染菌种
每次划线前灼烧 杀死上一次划线结束后接种环上残留的菌种,使下一次划线时的菌种直接来源于上一次划线的末端
划线操作结束后灼烧 及时杀死接种环上残留的菌种,避免菌种污染环境、感染操作者
1.目的要求
(1)用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用液体培养基大量扩增酵母菌。
知识点 2 接种、培养并分离酵母菌
2.方法步骤
3.结果分析
(1)与对照组相比,液体培养基由于酵母菌的增殖而变浑浊,可推断液体培养基中接种酵母菌
成功。
(2)在接种酵母菌的固体培养基上可观察到独立的菌落,这些菌落在颜色、形状和大小上相
似,酵母菌菌落一般表面光滑,多呈乳白色。
(3)若在固体培养基中观察到不同形态的菌落,原因可能是菌液不纯,混入了杂菌,或在实验操
作过程中被杂菌污染。
1.稀释涂布平板法
(1)减小误差的方法
①保证能准确计数的前提下减小稀释度。
②将相同稀释度下的多组数值取平均值后再进行计算。
(2)计算公式
知识点 3 微生物数量的测定
2.显微镜计数法
特别提醒
(1)显微镜计数中,先盖片再滴液。
(2)计算过程中,大方格内的液体体积=1 mm 2(大方格面积)×0.1 mm (中央平台深度)=0.1 mm3。
1. 选择培养基
(1)概念:在培养基中添加(或减去)某种化学成分,使得只有某些特定的微生物能够生长,其他
微生物均不能生长,这样的培养基称为选择培养基。
(2)用途:快速筛选出目标微生物或特定细胞。
知识拓展 选择培养基和鉴别培养基
(1)选择培养基:“选择所需,淘汰不需”。
(2)鉴别培养基:“鉴定所需”,其他非目标微生物也可以生长,但目标微生物会发生特征性的变化。
知识点 4 微生物的选择培养
2.能分解尿素的微生物的分离与计数
(1)实验原理
①当培养基中只有尿素作为氮源时,只有能分泌脲酶的微生物才能在该培养基中生长。
②微生物分解尿素产生的氨会使培养基的碱性增强,可利用酚红指示剂鉴定尿素分解菌。
③尿素分解菌菌落周围呈红色,在相同培养条件下,红色区域越大,微生物利用尿素的能力越强。
(2)方法步骤
知识辨析
1.与平板划线法相比,稀释涂布平板法分散细菌得到单菌落的效果更好。这种说法正确吗
正确。利用平板划线法在划线的尾部能得到单菌落;而在合适的稀释倍数下,涂布的平板中可得到更多的单菌落。
2.在酵母菌的分离和培养过程中,某同学观察到表面光滑、呈乳白色的菌落,能不能认定分离
出了酵母菌
不能。不能仅从菌落特征进行认定,还应利用显微镜观察等进一步鉴定。
3.利用稀释涂布平板法统计细菌数目时,统计的菌落数往往比活菌的实际数目高。这种说法
正确吗
不正确。当两个或多个细胞连在一起时,繁殖后形成一个菌落,因此稀释涂布平板法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。
提示
提示
提示
4.以尿素作为唯一氮源的培养基中分离出的微生物一定都是能分解尿素的微生物吗
不一定。以尿素为唯一氮源的培养基上有些微生物可能是自生固氮微生物,不一定都是能分解尿素的微生物。
5.相同稀释度下,尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基的多。这种说法正确吗
不正确。LB固体培养基为全营养培养基,可允许多种微生物生长,尿素固体培养基为选择
培养基,可淘汰不能以尿素为氮源也不能固氮的微生物,因此相同稀释度下,尿素固体培养基的菌落数比LB固体培养基的少。
提示
提示
定点 微生物培养中的对照分析
关键能力 定点破
培养未接种的培养基 全营养培养基接种
目的 检查培养基制备是否合格 检测选择培养基是否有选择作用
结果 分析 未接种的培养基表面若有菌落生长,则说明培养基被污染,应该重新制备;若无菌落生长,则说明培养基未被污染 选择培养基上的菌落数<全营养培养基上的菌落数→选择培养基有选择作用;
选择培养基上的菌落数=全营养培养基上的菌落数→选择培养基无选择作用第二节 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得
基础过关练
题组一 微生物的分离和纯化
1.在分离、纯化细菌的实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如下图,a、b、c、d是划线的四个区域。下列有关叙述错误的是( )
A.操作过程中,接种环蘸取菌液1次,至少需灼烧5次
B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
C.蘸取菌液和划线要在酒精灯火焰旁进行
D.图甲中的a区域为划线的起始区域
2.已知酸奶中的有益菌主要是乳酸菌,要进一步分离、纯化乳酸菌,采用下图所示的划线分离操作最容易得到单菌落的是( )
A B C D
3.稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列说法错误的是( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
4.做“微生物的分离与培养”实验时,下列叙述正确的是( )
A.高压灭菌加热结束时,打开排气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖
B.倒平板时,应将打开的皿盖放到一边,以免培养基溅到皿盖上
C.用记号笔标记培养皿时,应标记在皿底上
D.为保证无菌操作,接种针、接种环使用前都必须高压蒸汽灭菌
题组二 微生物数量的测定
5.在对葡萄酒酵母进行鉴定、优选时,需要对酵母菌进行计数,下列说法错误的是( )
A.可以用显微镜直接计数,需要血细胞计数板,但数据可能偏大
B.也可以使用平板划线法计数,但数据可能偏小
C.用血细胞计数板计数时,如果视野中细胞数太多可以稀释后再计数
D.无论用哪种方法计数,都必须多次计数求平均值
6.下列关于教材中用显微镜计数法测定酵母菌的数量的叙述,正确的是( )
A.对于压在方格边缘线上的酵母菌的处理方法是计数四条边及其顶角的酵母菌数
B.对酵母菌计数时,用滴管吸取静置的培养液滴满血细胞计数板的方格区
C.若血细胞计数板的大方格体积为2 mm×2 mm×0.1 mm,加入稀释10倍的培养液后镜检,大方格内酵母菌数为M,则10 mL培养液中酵母菌的总数约为2.5M×105
D.某同学按对角线方位计数5个中方格菌数分别为10、11、8、10、9,估算每一小方格的酵母菌数是0.48
7.丙草胺(C17H26ClNO2)是一种广泛应用的除草剂,能抑制土壤细菌、放线菌和真菌的生长。某研究小组从某地土壤中分离获得能有效降解丙草胺的细菌菌株,并对其计数(如图所示),以期为修复土壤污染提供微生物资源。下列有关叙述错误的是( )
A.利用该方法计数结果往往比显微镜直接计数法小
B.将培养基调至酸性时,有利于降解菌的生长繁殖
C.使用以丙草胺为唯一氮源的培养基进行培养可提高降解菌的浓度
D.5号试管的结果表明每克土壤中有1.7×109个菌株
题组三 能分解尿素的微生物的分离与计数
8.常利用尿素固体培养基的选择作用,对土壤中分解尿素的细菌进行分离和计数,下列叙述正确的是( )
A.分解尿素的细菌以尿素的分解产物CO2作为碳源
B.尿素固体培养基的平板中只有少数肉眼可见的菌体
C.脲酶需要经过内质网和高尔基体的加工后,才具有生物学活性
D.本实验采用的接种方法是稀释涂布平板法,涂布不均匀会导致实验结果偏小
9.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌,实验过程如下,请回答下列问题:
土样→土壤浸出液→稀释→接种→培养、观察
(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌,将土壤用 进行一系列的梯度稀释,同一浓度的土壤稀释液应至少涂布 个平板。
(2)向培养基中添加尿素的方法是待其他成分灭菌冷却至60 ℃时,加入尿素溶液,而该尿素溶液要事先用 过滤,使之无菌。对照组配制的是通用细菌培养基,称为 培养基。配制时除了加入特定的营养物质以外,还要加入一定量的氯化钠,以维持 。对培养基酸碱度的调节,应该在高压蒸汽灭菌过程的 (填“前面”或“后面”)。
(3)接种后的培养皿 于37 ℃的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌,其菌落周围会出现红色区域,这是由于尿素被分解产生氨,氨与该培养基中的 产生颜色变化,从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是 (填字母)。
A.称取葡萄糖、琼脂等培养基成分
B.倒平板
C.涂布平板
D.微生物的培养
能力提升练
题组 微生物的选择培养及计数
1.物质W是一种含氮有机物,物质W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明。某小组欲从土壤中筛选出能降解物质W的细菌,得到甲、乙两种菌落,结果如图。下列说法错误的是( )
A.透明圈的形成是因为物质W被分解
B.所用的选择培养基应该以物质W为唯一氮源
C.甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源
D.乙菌落中的细菌都能降解物质W,不需要进一步纯化
2.纸片扩散法是药敏试验中一种常用的方法。取少量大肠杆菌的培养液,均匀涂在培养皿内的培养基上,再放上4片含有链霉素(抗生素的一种)的圆形滤纸,然后在无菌适宜条件下培养12~16 h,滤纸片周围出现抑制大肠杆菌生长的环圈(简称抑菌圈,见下图)。下列相关叙述错误的是( )
图1 图2
图3
A.图1中的培养基需冷却至60 ℃左右时再倒平板,该操作需要在酒精灯火焰旁完成
B.图2中所示培养基的放置方式,能防止水分过快蒸发和冷凝水珠冲散菌落
C.图3培养皿上大肠杆菌的接种方式为涂布平板法,Ⅳ号纸片上抗生素浓度最低
D.图3所示的抑菌圈内出现大肠杆菌菌落的原因是部分微生物发生了基因突变
3.化学需氧量(COD)是衡量污水中有机污染物含量的重要指标。从某污水处理系统中分离出多种细菌,经分离筛选获得具有高效降低COD能力的菌株,过程如图所示。下列相关说法正确的是( )
A.可用显微镜计数法统计菌液中的细菌数目来确定接种时菌液的最佳稀释倍数
B.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基时,需在倒平板后进行灭菌操作
C.由菌落分布情况可知,在该固体培养基上接种的方法是平板划线法
D.挑取单菌落后接种到液体培养基中培养,目的是纯化菌株
4.随着社会的发展,石油产品的使用越来越多,石油烃污染也越来越严重。为了筛选出分解石油烃能力更强的微生物,人们不断地进行研究。请回答与此筛选过程有关的问题:
(1)一般来说,微生物生长过程中需要的营养物质包括 源、 源、水、无机盐等。
(2)分解石油烃的微生物一般要从土壤中分离,获取土壤样品的取样地点最好选在 。如图为获取土壤样品后的培养研究过程。
①为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程A~D所用培养基,其成分的特点是 ,从而有利于 的生长,抑制其他生物的生长。
②过程D中的培养基从物理特征看属于 培养基,这可以通过往培养基中加入一定量的 来实现,过程D采用 法接种以用于活菌计数。该计数方法得到的值通常比显微镜计数法的结果
(填“高”“低”或“一样”)。若研究人员用另一种接种方法在培养基表面划线4个区域,则需要蘸取菌液 次,接种环共需要灼烧 次。
③若发现在E中无法区分菌落,可以将C中取出的菌液 。
(3)在实验室应采用 法对培养基进行灭菌,处理时间通常为高压灭菌锅温度达到 时开始计时15~20分钟。在整个微生物的分离和培养中,一定要注意在 条件下进行。
5.经人工诱变后,部分细菌由于某种酶被破坏,其细胞中某些化学反应不能正常进行,就形成了营养缺陷型菌株,这在工业生产上有较广阔的应用前景。以下是实验人员利用影印法初检某种氨基酸缺陷型菌株的过程,请回答下列问题:
(1)培养基的灭菌方法一般为 。
过程①的接种方法是 。
(2)根据用途分类,图中基本培养基属于 (填“选择”或“鉴别”)培养基。
(3)进行过程②时,应先将丝绒布转印至 (填“基本”或“完全”)培养基上,原因是 。
(4)利用影印法培养的优点是不同培养基中同种菌株的接种位置相同,为了完成对初检的营养缺陷型菌株的鉴定,实验人员应挑取 (填“菌落A”或“菌落B”)进行接种培养,并进一步鉴定。
(5)科研人员用放射线处理目的菌获得两个突变株C和D,然后对突变株C和D进行实验,结果如表所示。
接种的菌种 一般培养基 实验处理及结果
C 不生长 添加营养物质甲,能生长
D 不生长 添加营养物质乙,能生长
C+D 能生长 不添加营养物质甲、乙,都能生长
突变株C不能在一般培养基上生长的原因最可能是 。将突变株C和D混合在一起,接种于一般培养基上,都能生长的最可能的原因是 。
答案与分层梯度式解析
基础过关练
1.D 平板划线法中每次划线前和划线结束后都要灼烧接种环,题图所示操作过程中,接种环蘸取菌液1次,划线4次,至少需灼烧5次,A正确。连续划线可以将聚集的菌种逐步稀释,以便获得单菌落,B正确。为了防止空气中杂菌的污染,蘸取菌液和划线都要在酒精灯火焰旁进行,C正确。分析图乙,d区域对应位置菌落最多,因此d区域为划线的起始区域,D错误。
2.B 连续平行划线不容易得到由单个细胞生长繁殖而来的单菌落,A不符合题意。多次连续平行划线时,只需要蘸取菌种一次,且在一次划线结束后,需将接种环在酒精灯的火焰上灼烧灭菌后再划线,划线需从上一次划线末端区域开始,可以使菌种稀释分散,容易得到由单个细胞生长繁殖而来的单菌落,B符合题意,C、D不符合题意。
3.C 不同稀释度的菌液接种后,只有稀释度适当的菌液里聚集在一起的微生物才能分散成单个细胞,从而能够在固体培养基表面形成单个菌落;如果稀释度过低,将不会形成单个菌落;如果稀释度过高,可能没有菌落生成,C错误。
4.C 高压灭菌加热结束时,等待压力表指针回到零后,才能开启锅盖,而不能打开排气阀使压力表指针回到零,A错误;倒平板时,用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,将培养基倒入培养皿后,立即盖上皿盖,而不能完全打开皿盖,防止培养基被杂菌污染,B错误;微生物培养时培养皿要倒置放置,用记号笔标记培养皿时,应标记在皿底上,C正确;接种针、接种环使用前可用酒精灯灼烧灭菌,D错误。
5.B 可以用显微镜直接对酵母菌进行计数,需要血细胞计数板,由于不能区分死菌和活菌,会导致数据可能偏大,A正确。平板划线法不能用来计数,B错误。无论用哪种方法计数,都必须多次计数求平均值,减小实验误差,D正确。
6.C 对于压在一个方格边缘上的酵母菌的处理方法是计数相邻两边及其顶角上的酵母菌数,A错误;对酵母菌计数时,用滴管吸取振荡均匀的培养液滴满血细胞计数板的方格区,B错误;血细胞计数板的大方格体积=2×2×0.1=0.4(mm3),其中酵母菌数为M,则10 mL培养液中酵母菌数=M÷0.4×1 000×10×10=2.5M×105,C正确;某同学按对角线方位计数5个中方格(血细胞计数板规格为25×16,即每个中方格有16个小方格)菌数分别为10、11、8、10、9,估算每一小方格的酵母菌数=(10+11+8+10+9)÷5÷16=0.6,D错误。
7.B 图中利用的计数方法是稀释涂布平板法,只能计算活菌数目,显微镜直接计数法不能区分活、死菌,因此利用稀释涂布平板法计数结果往往比显微镜直接计数法小,A正确。细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长,故将培养基调至中性偏碱时,有利于降解菌的生长繁殖,B错误。以丙草胺为唯一氮源的培养基中只有降解丙草胺的细菌才能生长,其他微生物生长受到抑制,故用该培养基进行培养可提高降解菌的浓度,C正确。由题图可知,5号试管的稀释倍数为106,则5号试管的结果表明每克土壤中有(168+175+167)÷3÷0.1×106=1.7×109(个)菌株,D正确。
8.D 分解尿素的细菌是异养型细菌,不能利用CO2,A错误;菌体需要用光学显微镜才能看到,尿素固体培养基的平板中只有少数肉眼可见的菌落,B错误;细菌没有内质网和高尔基体,但是能分泌有活性的脲酶,C错误;稀释涂布平板法可以用于计数,涂布不均匀会导致菌落重叠,导致实验结果偏小,D正确。
易错分析 区别菌体和菌落
菌体即微生物细胞本身,肉眼不可见;菌落是微生物在固体培养基上繁殖所得的子细胞群体,肉眼可见。
9.答案 (1)无菌水 3 (2)G6玻璃砂漏斗 LB固体 渗透压 前面 (3)倒置 酚红指示剂 (4)B、C
解析 (2)尿素受热会分解,故采用无菌的G6玻璃砂漏斗过滤除菌。配制培养基时需要加入一定量的氯化钠,以维持渗透压。制备培养基时,应该先调pH再灭菌。(3)培养过程中需要将平板倒置,可防止皿盖上的水落入培养基造成污染。分泌脲酶的微生物在分解尿素的过程中产生了使pH升高的物质氨,氨与该培养基中的酚红指示剂(酸性情况下呈黄色,碱性情况下呈红色)可发生颜色变化。若培养基中某菌落周围出现红色区域,可证明这一菌株能分泌脲酶,以尿素为氮源,该菌落即目标菌落。(4)酒精灯火焰旁为无菌区,为了避免杂菌污染,很多操作需要在该区域进行。称取葡萄糖、琼脂等培养基成分,不需要在酒精灯火焰旁操作,因为该过程之后,还需要对培养基进行高压蒸汽灭菌,A不符合题意;倒平板操作在培养基灭菌之后进行,需要在酒精灯火焰旁进行,B符合题意;涂布平板过程为接种过程,接种过程需要在酒精灯火焰旁进行,C符合题意;微生物的培养需要在培养箱中进行,不需要在酒精灯火焰旁进行,D不符合题意。
能力提升练
1.D 物质W在培养基中达到一定量时培养基表现为不透明,因此透明圈的形成是因为物质W被分解,A正确;要筛选出能降解物质W的细菌,所用的选择培养基应该以物质W为唯一氮源,B正确;该培养基以物质W为唯一氮源,而甲菌落周围未出现透明圈(物质W未被分解),因此甲菌落中的细菌可能是利用空气中的氮气作为氮源,C正确;乙菌落中的细菌不一定都能降解物质W,因此仍需要进一步纯化,D错误。
2.C 对培养基进行灭菌后需冷却至60 ℃左右再倒平板,倒平板时应在酒精灯火焰旁进行,A正确;接种后的培养基需要倒置放置,这样可以防止培养基中水分过快蒸发,同时可以防止冷凝形成的水珠冲散菌落,B正确;分析图3如下:
根据以上分析,C错误,D正确。
3.A 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基时,需在灭菌操作后进行倒平板,B错误;由题图可知,菌落在固体培养基上分布较均匀,故接种方法是稀释涂布平板法,C错误;挑取单菌落后接种到液体培养基中培养,目的是增大菌株的数量(扩大培养),D错误。
4.答案 (1)碳 氮 (2)石油污染明显处 只含石油烃一种碳源 目的菌(或分解石油烃的微生物) 固体 琼脂 稀释涂布平板 低 1 5 进行梯度稀释 (3)高压蒸汽灭菌 121 ℃(1 kg/cm2压力) 无菌
解析 (2)结合题干“为了筛选出分解石油烃能力更强的微生物”可知,获取土壤样品的取样地点最好选在石油污染明显处。①为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程A~D所用培养基为选择培养基,能够让分解石油烃的微生物生存,故其成分的特点是只含石油烃一种碳源,从而有利于目的菌(或分解石油烃的微生物)的生长,抑制其他微生物的生长。②过程D中的培养基可以使得菌落在其上生长,从物理特征看属于固体培养基,这可以通过往培养基中加入一定量的琼脂来实现。过程D采用稀释涂布平板法接种以用于活菌计数,但是该方法得到的值通常比显微镜计数法的结果低,因为显微镜计数法统计的是死菌和活菌的总和,并且利用稀释涂布平板法接种得到的菌落,有时候两个或多个菌落连在一起,导致计数时也算为一个菌落。平板划线法只需要蘸取菌液1次,后通过划线将其分离培养,在培养基表面划线4个区域,接种环共需要灼烧5次(每次划线前需要灼烧一次,划线结束后需要灼烧一次)。③若发现在E中无法区分菌落,说明菌落太密集,稀释度不够,可以将C中取出的菌液重新进行梯度稀释。
5.答案 (1)高压蒸汽灭菌法 稀释涂布平板法 (2)选择 (3)基本 防止基本培养基中混入特定氨基酸 (4)菌落A (5)突变株C缺乏合成营养物质甲所需要的酶 突变株D可以提供突变株C生长需要的营养物质甲;突变株C可以提供突变株D生长需要的营养物质乙
解析 (1)培养基灭菌的常用方法是高压蒸汽灭菌法。过程①导致菌落均匀分布,因此该接种方法为稀释涂布平板法。(2)氨基酸缺陷型菌株不能在基本培养基中生长,根据用途分类,图中基本培养基属于选择培养基。(3)(4)比较基本培养基和完全培养基如图:
进行过程②时,为防止特定氨基酸混入基本培养基中,应先将丝绒布转印至基本培养基上。菌落A为氨基酸缺陷型菌株,因此需要挑取菌落A进行接种培养,并进一步鉴定。
(5)分析实验结果如下表。
15
