3.2.2基因工程的基本操作程序（第2课时）高中生物人教版（2019）选择性必修3课件(共39张PPT)
文档属性
| 名称 | 3.2.2基因工程的基本操作程序（第2课时）高中生物人教版（2019）选择性必修3课件(共39张PPT) |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 33.8MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-07-14 18:41:55 | ||
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文档简介
(共39张PPT)
本节聚焦：
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
（第二课时）
限制酶切割位点
第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
思考
获得目的基因后，能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？
（1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；
（2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
核心工作——基因表达载体构建
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
各个元件有什么作用？
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-1
复制原点：
DNA复制的起始位点
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
启动子：
本质：有特殊序列结构的 片段
位置：基因的 。
功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。
DNA
上游
RNA聚合酶
mRNA
抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。
终止子：
本质：有特殊序列结构的 片段
位置：基因的 。
功能：终止 。
DNA
下游
转录
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
必须插到 和 之间
启动子
终止子
有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
2.基因表达载体的组成
P80-2
目的基因应该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子：
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-2
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻的碱基
mRNA上
三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
终止转录
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
3.基因表达载体的过程
DNA分子
（含目的基因）
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同种限制酶处理
&产生相同末端限制酶(同尾酶)切割
载体
（质粒）
目的基因
限制酶
切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
重组
DNA分子
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-3
P80-图3-6
[思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？（单酶切法）
单酶切法缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因
反向连接
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
1
1’
2
2’
反向连接
2
1’
1
2’
1
2
2’
1’
正向连接
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因DNA片段和载体切割。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
双酶切的优点:
防止质粒、目的基因自身环化
B.防止质粒与目的基因随意连接
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反
向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
被PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏了
针 对 训 练
不需要终止密码子
√
2.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核
苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
针 对 训 练
2、设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
DNA聚合酶只能特异地复制处于 之间的DNA序列，若这个过程中消
耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，
应选用的引物是 。
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
(2n+1-2)=62
引物甲、引物丙
针 对 训 练
受体细胞
基因表达载体
导入
动物
植物
微生物
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
（常用）
将目的基因导入受体细胞的方法，因受体细胞不同而有所区别。
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-D1
(1)花粉管通道法（我国独创）
1.目的基因导入植物细胞
适用生物：开花植物
方法一：子房注射法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
第三步：将目的基因导入受体细胞
P81-1
1.目的基因导入植物细胞
2.适用生物：
1.受体细胞：
受精卵
方法二： 柱头处理法
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
3.特点：
简便经济，但要求花朵较大
开花植物
第三步：将目的基因导入受体细胞
(1)花粉管通道法（我国独创）
P81-1
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
②农杆菌特点：
a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________；
双子叶植物
裸子植物
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
该细胞的染色体DNA上
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-资料卡
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
①“转化”概念：
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。
③ 利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
第一次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
第二次拼接
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞染色体DNA上。
第一次导入
第二次导入
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
P80-资料卡
新性状植株
④过程：
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
方法一：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
方法二：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为体细胞
受体细胞为受精卵
⑤具体转化方法
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-资料卡
2.目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
① 体积大，易操作；
② 全能性高，易培养成完整个体。
第三步：将目的基因导入受体细胞
P82-4
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
(2)病毒介导法
第三步：将目的基因导入受体细胞
原因：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。（教材P101）
3.目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
Ca2+ 处理法
(2)受体细胞：
常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
(3)过程：
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+处理细胞
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性。
这种细胞称为感受态细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
P82-4
转录
翻译
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
剪切、连接
内质网、高尔基体
加工
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质（四级结构）
原因：
①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA；
②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
一般不能产生原来的蛋白质
第三步：将目的基因导入受体细胞
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素 cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
胰岛素
加工
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。
如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？
第三步：将目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞方法比较
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
花粉管通道法、农杆菌转化法
受精卵或体细胞
以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T DNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
显微注射技术
受精卵
提纯含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
获得具有新性
状的个体
Ca2＋处理法
原核细胞
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
第三步：将目的基因导入受体细胞
P81&P82-4
1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
√
都需要构建
只适用于植物
体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是
A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞
B.②过程中需要进行胚胎移植操作
C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B
D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素
√
受体细胞A一般是该种动物的受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
问题1：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断是否导入成功？
若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。
此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达。
问题2：标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？
可以利用标记基因（如抗生素抗性基因）筛选成功导入基因表达载体的受体细胞，如可用含青霉素的选择培养基鉴别。
结合Bt基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测与鉴定？
目的：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
④检测是否具有抗性以及抗性程度等
抗原 — 抗体杂交技术
抗性检测：
抗虫、抗病接种实验；
功能活性
比较：
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
方法：
通过PCR等技术检测
（1）分子检测法
（2）个体水平的鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-1、2、3
（一）分子水平的检测
1.检测目的基因是否导入
——通过PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段(基因探针)，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
DNA半保留复制
原理：
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
（一）分子水平的检测
2.检测目的基因是否转录——
通过PCR扩增和核酸分子杂交技术
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
提取mRNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
对扩增产物进行检测
害虫死亡
抗虫棉
逆转录
产生cDNA
基本思路：
①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段(基因探针)，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交带。
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
PCR技术
转基因生物
PCR操作
双链cDNA
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
双链cDNA
探针
15N
变性
变性
15N
DNA分子杂交
碱基互补配对原则
（一）分子水平的检测
2.检测目的基因是否转录
——通过PCR扩增和RNA分子杂交技术
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
（一）分子水平的检测
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——通过抗原-抗体杂交技术
注射小鼠体内
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
方法：
抗原—抗体杂交
抗原与抗体的特异性结合
原理：
第四步：目的基因的检测与鉴定
－
－
通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等
（二）个体水平的鉴定
例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
饲喂
棉铃虫
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-3
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
个体水平鉴定：抗性以及抗性程度
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-3
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
人工合成
DNA文库
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因等
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞（如加Ca2+）转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
小结
P82-图3-7
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。( ）
（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。( ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有目的基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
一、概念检测
P83
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
一、概念检测
D
练习与应用
P83
二、拓展应用
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
P83
本节聚焦：
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
（第二课时）
限制酶切割位点
第2节 基因工程的基本操作程序
第3章 基因工程
思考
获得目的基因后，能否直接将游离的Bt蛋白基因送入棉花细胞？
（1）游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解；
（2）就算可以进行转录并翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。
核心工作——基因表达载体构建
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
各个元件有什么作用？
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-1
复制原点：
DNA复制的起始位点
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
启动子：
本质：有特殊序列结构的 片段
位置：基因的 。
功能： 识别和结合的部位，驱动基因转录出 。
DNA
上游
RNA聚合酶
mRNA
抗生素抗性基因，荧光蛋白基因等。
终止子：
本质：有特殊序列结构的 片段
位置：基因的 。
功能：终止 。
DNA
下游
转录
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
必须插到 和 之间
启动子
终止子
有时为了满足需要，在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
2.基因表达载体的组成
P80-2
目的基因应该插入什么位置？
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子：
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-2
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质
位置
功能
DNA片段
DNA片段
mRNA上
三个相邻的碱基
mRNA上
三个相邻的碱基
目的基因上游
目的基因下游
mRNA首端
mRNA尾端
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
终止转录
翻译的起始信号（编码氨基酸）
翻译的结束信号（不编码氨基酸）
启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
3.基因表达载体的过程
DNA分子
（含目的基因）
带有黏性末端或平末端的切口
带有相同黏性末端或平末端的目的基因片段
DNA连接酶
重组DNA分子
（重组质粒）
同种限制酶处理
&产生相同末端限制酶(同尾酶)切割
载体
（质粒）
目的基因
限制酶
切割位点
标记基因
启动子
限制酶切割位点
终止子
复制原点
限制酶
限制酶
DNA连接酶
重组
DNA分子
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
P80-3
P80-图3-6
[思考]如果用一种限制酶分别切割目的基因和质粒，再用DNA连接酶处理后会出现几种产物？（单酶切法）
单酶切法缺点：质粒重新环化、目的基因自身环化、质粒与目的基因
反向连接
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
1
1’
2
2’
反向连接
2
1’
1
2’
1
2
2’
1’
正向连接
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
双酶切法：选择两种不同的限制酶同时对含目的基因DNA片段和载体切割。
限制酶a切割
a
b
DNA连接酶
连接
限制酶b切割
限制酶a切割
限制酶b切割
a
b
双酶切的优点:
防止质粒、目的基因自身环化
B.防止质粒与目的基因随意连接
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
1.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反
向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
被PstⅠ切割后，氨苄青霉素抗性基因被破坏了
针 对 训 练
不需要终止密码子
√
2.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核
苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因
等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因
的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
---基因工程的核心
第二步：基因表达载体的构建
针 对 训 练
2、设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
(1）第1组： ；
第2组： 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
（2）在DNA聚合酶的作用下，两条子链的延伸方向都是 。
DNA聚合酶只能特异地复制处于 之间的DNA序列，若这个过程中消
耗了引物62个,则进行了 轮的DNA复制。
（3）若用PCR技术扩增图示目的基因，
应选用的引物是 。
两个引物
从子链的5′端向3′端延伸
5
(2n+1-2)=62
引物甲、引物丙
针 对 训 练
受体细胞
基因表达载体
导入
动物
植物
微生物
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
（常用）
将目的基因导入受体细胞的方法，因受体细胞不同而有所区别。
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-D1
(1)花粉管通道法（我国独创）
1.目的基因导入植物细胞
适用生物：开花植物
方法一：子房注射法
用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
含目的基因的DNA 溶液
第三步：将目的基因导入受体细胞
P81-1
1.目的基因导入植物细胞
2.适用生物：
1.受体细胞：
受精卵
方法二： 柱头处理法
在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
3.特点：
简便经济，但要求花朵较大
开花植物
第三步：将目的基因导入受体细胞
(1)花粉管通道法（我国独创）
P81-1
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
②农杆菌特点：
a. 能在自然条件下侵染_____________和___________，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；
b. 农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞后，能将________上的________（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到________________________；
双子叶植物
裸子植物
Ti质粒
Ti质粒
T-DNA
该细胞的染色体DNA上
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-资料卡
指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
①“转化”概念：
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
将目的基因插入__________________中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入_____________。
③ 利用农杆菌进行转化的思路：
Ti质粒的T-DNA
植物细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
第一次拼接
将目的基因拼接到 Ti 质粒的 T-DNA上。
第二次拼接
(非人工操作)是指含目的基因的 T-DNA 拼接到受体细胞染色体DNA上。
第一次导入
第二次导入
(非人工操作)含目的基因的 T-DNA 导入受体细胞。
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
P80-资料卡
新性状植株
④过程：
随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功。
方法一：可将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株。
方法二：可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等。
受体细胞为体细胞
受体细胞为受精卵
⑤具体转化方法
（采用最多）
(2)农杆菌转化法
第三步：将目的基因导入受体细胞
P80-资料卡
2.目的基因导入动物细胞
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
（3）过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
① 体积大，易操作；
② 全能性高，易培养成完整个体。
第三步：将目的基因导入受体细胞
P82-4
科学家也用病毒DNA 与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
(2)病毒介导法
第三步：将目的基因导入受体细胞
原因：生理结构和遗传物质简单，生长繁殖快，对环境因素敏感和容易进行遗传物质操作。（教材P101）
3.目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
Ca2+ 处理法
(2)受体细胞：
常用原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
(3)过程：
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+处理细胞
将重组的基因表达载体导入其中
Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性。
这种细胞称为感受态细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
P82-4
转录
翻译
如果把一个真核生物的基因导入原核细胞中表达，一定会产生原来的蛋白质吗？
剪切、连接
内质网、高尔基体
加工
真核基因：编码区（外显子+内含子）
前体mRNA
成熟mRNA
多肽链
蛋白质（四级结构）
原因：
①真核生物的基因有内含子，原核生物细胞里没有相应的机制来剪切、拼接前体RNA；
②原核生物没有真核生物的蛋白质加工系统（如内质网、高尔基体等）
一般不能产生原来的蛋白质
第三步：将目的基因导入受体细胞
胰腺
提取筛选
胰岛素mRNA
胰岛素 cDNA
逆转录
重组
质粒
质粒
导入
大肠杆菌
mRNA
胰岛素原
胰岛素
加工
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。
如何让人的胰岛素基因在原核细胞中表达？
第三步：将目的基因导入受体细胞
目的基因导入受体细胞方法比较
细胞种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞
转化过程
花粉管通道法、农杆菌转化法
受精卵或体细胞
以农杆菌转化法为例：将目的基因插入Ti质粒的T DNA上
↓
转入农杆菌中
↓
导入植物细胞
↓
整合到受体细胞的DNA上
显微注射技术
受精卵
提纯含目的基
因的表达载体
↓
显微注射
↓
受精卵发育
↓
获得具有新性
状的个体
Ca2＋处理法
原核细胞
Ca2＋处理细胞
↓
感受态细胞
↓
基因表达载体与
感受态细胞混合
↓
感受态细胞
吸收DNA分子
第三步：将目的基因导入受体细胞
P81&P82-4
1.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
√
都需要构建
只适用于植物
体细胞
第三步：将目的基因导入受体细胞
2.如图表示转基因动、植物的培育过程。下列有关叙述错误的是
A.受体细胞A只能是绵羊的体细胞
B.②过程中需要进行胚胎移植操作
C.可采用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞B
D.③过程中一般需要生长素和细胞分裂素
√
受体细胞A一般是该种动物的受精卵
第三步：将目的基因导入受体细胞
问题1：将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断是否导入成功？
若导入的是空载体、载体-载体连接物，标记基因筛选也是呈阳性，因此仅凭标记基因筛选呈阳性无法完全确定目的基因是否导入。
此外，即便导入了基因表达载体（目的基因成功导入），但是仍然不知道目的基因插入的位置、方向等是否正确，能否正确表达。
问题2：标记基因筛选呈阳性一定能确定转基因生物培育成功了吗？
可以利用标记基因（如抗生素抗性基因）筛选成功导入基因表达载体的受体细胞，如可用含青霉素的选择培养基鉴别。
结合Bt基因表达的过程，推测可以从哪些方面（或水平）进行检测与鉴定？
目的：检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
①检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
④检测是否具有抗性以及抗性程度等
抗原 — 抗体杂交技术
抗性检测：
抗虫、抗病接种实验；
功能活性
比较：
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
方法：
通过PCR等技术检测
（1）分子检测法
（2）个体水平的鉴定
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-1、2、3
（一）分子水平的检测
1.检测目的基因是否导入
——通过PCR扩增和DNA分子杂交技术
基本思路：
①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段(基因探针)，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
DNA半保留复制
原理：
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
（一）分子水平的检测
2.检测目的基因是否转录——
通过PCR扩增和核酸分子杂交技术
10个PCR阳性棉花植株中，有四株Bt基因发生转录
提取mRNA
PCR操作
是否扩增出目的基因
对扩增产物进行检测
害虫死亡
抗虫棉
逆转录
产生cDNA
基本思路：
①制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段(基因探针)，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液；或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交带。
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
PCR技术
转基因生物
PCR操作
双链cDNA
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
双链cDNA
探针
15N
变性
变性
15N
DNA分子杂交
碱基互补配对原则
（一）分子水平的检测
2.检测目的基因是否转录
——通过PCR扩增和RNA分子杂交技术
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-2
（一）分子水平的检测
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
——通过抗原-抗体杂交技术
注射小鼠体内
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt抗虫蛋白
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
转基因生物
放射性检测
（杂交带）
方法：
抗原—抗体杂交
抗原与抗体的特异性结合
原理：
第四步：目的基因的检测与鉴定
－
－
通过抗虫、抗病的接种实验鉴定生物是否具有抗性以及抗性的程度等
（二）个体水平的鉴定
例：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
饲喂
棉铃虫
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-3
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
个体水平鉴定：抗性以及抗性程度
第四步：目的基因的检测与鉴定
P82-3
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
人工合成
DNA文库
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因等
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞（如加Ca2+）转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
小结
P82-图3-7
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。( ）
（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。( ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有目的基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
一、概念检测
P83
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
一、概念检测
D
练习与应用
P83
二、拓展应用
研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
练习与应用
P83