3.1.1 重组DNA技术的基本工具 高中生物人教版（2019）选择性必修3课件(共46张PPT)
文档属性
| 名称 | 3.1.1 重组DNA技术的基本工具 高中生物人教版（2019）选择性必修3课件(共46张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 83.8MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-07-14 18:38:23 | ||
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文档简介
(共46张PPT)
第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第一课时）
学习目标：
1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3.进行DNA的粗提取与鉴定。
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因（DNA）
分子水平
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
操作对象
结 果
操作水平
原 理
意 义
水母的绿色荧光蛋白基因
基因工程
P67
基因重组（广义上）
问题1：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；
②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
③都遵循碱基互补配对原则
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
DNA平面结构
DNA立体结构
基因工程
拼接的基础
问题2：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①基因是控制生物性状的独立遗传单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程
表达的基础
基因工程的诞生和发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
P68-69
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
问题:解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜
P70
从社会中来
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
从社会中来
P70
在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。
能识别 的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
限制酶
1.来源：
2.种类：
主要来自原核生物
数千种
（限制酶不是一种酶，
而是一类酶)
3.作用特点：
专一性
作用部位
双链DNA分子
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-1
1’
2’
3’
4’
5’
C
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
G
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-1
作用部位
旁栏思考：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71）
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
4.限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
EcoR Ⅰ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
Sma Ⅰ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）
中分离出的第一个限制酶。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P72-资料卡
大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，
也有少数限制酶的识别序列由 个、 个或其他数量的核苷酸组成
6
4
8
【思考】观察以上限制酶识别的序列，有什么特点？
△以上序列都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是
的，这就是回文序列。
反向对称重复排列
注：限制酶特异性识别和切割的部位基本都具有回文序列：
即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。
5.识别序列：
限制酶 Bam H Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ TaqⅠ
识别序列及切割位点 GGATCC CCTAGG AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG TCGA
AGCT
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-2
【资料1】EcoRⅠ只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
中心轴线
黏性末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，
产生的是黏性末端。（指切口伸出的单链核苷酸序列，它们之间正好互补配对）
①产生黏性末端
6.切割结果
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71 图3-3
【资料2】SmaⅠ只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，
产生的是平末端。（指平整的切口）
中心轴线
平末端
②产生平末端
6.切割结果
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71 图3-3
【资料3】某生物DNA片段：
5’-TCCTAGAATTCTCGG……TATGAATTCCATAC-3’
3’-AGGATCTTAAGAGCC……ATACTTAAGGTATG-5’
目的基因
100个碱基对↑
要切两个切口，产生四个黏性末端，产生四个游离的磷酸基团。
若要想获得某个特定性状的基因(目的基因)必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？产生几个游离的磷酸基团？
思考
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ_______ EcoRⅠ______ HindⅢ________ BglⅡ______
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？
不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。
②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。比如BamHⅠ、BglⅡ
-G
-CCTAG
-G
-CTTAA
-A
-TTCGA
-A
-TCTAG
针 对 训 练
同尾酶
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
2.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC
CTTAAG
B．GGGGCCCC
CCCCGGGG
C．CTGCAG
GACGTC
D．CTAAATC
GATTTAG
D
3.下侧黏性末端是由______种限制酶作用产生的。
3
4.下列黏性末端属于由同种限制酶切割而成的是( )
① ②
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
③
④
倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割
B
针 对 训 练
如果要将两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
产生相同的黏性末端
01
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
缺口怎么办？
思考
2.作用：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
5′
3′
T
A
C
G
T
A
C
T
G
A
A
T
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
5′
3′
C
G
C
G
C
G
切口
切口
切口
C
T
5′
3′
5′
3′
T
A
G
C
A
G
A
T
T
A
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
将两个双链DNA片段“连接”起来的酶
1.概念：
注意：
1.DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单DNA!
2.DNA连接酶作用没有特异性。
3.不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
P72-1
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
T4 DNA
连接酶
T4 DNA
连接酶
E.coli
DNA连接酶
3. 种类：
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 缝合__________和_______ 缝合__________和__________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
平末端
E.coli
DNA连接酶
但E.coli DNA连接酶连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
P72-1
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
思考
注：DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
P72
问题: DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
两个游离的DNA片段之间
将游离的脱氧核苷酸连接到已有DNA片段
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA（水解）酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育
新品种( )
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
√
×
×
限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
×
针 对 训 练
1．如图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( )
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
D
3种，①④是同一种限制酶切割形成的，×；
识别GAATTC，×；
CTTAAG
DNA连接酶，×；
针 对 训 练
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，
错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
A
DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，不是任意，×；
针 对 训 练
3．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
针 对 训 练
4．根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
针 对 训 练
为什么需要载体？直接将目的基因导入受体细胞可以吗？
不行
第一：外源基因不能自己进入细胞，需要载体帮忙。
第二：即便能直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在，需要载体帮忙。
第三：载体带有标记基因（如抗生素抗性基因），可以帮助科学家找到成功接收外源基因的细胞。
P72-2
将 送入受体细胞；在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
种类 用途 不同点
将外源基因导入细菌（大肠杆菌）等受体细胞 不同，
在 、 、 .
以及可以插入 的
大小也有很大差别。
将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 噬菌体、
植物病毒
动物病毒
来源
大小
结构
复制方式
外源DNA片段
质粒
注：最常用的载体是质粒
外源基因
1.作用：
2.种类：
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
P73-1
最常用的载体——质粒
（1）化学本质：
是一种 的、结构简单、
独立于 或 之外，并具有 能力的 。
（2）基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过 的。
真核细胞细胞核
环状双链DNA分子
原核细胞拟核DNA
裸露
人工改造
自我复制
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
P72-2
最常用的载体——质粒
（3）作为载体所具备的条件及原因：
①具有一个至多个 切割位点；
供外源DNA片段(基因)插入其中。
②能在受体细胞中进行 ，或整合到
受体DNA上，随受体DNA_________ ;
③具有特殊的 ;
便于重组DNA分子的筛选。
④对受体细胞无 作用.
避免受体细胞受到损伤。
限制酶
自我复制
标记基因
同步复制
毒害
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量。
常见的标记基因：①抗性基因;②发光基因;③产物具有颜色反应的基因.
P72-2
最常用的载体—质粒
思考
提示：当质粒(载体)上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。
则 的受体细胞不具有标记基因控制的性状，
的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，
的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。
这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒
的受体细胞。
未导入
导入
导入
没有导入质粒
导入普通质粒
导入重组质粒
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
质粒(载体)不一定能成功导入受体细胞，导入载体细胞不一定含目的基因。如何筛选含目的基因细胞
P72-2
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体( )
(3)载体(如质粒)和细胞膜上的载体蛋白的成分相同( )
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( )
×
√
×
DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，
载体不属于工具酶。
抗生素抗性基因。
载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜上的载体的主要成分是蛋白质。
×
针 对 训 练
1.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上
才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
D
质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，×；
并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点，×；
可以在细胞内自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上后复制，×；
针 对 训 练
P73思考·讨论—重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
目的基因
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。产生相同末端，便于连接。
问题：目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？
问题：选择限制酶切割位点的基本原则？
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对
如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
P73思考·讨论—重组DNA分子
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
思考
【资料】识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
限制酶 识别序列 产生的黏性末端
Spe Ⅰ TCTAGA CTAG-
Xba Ⅰ ACTAGT CTAG-
提示：同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围 。
例如，我们选择了用SpeⅠ限制酶切割载体，如果目的基因的中刚好含有TCTAGA序列中，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被 ；这时可以考虑用合适的同尾酶 (目的基因的核苷酸序列中没有ACTAGT)来获取目的基因。
扩大
切断
XbaⅠ
P73思考·讨论—重组DNA分子
1．某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的
培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
a×
a×
a√
b×
b√
b×
针 对 训 练
1．正确的一组是( )
A
A．①是c； ②是b； ③是a
B．①是a和b； ②是a； ③是b
C．①是a和b； ②是b； ③是a
D．①是c； ②是a； ③是b
针 对 训 练
2.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoRⅠ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
2
3
5
能切下目的基因且不破坏目的基因
（4）选择限制酶切割目的基因的基本原则
是： 。
针 对 训 练
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
重组DNA技术的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
（第一课时）
学习目标：
1.简述重组DNA技术所需的三种基本工具及其作用。
2.认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。
3.进行DNA的粗提取与鉴定。
基因工程
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组DNA技术。
基因（DNA）
分子水平
创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
操作对象
结 果
操作水平
原 理
意 义
水母的绿色荧光蛋白基因
基因工程
P67
基因重组（广义上）
问题1：为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
①DNA分子的基本组成单位相同，都是4种脱氧核苷酸；
②空间结构相同，都是规则的双螺旋结构。
③都遵循碱基互补配对原则
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
DNA平面结构
DNA立体结构
基因工程
拼接的基础
问题2：为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
①基因是控制生物性状的独立遗传单位。
②遗传信息的传递都遵循中心法则。
③生物界共用一套遗传密码。
相同的遗传信息在不同生物体内表达出相同的蛋白质。
基因工程
表达的基础
基因工程的诞生和发展历程
1944年艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物个体间转移。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。截至1966年，64个密码子均被破译成功。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）
1972年，伯格首先在体外进行了DNA的改造，成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。基因工程药物成为世界各国研究和投资开发的热点。
1953年沃森和克里克建立DNA双螺旋结构模型并提出了遗传物质自我复制的假说。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
1973年，科学家证明了质粒可以作为基因工程的载体，并实现了物种间的基因交流。至此，基因工程正式问世。
1985年，穆里斯等人发明PCR,为获取目的基因提供了有效手段。
P68-69
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
问题:解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
转基因番木瓜
P70
从社会中来
“分子手术刀”
准确切割DNA分子
“分子缝合针”
“分子运输车”
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
从社会中来
P70
在培育转基因番木瓜时，首先要在体外对含有所需要基因的DNA分子进行“切割”、改造和“拼接”；然后，将重组DNA分子导入番木瓜体细胞内，并使其在细胞中表达。实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即准确切割DNA分子的“分子手术刀”、将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”和将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”。
能识别 的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
切割DNA分子的工具是限制性内切核酸酶，又称 。
限制酶
1.来源：
2.种类：
主要来自原核生物
数千种
（限制酶不是一种酶，
而是一类酶)
3.作用特点：
专一性
作用部位
双链DNA分子
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-1
1’
2’
3’
4’
5’
C
限制酶
1’
2’
3’
4’
5’
G
磷酸二酯键
T
G
C
C
G
T
A
A
5'
3'
5'
3'
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-1
作用部位
旁栏思考：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？（P71）
原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
4.限制酶的命名
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
EcoR Ⅰ：大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶；
Sma Ⅰ：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）
中分离出的第一个限制酶。
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P72-资料卡
大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，
也有少数限制酶的识别序列由 个、 个或其他数量的核苷酸组成
6
4
8
【思考】观察以上限制酶识别的序列，有什么特点？
△以上序列都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是
的，这就是回文序列。
反向对称重复排列
注：限制酶特异性识别和切割的部位基本都具有回文序列：
即在切割部位，一条链正向读的碱基顺序，与另一条链反向读的顺序完全一致。
5.识别序列：
限制酶 Bam H Ⅰ Hind Ⅲ EcoRⅠ TaqⅠ
识别序列及切割位点 GGATCC CCTAGG AAGCTT TTCGAA GAATTC CTTAAG TCGA
AGCT
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71-2
【资料1】EcoRⅠ只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
中心轴线
黏性末端
当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，
产生的是黏性末端。（指切口伸出的单链核苷酸序列，它们之间正好互补配对）
①产生黏性末端
6.切割结果
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71 图3-3
【资料2】SmaⅠ只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。
当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，
产生的是平末端。（指平整的切口）
中心轴线
平末端
②产生平末端
6.切割结果
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
P71 图3-3
【资料3】某生物DNA片段：
5’-TCCTAGAATTCTCGG……TATGAATTCCATAC-3’
3’-AGGATCTTAAGAGCC……ATACTTAAGGTATG-5’
目的基因
100个碱基对↑
要切两个切口，产生四个黏性末端，产生四个游离的磷酸基团。
若要想获得某个特定性状的基因(目的基因)必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？产生几个游离的磷酸基团？
思考
一、限制性内切核酸酶—“分子手术刀”
1.写出下列限制酶切割形成的黏性末端
BamHⅠ_______ EcoRⅠ______ HindⅢ________ BglⅡ______
思考：同种限制酶切割的黏性末端一定相同吗？
不同种限制酶切出的黏性末端一定不同吗？
①不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端都相同。
②不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端。比如BamHⅠ、BglⅡ
-G
-CCTAG
-G
-CTTAA
-A
-TTCGA
-A
-TCTAG
针 对 训 练
同尾酶
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
2.下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（ ）
A．GAATTC
CTTAAG
B．GGGGCCCC
CCCCGGGG
C．CTGCAG
GACGTC
D．CTAAATC
GATTTAG
D
3.下侧黏性末端是由______种限制酶作用产生的。
3
4.下列黏性末端属于由同种限制酶切割而成的是( )
① ②
A.①② B.①③ C.①④ D.②③
③
④
倒转180°，完全相同则为同一种限制酶切割
B
针 对 训 练
如果要将两种来源不同的DNA进行重组，应该怎样处理？
G A A T T C
C T T A A G
G A A T T C
C T T A A G
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
用同种限制酶切割(EcoRⅠ)
产生相同的黏性末端
01
G
C T T A A
A A T T C
G
G
C T T A A
A A T T C
G
缺口怎么办？
思考
2.作用：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
5′
3′
T
A
C
G
T
A
C
T
G
A
A
T
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
5′
3′
C
G
C
G
C
G
切口
切口
切口
C
T
5′
3′
5′
3′
T
A
G
C
A
G
A
T
T
A
5′
3′
5′
3′
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
C
G
将两个双链DNA片段“连接”起来的酶
1.概念：
注意：
1.DNA连接酶可连接双链DNA中的两条单链缺口，但不能连接单DNA!
2.DNA连接酶作用没有特异性。
3.不是连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
二、DNA连接酶 —“分子缝合针”
P72-1
5′
5′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
3′
3′
5′
5′
5′
5′
5′
5′
T4 DNA
连接酶
T4 DNA
连接酶
E.coli
DNA连接酶
3. 种类：
类型 E.coli DNA连接酶 T4 DNA连接酶
来源
功能 缝合__________和_______ 缝合__________和__________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
平末端
E.coli
DNA连接酶
但E.coli DNA连接酶连接平末端效率远低于T4 DNA连接酶
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
P72-1
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
思考
注：DNA聚合酶只能将单个核苷酸连接到已有的核苷酸链上，形成磷酸二酯键。
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
P72
问题: DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
两个游离的DNA片段之间
将游离的脱氧核苷酸连接到已有DNA片段
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
DNA连接酶、限制酶、 DNA聚合酶、解旋酶、DNA酶的比较
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶 DNA（水解）酶
作用部位
作用对象
作用结果
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
氢键
DNA片段
DNA
单个的脱氧
核苷酸
DNA
DNA
将两个DNA片段连接成完整的DNA分子
切割双链DNA分子
将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链
二、DNA连接酶—“分子缝合针”
(1)基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育
新品种( )
(2)限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列( )
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来( )
(4)限制酶和解旋酶的作用部位相同( )
√
×
×
限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
×
针 对 训 练
1．如图是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( )
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
D
3种，①④是同一种限制酶切割形成的，×；
识别GAATTC，×；
CTTAAG
DNA连接酶，×；
针 对 训 练
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，
错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
A
DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，不是任意，×；
针 对 训 练
3．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
针 对 训 练
4．根据所学知识，完成以下填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶
b
a
A.切断a处的酶为_______
B.连接a处的酶为_______
C.切断b处的酶为_______
①
③④
②
针 对 训 练
为什么需要载体？直接将目的基因导入受体细胞可以吗？
不行
第一：外源基因不能自己进入细胞，需要载体帮忙。
第二：即便能直接把外源基因导入受体细胞，外源基因在细胞内不能进行复制、转录和稳定存在，需要载体帮忙。
第三：载体带有标记基因（如抗生素抗性基因），可以帮助科学家找到成功接收外源基因的细胞。
P72-2
将 送入受体细胞；在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
种类 用途 不同点
将外源基因导入细菌（大肠杆菌）等受体细胞 不同，
在 、 、 .
以及可以插入 的
大小也有很大差别。
将外源基因导入植物细胞 将外源基因导入动物细胞 噬菌体、
植物病毒
动物病毒
来源
大小
结构
复制方式
外源DNA片段
质粒
注：最常用的载体是质粒
外源基因
1.作用：
2.种类：
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
P73-1
最常用的载体——质粒
（1）化学本质：
是一种 的、结构简单、
独立于 或 之外，并具有 能力的 。
（2）基因工程中使用质粒的特点：
在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是天然质粒的基础上进行过 的。
真核细胞细胞核
环状双链DNA分子
原核细胞拟核DNA
裸露
人工改造
自我复制
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
P72-2
最常用的载体——质粒
（3）作为载体所具备的条件及原因：
①具有一个至多个 切割位点；
供外源DNA片段(基因)插入其中。
②能在受体细胞中进行 ，或整合到
受体DNA上，随受体DNA_________ ;
③具有特殊的 ;
便于重组DNA分子的筛选。
④对受体细胞无 作用.
避免受体细胞受到损伤。
限制酶
自我复制
标记基因
同步复制
毒害
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
使外源基因在受体细胞中稳定存在并复制，以扩增外源基因的数量。
常见的标记基因：①抗性基因;②发光基因;③产物具有颜色反应的基因.
P72-2
最常用的载体—质粒
思考
提示：当质粒(载体)上有两个标记基因时，可将目的基因插入其中一个标记基因中，也就是重组质粒上含有一个标记基因，普通质粒上含有两个标记基因。
则 的受体细胞不具有标记基因控制的性状，
的受体细胞具有两个标记基因控制的性状，
的受体细胞只具有一个标记基因控制的性状。
这样可根据标记基因控制的性状准确筛选出含有重组质粒
的受体细胞。
未导入
导入
导入
没有导入质粒
导入普通质粒
导入重组质粒
三、基因进入受体细胞的载体—“分子运输车”
质粒(载体)不一定能成功导入受体细胞，导入载体细胞不一定含目的基因。如何筛选含目的基因细胞
P72-2
(1)作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因( )
(2)质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体( )
(3)载体(如质粒)和细胞膜上的载体蛋白的成分相同( )
(4)DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体( )
×
√
×
DNA重组技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，
载体不属于工具酶。
抗生素抗性基因。
载体(如质粒)的成分是DNA，细胞膜上的载体的主要成分是蛋白质。
×
针 对 训 练
1.质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上
才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
D
质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，×；
并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点，×；
可以在细胞内自我复制，或整合到受体细胞染色体DNA上后复制，×；
针 对 训 练
P73思考·讨论—重组DNA分子
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
5′
3′
5′
3′
目的基因
用相同的限制酶切割目的基因和运载体。产生相同末端，便于连接。
问题：目的基因是要与运载体结合的，那如何处理质粒？
问题：选择限制酶切割位点的基本原则？
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对
如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能。
因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
P73思考·讨论—重组DNA分子
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
5′
3′
5′
3′
不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
思考
【资料】识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
限制酶 识别序列 产生的黏性末端
Spe Ⅰ TCTAGA CTAG-
Xba Ⅰ ACTAGT CTAG-
提示：同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围 。
例如，我们选择了用SpeⅠ限制酶切割载体，如果目的基因的中刚好含有TCTAGA序列中，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被 ；这时可以考虑用合适的同尾酶 (目的基因的核苷酸序列中没有ACTAGT)来获取目的基因。
扩大
切断
XbaⅠ
P73思考·讨论—重组DNA分子
1．某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图。请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
插入点 细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的
培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
a×
a×
a√
b×
b√
b×
针 对 训 练
1．正确的一组是( )
A
A．①是c； ②是b； ③是a
B．①是a和b； ②是a； ③是b
C．①是a和b； ②是b； ③是a
D．①是c； ②是a； ③是b
针 对 训 练
2.下图甲是一个DNA片段，箭头处代表不同限制酶的切点，据图回答：
（1）用EcoRⅠ 酶切，能得到 种DNA片段；
（2）用PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
（3）同时用SmaⅠ 和PstⅠ 完全酶切，能得到 种DNA片段；
2
3
5
能切下目的基因且不破坏目的基因
（4）选择限制酶切割目的基因的基本原则
是： 。
针 对 训 练
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、噬菌体 、动植物病毒
重组DNA技术的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类：E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用：把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结