第1章 发酵工程（单元培优）-2025-2026学年高中生物选择性必修3人教版（2019）（含解析）
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| 名称 | 第1章 发酵工程（单元培优）-2025-2026学年高中生物选择性必修3人教版（2019）（含解析） |  | |
| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 2.2MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-08-04 23:30:17 | ||
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文档简介
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单元培优 发酵工程
一．选择题（共11小题）
1．（2025 四川）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X：Y＝1：1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率＝剩余量/添加量×100%），结果如图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
2．（2025 云南）黄酒是我国古老的发酵酒之一，传统酿制中，先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料，对之前发酵留存的少量酒曲（曲种）进行扩大制曲；再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后，添加足量酒母（含酵母菌）完成发酵，压榨成品。下列说法错误的是（ ）
A．小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质
B．为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质，扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌
C．糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率
D．将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖
3．（2025 湖南）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ）
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
4．（2025 河南）食醋和黄酒是我国传统的日常调味品，均通过发酵技术生产。下列叙述错误的是（ ）
A．醋酸的发酵是好氧发酵，而酒精的发酵是厌氧发酵
B．以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，伴有pH下降和气体产生
C．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高
D．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一
5．（2025 北京）动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是（ ）
A．必需氨基酸 B．抗生素
C．酸碱指示剂 D．血清
6．（2025 江苏）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
7．（2025 选择性）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
8．（2025 江苏）某同学利用红叶李果实制作果醋，图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率
C．过程②中，为使菌种充分吸收营养物质，需每日多次开盖搅拌
D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气
9．（2025 山东）深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是（ ）
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 ﹣ + ﹣
② 常压 + ﹣ ﹣
③ 高压 ﹣ + ﹣
④ 高压 + ﹣ +
注：“+”表示有；“﹣”表示无
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
10．（2025 选择性）科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素（C22H23ClN2O8）能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是（ ）
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
11．（2025 浙江）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定
B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌
C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸
D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵
二．多选题（共2小题）
（多选）12．（2025 河北）隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，是工业生产DHA（一种功能性脂肪酸）的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻，可用于DHA的发酵生产。下列叙述正确的是（ ）
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量
（多选）13．（2025 山东）酿造某大曲白酒的过程中，微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，制曲过程需经堆积培养，培养时温度可达60℃左右；将大曲和酿酒原料混合，初步发酵后放入窖池；窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法正确的是（ ）
A．堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B．大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C．窖池发酵过程中，酵母菌以无氧呼吸为主
D．窖池密封不严使酒变酸是因为乳酸含量增加
三．解答题（共5小题）
14．（2025 云南）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图a，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图b。
回答下列问题：
（1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。
（2）绘制图a需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。
（3）基于图b，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。
15．（2025 河南）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
（1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
16．（2025 广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。
回答下列问题：
（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C﹣末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。
（3）研究者选用启动子Px、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。
（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。
17．（2025 北京）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。
（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的 ，诱发基因突变。
（2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的 性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。
（3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有 作用。
（4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M+产量，统计结果如表。
组别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15
所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3
①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因。
②表中Ⅲ组和Ⅴ组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有 （多选）。
A．Ⅲ组中有野生型菌落，而Ⅴ组中没有野生型菌落
B．Ⅴ组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有
C．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在Ⅴ组中被抑制
D．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在Ⅴ组中被抑制
综上所述，用粗提液筛选是获得M+株的有效方法。
18．（2025 安徽）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R﹣U和下游片段R﹣D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
（3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。
单元培优 发酵工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共11小题）
1．（2025 四川）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X：Y＝1：1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率＝剩余量/添加量×100%），结果如图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】坐标曲线图；微生物的分离、培养和应用；解决问题能力．
【答案】C
【分析】微生物常见的接种（分离）的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【解答】解：A、平板划线法只能接种或分离细菌，不能计数，可用稀释涂布平板法接种X菌液测定每毫升样品中的活菌数，A错误；
B、由柱形图可知，Y菌组微塑料残留率较高，说明其降解能力弱，但不能确定Y菌浓度高，B错误；
C、根据柱形图可知，混合菌种的残留率低于单一菌种，说明其对微塑料的降解能力高于单一菌种，C正确；
D、该培养基中除了微塑料还含有蛋白胨，能在该培养基中生长繁殖的微生物不一定都能降解微塑料，D错误。
故选：C。
【点评】本题主要考查微生物培养与分离，意在强化学生对相关知识的识记与理解。
2．（2025 云南）黄酒是我国古老的发酵酒之一，传统酿制中，先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料，对之前发酵留存的少量酒曲（曲种）进行扩大制曲；再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后，添加足量酒母（含酵母菌）完成发酵，压榨成品。下列说法错误的是（ ）
A．小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质
B．为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质，扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌
C．糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率
D．将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；解决问题能力．
【答案】B
【分析】酵母菌既可以在有氧的条件下生活，也可以在无氧的条件下生活。有氧时它将有机物分解成二氧化碳和水，无氧时将有机物分解成酒精和二氧化碳。制作米酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，所以在操作过程中要注意做好密封工作，同时也要注意温度的控制，温度太低，酵母菌的代谢太过缓慢从而影响发酵速度，温度太高，容易烫死酵母菌，一般发酵温度应控制在30℃左右。
【解答】解：A、酒曲中微生物可利用小麦、麸皮等原料提供了碳源和氮源等营养物质进行生长繁殖，通过发酵获得黄酒，A正确；
B、酒曲灭菌可杀死发酵所需的微生物，B错误；
C、糯米、大米蒸煮后温度很高，若立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变，活性降低，C正确；
D、将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，酒曲的曲霉菌会把淀粉分解为葡萄糖，为酵母菌的细胞呼吸提供碳源，D正确。
故选：B。
【点评】本题主要考查黄酒的制作，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
3．（2025 湖南）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ）
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】B
【分析】微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线主要是用来纯化的，稀释涂布主要用来计数；此外，利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，制备选择培养基，从而使该微生物大量增殖，也可用于微生物的分离和纯化。
【解答】解：A、平板划线法仅用于分离纯化菌种，稀释涂布平板法可可用于菌种的分离和计数，A错误；
B、平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照，以验证培养基灭菌是否彻底，B正确；
C、醋酸菌为好氧菌，其代谢需氧气，无氧条件下无法将葡萄糖转化为乙酸，C错误；
D、筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源，若含蛋白胨（含其他氮源），则无法筛选目标菌，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
4．（2025 河南）食醋和黄酒是我国传统的日常调味品，均通过发酵技术生产。下列叙述错误的是（ ）
A．醋酸的发酵是好氧发酵，而酒精的发酵是厌氧发酵
B．以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，伴有pH下降和气体产生
C．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高
D．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】C
【分析】发酵技术是利用微生物的生长和代谢来生产有用物质的技术。醋酸菌是好氧菌，在有氧条件下将酒精氧化为醋酸；酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵。
【解答】解：A、醋酸菌进行醋酸发酵时需要氧气，是好氧发酵；酵母菌进行酒精发酵时需要无氧环境，是厌氧发酵，A正确；
B、以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，微生物的代谢活动会产生酸性物质使 pH 下降，同时酒精发酵会产生CO2气体，B正确；
C、在食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖过快不一定会使发酵产物产率越高。因为微生物的代谢途径和产物积累受到多种因素的调控，过度繁殖可能会消耗过多营养物质，导致发酵产物的合成受到影响，C错误；
D、天然混合菌种中微生物的种类和数量不稳定，不同菌种的代谢特性也有差异，所以使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查传统发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
5．（2025 北京）动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是（ ）
A．必需氨基酸 B．抗生素
C．酸碱指示剂 D．血清
【考点】培养基的配制．
【专题】探究结论；归纳推理；正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】C
【分析】培养基颜色变化与pH相关，CO2耗尽导致pH下降，指示剂显黄色。
【解答】解：A、必需氨基酸是细胞生长的营养成分，不直接导致颜色变化，A错误；
B、抗生素用于抑制微生物生长，避免培养基被杂菌污染，与培养基颜色变化无关，B错误；
C、酸碱指示剂（如酚红）在培养基中用于显示pH变化，中性或弱碱性时呈淡红色，酸性时pH降低，培养基转为黄色，C正确；
D、血清提供生长因子，不直接导致颜色变化，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查培养基的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
6．（2025 江苏）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】B
【分析】微生物常见的接种方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【解答】解：A、制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，A错误；
B、将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确；
C、连续划线时，从上一次划线的末端开始划线，以逐步稀释菌体，C错误；
D、斜面培养基保存菌种需置于4℃短期保存，长期保存应使用甘油管藏法（﹣20℃），室温下无法长期保存，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查微生物培养的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
7．（2025 选择性）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
【考点】发酵工程的基本环节；发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】正推法；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】C
【分析】黑曲霉发酵时需通入空气，为异养需氧型。
【解答】解：A、淀粉水解形成的糖类，元素组成为C、H、O，可以为发酵提供碳源，氧化分解后还可以为黑曲霉提供能源，A正确；
B、通过液体培养基的扩大培养，可以为后续的发酵罐内发酵提供足量的黑曲霉菌种，B正确；
C、空气一般用过滤除菌的方式，培养基一般用高压蒸汽灭菌的方式，发酵罐可以用高温灭菌的方式等，灭菌方法不相同，C错误；
D、通气、搅拌有利于溶解氧增加，有利于发酵产物柠檬酸的积累，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查发酵工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
8．（2025 江苏）某同学利用红叶李果实制作果醋，图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率
C．过程②中，为使菌种充分吸收营养物质，需每日多次开盖搅拌
D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】模式图；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】B
【分析】1、果酒制作菌种是酵母菌，代谢类型是异养兼性厌氧型真菌，属于真核细胞，条件是18～30℃，前期需氧，后期不需氧。2、果醋制作菌种是醋酸菌，属于原核细胞，适宜温度为30～35℃，需要持续通入氧气。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【解答】解：A、果酒发酵所需的菌种是酵母菌，是真核生物，果醋发酵所需的菌种是醋酸菌，是原核生物，两者的细胞结构不同，A错误；
B、过程①为榨汁，果胶酶能分解细胞壁中的果胶，添加适量果胶酶，有利于提高出汁率，B正确；
C、过程②为果酒发酵，需要在无氧条件下进行，每日多次开盖会引入氧气抑制无氧呼吸，抑制酒精发酵，并增加杂菌污染风险，C错误；
D、过程③是利用乙醇的果醋发酵，醋酸菌利用乙醇产醋过程中不产生气体，不会产生大量气泡，也无需放气，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查传统发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
9．（2025 山东）深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是（ ）
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 ﹣ + ﹣
② 常压 + ﹣ ﹣
③ 高压 ﹣ + ﹣
④ 高压 + ﹣ +
注：“+”表示有；“﹣”表示无
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】D
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，其中碳源和氮源常采用蛋白胨和牛肉膏，因为它们来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对特殊营养物质和氧气的要求。
【解答】解：A、平板划线法主要用于微生物的分离和纯化，不能用于计数，计数通常采用稀释涂布平板法，A错误；
B、制备培养基时，应先进行高压蒸汽灭菌，再倒平板，若先倒平板再灭菌，会导致培养基被污染，B错误；
C、由②④组对比可知，②组在常压、以纤维素为唯一碳源的培养基上有菌落，④组在高压、以纤维素为唯一碳源的培养基上无菌落，说明在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长，C错误；
D、③组在高压、以淀粉为唯一碳源的培养基上无菌落，④组在高压、以纤维素为唯一碳源的培养基上有菌落，由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长，D正确。
故选：D。
【点评】本题主要考查微生物培养的相关知识，考查学生对微生物接种方法的掌握情况和筛选微生物的过程的理解，难度适中。
10．（2025 选择性）科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素（C22H23ClN2O8）能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是（ ）
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；选择培养基．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】D
【分析】在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
【解答】解：A、以金霉素为唯一碳源的选择培养基，可以筛选出能利用金霉素为碳源的微生物，抑制其他不能利用金霉素微生物生长被抑制，从而达到筛选目的，A正确；
B、逐步提高金霉素浓度可模拟环境胁迫，筛选出耐受性更强的菌株，B正确；
C、制备选择培养基时，人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），C正确；
D、将菌液均匀地涂布在培养基表面需要用涂布器，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查微生物培养的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
11．（2025 浙江）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定
B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌
C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸
D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵
【考点】果酒、果醋的制作；制作泡菜．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】A
【分析】1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。
2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
3、参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，其新陈代谢类型是异养需氧型。腐乳制作的原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
4、泡菜的制作原理：泡菜的制作离不开乳酸菌。在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
【解答】解：A、泡菜的风味不仅取决于乳酸菌的种类，还与原料的种类、发酵条件（如温度、时间、盐浓度等）以及可能存在的其他微生物等多种因素有关，并非仅由乳酸菌的种类决定，A错误；
B、果醋发酵是利用醋酸菌在有氧条件下将酒精氧化为醋酸，用果酒发酵制作果醋的主要菌种确实是醋酸菌，B正确；
C、家庭酿制米酒时，开始阶段酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，随着氧气消耗，后期进行无氧呼吸产生酒精，所以该过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸，C正确；
D、传统发酵通常不进行严格的无菌操作，利用的是原材料或环境中多种微生物进行的混合发酵，D正确。
故选：A。
【点评】本题主要考查传统发酵的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
二．多选题（共2小题）
（多选）12．（2025 河北）隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，是工业生产DHA（一种功能性脂肪酸）的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻，可用于DHA的发酵生产。下列叙述正确的是（ ）
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量
【考点】发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；解决问题能力．
【答案】ACD
【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配制、灭菌、种子扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。
【解答】解：A、隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源，如纤维素等，A正确；
B、隐甲藻在湿热灭菌条件下会被杀死，B错误；
C、抗生素可抑制杂菌生长，有利于筛选隐甲藻，C正确；
D、隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，从而提高DHA产量，D正确。
故选：ACD。
【点评】本题主要考查发酵工程的应用等内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。
（多选）13．（2025 山东）酿造某大曲白酒的过程中，微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，制曲过程需经堆积培养，培养时温度可达60℃左右；将大曲和酿酒原料混合，初步发酵后放入窖池；窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法正确的是（ ）
A．堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B．大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C．窖池发酵过程中，酵母菌以无氧呼吸为主
D．窖池密封不严使酒变酸是因为乳酸含量增加
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】BC
【分析】1、果醋制作中起到主要作用的微生物是醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，其代谢类型属于异养需氧型。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解为醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。
2、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
【解答】解：A、酿酒酵母适宜在适宜温度下生长繁殖，堆积培养过程中温度达60℃左右，高温会抑制甚至杀死酿酒酵母，不利于筛选酿酒酵母，A错误；
B、大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，而糖化是将淀粉分解为糖的过程，所以大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物，将原料中的淀粉分解，B正确；
C、窖池发酵过程中，初期氧气含量相对较多，酵母菌会进行有氧呼吸大量繁殖，后期氧气逐渐消耗，酵母菌以无氧呼吸产生酒精为主，C正确；
D、若窖池密封不严，酒变酸是因为醋酸菌在有氧条件下将酒精转化为醋酸，使醋酸含量增加，而不是乳酸含量增加，D错误。
故选：BC。
【点评】本题考查发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
三．解答题（共5小题）
14．（2025 云南）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图a，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图b。
回答下列问题：
（1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 标记基因、目的基因、终止子、复制原点 。
（2）绘制图a需统计活菌数，常用方法是 稀释涂布平板法 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 能抑制细菌增殖 ，开始发挥作用的时间是 15h ，判断理由是 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升 。
（3）基于图b，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 高于 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C 。
【考点】发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】图像坐标类简答题；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】（1）标记基因、目的基因、终止子、复制原点
（2）稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
（3）高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【解答】解：（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2﹣酮﹣L﹣古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
故答案为：
（1）标记基因、目的基因、终止子、复制原点
（2）稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
（3）高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
15．（2025 河南）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
（1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 。将培养后的菌液混匀并充分 稀释 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 BamHⅠ 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ，随后在含 卡拉胶 和 四环素 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 44 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；微生物的分离、培养和应用；基因工程；理解能力．
【答案】（1）在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
（2）BamHⅠ重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
（3）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
（4）44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【解答】解：（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
故答案为：
（1）在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
（2）BamHⅠ重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
（3）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
（4）44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
16．（2025 广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。
回答下列问题：
（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C﹣末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ） 检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 。
（3）研究者选用启动子Px、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 先上升后保持稳定 。
（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒② 。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；基因工程；理解能力．
【答案】（1）核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）
（2）稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
（3）先上升后保持稳定
（4）首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒②
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【解答】解：（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，还有核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）。核酸分子杂交可以检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录，抗原﹣抗体杂交可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C﹣末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期，细胞处于快速生长阶段，随着细胞数量的增加，阻遏蛋白X的量相对不足，PX启动子可能会有一定程度的启动，从而合成mKate2，使荧光强度上升；随着培养的进行，阻遏蛋白X的量逐渐增多，对PX启动子的阻遏作用增强，转录受到抑制，荧光强度保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为先上升后保持稳定。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶因被降解而减少对莽草酸的转化；同时导入质粒②，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸。
故答案为：
（1）核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）
（2）稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
（3）先上升后保持稳定
（4）首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒②
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
17．（2025 北京）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。
（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的 碱基序列（或脱氧核苷酸序列） ，诱发基因突变。
（2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的 不定向 性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。
（3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有 抑制 作用。
（4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M+产量，统计结果如表。
组别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15
所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3
①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因。 Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活
②表中Ⅲ组和Ⅴ组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有 CD （多选）。
A．Ⅲ组中有野生型菌落，而Ⅴ组中没有野生型菌落
B．Ⅴ组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有
C．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在Ⅴ组中被抑制
D．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在Ⅴ组中被抑制
综上所述，用粗提液筛选是获得M+株的有效方法。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因突变的概念、原因、特点及意义．
【专题】坐标曲线图；对照实验思想；对比分析法；基因重组、基因突变和染色体变异；解决问题能力．
【答案】（1）碱基序列（或脱氧核苷酸序列）
（2）不定向
（3）抑制
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活 ②CD
【分析】基因突变
（1）概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构改变．基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代；若发生在体细胞中则不能遗传。
（2）诱发因素可分为：
①物理因素（紫外线、X射线及其他辐射能损伤细胞内的DNA）；
②化学因素（亚硝酸、碱基类似物等能改变核酸的碱基）；
③生物因素（某些病毒的遗传物质能影响宿主细胞的DNA）。
【解答】解：（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的碱基序列（或脱氧核苷酸序列），诱发基因突变。因为基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而这些处理会影响DNA的碱基组成和排列顺序。
（2）基因突变具有不定向性，即一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因，所以即使发生了基因突变，也不一定是我们想要的M+株。
（3）由图可知，随着培养基中粗提液浓度的升高，野生型孢子萌发率下降，所以粗提液对野生型孢子萌发有抑制作用。
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，结合前面得出粗提液对孢子萌发有抑制作用，且M+株可能对粗提液有更强的耐受性，所以在较高浓度的粗提液下，更多的野生型孢子萌发受抑制，而M+株相对更容易存活，导致Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组。
②A、Ⅴ组中也可能有野生型菌落，只是可能由于粗提液浓度更高，其生长受到了更强的抑制，A 错误；
B、Ⅲ组和Ⅴ组中都可能有M+ 产量未提高的突变体菌落，B 错误；
C、Ⅴ组粗提液浓度高于Ⅲ组，与Ⅲ组相比，所取菌落中M+株占比也降低，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体（包括非M+株的突变体）在Ⅴ组中被抑制，C正确；
D、从结果看，Ⅴ组M+株占比低，是因为更多的M+株在Ⅴ组中被抑制，D 正确。
故选：CD。
故答案为：
（1）碱基序列（或脱氧核苷酸序列）
（2）不定向
（3）抑制
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活 ②CD
【点评】解答此题需要掌握基因突变的相关知识，需要较强的识图能力和逻辑思维能力。
18．（2025 安徽）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 稀释涂布平板法 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 分离不同条件下生长的内生放线菌 。
（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R﹣U和下游片段R﹣D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 大量扩增 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 ② （填序号），出现菌落④的可能原因是 重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中 。
（3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；微生物的分离、培养和应用；基因工程；实验探究能力．
【答案】（1）稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
（2）大量扩增 ②重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中
（3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【分析】1、PCR原理：目的基因受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：（1）根据题意，要观察菌落的生长情况，可用等量的研磨液进行稀释涂布。由于水稻叶片有不同的内生放线菌，在不同选择培养基，不同温度下培养内生放线菌，可分离不同条件下生长的内生放线菌。
（2）PCR是通过半保留复制对DNA进行大量扩增。若R基因被敲除，引物1和2只能扩增出R﹣U和R﹣D片段，长度为1000bp；出现菌落④的可能原因是重组质粒上的R﹣U与内生放线菌DNA的R﹣U互换后，形成了一个含R基因和重组质粒的长链DNA，导致引物1和2扩增后得到了7000bp的片段。
（3）实验思路是：设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
故答案为：
（1）稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
（2）大量扩增 ②重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中
（3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【点评】本题综合考查了微生物培养、基因工程等内容，旨在考查考生对知识的综合应用能力，以及实验设计能力。
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单元培优 发酵工程
一．选择题（共11小题）
1．（2025 四川）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X：Y＝1：1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率＝剩余量/添加量×100%），结果如图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
2．（2025 云南）黄酒是我国古老的发酵酒之一，传统酿制中，先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料，对之前发酵留存的少量酒曲（曲种）进行扩大制曲；再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后，添加足量酒母（含酵母菌）完成发酵，压榨成品。下列说法错误的是（ ）
A．小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质
B．为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质，扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌
C．糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率
D．将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖
3．（2025 湖南）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ）
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
4．（2025 河南）食醋和黄酒是我国传统的日常调味品，均通过发酵技术生产。下列叙述错误的是（ ）
A．醋酸的发酵是好氧发酵，而酒精的发酵是厌氧发酵
B．以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，伴有pH下降和气体产生
C．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高
D．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一
5．（2025 北京）动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是（ ）
A．必需氨基酸 B．抗生素
C．酸碱指示剂 D．血清
6．（2025 江苏）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
7．（2025 选择性）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
8．（2025 江苏）某同学利用红叶李果实制作果醋，图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率
C．过程②中，为使菌种充分吸收营养物质，需每日多次开盖搅拌
D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气
9．（2025 山东）深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是（ ）
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 ﹣ + ﹣
② 常压 + ﹣ ﹣
③ 高压 ﹣ + ﹣
④ 高压 + ﹣ +
注：“+”表示有；“﹣”表示无
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
10．（2025 选择性）科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素（C22H23ClN2O8）能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是（ ）
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
11．（2025 浙江）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定
B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌
C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸
D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵
二．多选题（共2小题）
（多选）12．（2025 河北）隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，是工业生产DHA（一种功能性脂肪酸）的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻，可用于DHA的发酵生产。下列叙述正确的是（ ）
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量
（多选）13．（2025 山东）酿造某大曲白酒的过程中，微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，制曲过程需经堆积培养，培养时温度可达60℃左右；将大曲和酿酒原料混合，初步发酵后放入窖池；窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法正确的是（ ）
A．堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B．大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C．窖池发酵过程中，酵母菌以无氧呼吸为主
D．窖池密封不严使酒变酸是因为乳酸含量增加
三．解答题（共5小题）
14．（2025 云南）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图a，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图b。
回答下列问题：
（1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 。
（2）绘制图a需统计活菌数，常用方法是 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 ，开始发挥作用的时间是 ，判断理由是 。
（3）基于图b，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 。
15．（2025 河南）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
（1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 。将培养后的菌液混匀并充分 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 ，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 。
16．（2025 广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。
回答下列问题：
（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C﹣末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 。
（3）研究者选用启动子Px、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 。
（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 。
17．（2025 北京）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。
（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的 ，诱发基因突变。
（2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的 性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。
（3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有 作用。
（4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M+产量，统计结果如表。
组别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15
所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3
①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因。
②表中Ⅲ组和Ⅴ组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有 （多选）。
A．Ⅲ组中有野生型菌落，而Ⅴ组中没有野生型菌落
B．Ⅴ组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有
C．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在Ⅴ组中被抑制
D．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在Ⅴ组中被抑制
综上所述，用粗提液筛选是获得M+株的有效方法。
18．（2025 安徽）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 。
（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R﹣U和下游片段R﹣D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 （填序号），出现菌落④的可能原因是 。
（3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。
单元培优 发酵工程
参考答案与试题解析
一．选择题（共11小题）
1．（2025 四川）微塑料由塑料废弃物风化形成，难以降解，会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌，将总菌量相同的X、Y、X+Y（X：Y＝1：1）分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中，培养一段时间后测定微塑料的残留率（残留率＝剩余量/添加量×100%），结果如图。下列叙述正确的是（ ）
A．用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B．Y菌组微塑料残留率较高，故菌浓度也高
C．混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D．能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】坐标曲线图；微生物的分离、培养和应用；解决问题能力．
【答案】C
【分析】微生物常见的接种（分离）的方法：
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养，在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【解答】解：A、平板划线法只能接种或分离细菌，不能计数，可用稀释涂布平板法接种X菌液测定每毫升样品中的活菌数，A错误；
B、由柱形图可知，Y菌组微塑料残留率较高，说明其降解能力弱，但不能确定Y菌浓度高，B错误；
C、根据柱形图可知，混合菌种的残留率低于单一菌种，说明其对微塑料的降解能力高于单一菌种，C正确；
D、该培养基中除了微塑料还含有蛋白胨，能在该培养基中生长繁殖的微生物不一定都能降解微塑料，D错误。
故选：C。
【点评】本题主要考查微生物培养与分离，意在强化学生对相关知识的识记与理解。
2．（2025 云南）黄酒是我国古老的发酵酒之一，传统酿制中，先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料，对之前发酵留存的少量酒曲（曲种）进行扩大制曲；再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后，添加足量酒母（含酵母菌）完成发酵，压榨成品。下列说法错误的是（ ）
A．小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质
B．为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质，扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌
C．糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率
D．将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；解决问题能力．
【答案】B
【分析】酵母菌既可以在有氧的条件下生活，也可以在无氧的条件下生活。有氧时它将有机物分解成二氧化碳和水，无氧时将有机物分解成酒精和二氧化碳。制作米酒利用的是酵母菌的无氧呼吸，所以在操作过程中要注意做好密封工作，同时也要注意温度的控制，温度太低，酵母菌的代谢太过缓慢从而影响发酵速度，温度太高，容易烫死酵母菌，一般发酵温度应控制在30℃左右。
【解答】解：A、酒曲中微生物可利用小麦、麸皮等原料提供了碳源和氮源等营养物质进行生长繁殖，通过发酵获得黄酒，A正确；
B、酒曲灭菌可杀死发酵所需的微生物，B错误；
C、糯米、大米蒸煮后温度很高，若立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变，活性降低，C正确；
D、将酒曲混合糯米、大米处理一段时间，酒曲的曲霉菌会把淀粉分解为葡萄糖，为酵母菌的细胞呼吸提供碳源，D正确。
故选：B。
【点评】本题主要考查黄酒的制作，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
3．（2025 湖南）采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是（ ）
A．稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B．完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C．土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分离成乙酸
D．用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】B
【分析】微生物常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法，平板划线主要是用来纯化的，稀释涂布主要用来计数；此外，利用分离对象对某一营养物质的“嗜好”，专门在培养基中加入该营养物质，制备选择培养基，从而使该微生物大量增殖，也可用于微生物的分离和纯化。
【解答】解：A、平板划线法仅用于分离纯化菌种，稀释涂布平板法可可用于菌种的分离和计数，A错误；
B、平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照，以验证培养基灭菌是否彻底，B正确；
C、醋酸菌为好氧菌，其代谢需氧气，无氧条件下无法将葡萄糖转化为乙酸，C错误；
D、筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源，若含蛋白胨（含其他氮源），则无法筛选目标菌，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
4．（2025 河南）食醋和黄酒是我国传统的日常调味品，均通过发酵技术生产。下列叙述错误的是（ ）
A．醋酸的发酵是好氧发酵，而酒精的发酵是厌氧发酵
B．以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，伴有pH下降和气体产生
C．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高
D．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】C
【分析】发酵技术是利用微生物的生长和代谢来生产有用物质的技术。醋酸菌是好氧菌，在有氧条件下将酒精氧化为醋酸；酵母菌是兼性厌氧菌，在无氧条件下进行酒精发酵。
【解答】解：A、醋酸菌进行醋酸发酵时需要氧气，是好氧发酵；酵母菌进行酒精发酵时需要无氧环境，是厌氧发酵，A正确；
B、以谷物为原料酿造食醋和黄酒时，微生物的代谢活动会产生酸性物质使 pH 下降，同时酒精发酵会产生CO2气体，B正确；
C、在食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖过快不一定会使发酵产物产率越高。因为微生物的代谢途径和产物积累受到多种因素的调控，过度繁殖可能会消耗过多营养物质，导致发酵产物的合成受到影响，C错误；
D、天然混合菌种中微生物的种类和数量不稳定，不同菌种的代谢特性也有差异，所以使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查传统发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
5．（2025 北京）动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是（ ）
A．必需氨基酸 B．抗生素
C．酸碱指示剂 D．血清
【考点】培养基的配制．
【专题】探究结论；归纳推理；正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】C
【分析】培养基颜色变化与pH相关，CO2耗尽导致pH下降，指示剂显黄色。
【解答】解：A、必需氨基酸是细胞生长的营养成分，不直接导致颜色变化，A错误；
B、抗生素用于抑制微生物生长，避免培养基被杂菌污染，与培养基颜色变化无关，B错误；
C、酸碱指示剂（如酚红）在培养基中用于显示pH变化，中性或弱碱性时呈淡红色，酸性时pH降低，培养基转为黄色，C正确；
D、血清提供生长因子，不直接导致颜色变化，D错误。
故选：C。
【点评】本题考查培养基的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
6．（2025 江苏）从种植草莓的土壤中分离致病菌，简易流程如下：制备土壤悬液、分离、纯化、鉴定。下列相关叙述正确的是（ ）
A．制备的培养基可用紫外线照射进行灭菌
B．将土样加入无菌水混匀，梯度稀释后取悬液加入平板并涂布
C．连续划线时，接上次划线的起始端开始划线
D．鉴定后的致病菌，可接种在斜面培养基上，并在室温下长期保存
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】B
【分析】微生物常见的接种方法：（1）平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在划线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。（2）稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
【解答】解：A、制备的培养基需用高压蒸汽灭菌法灭菌，A错误；
B、将土样加入无菌水制成悬液，经梯度稀释后，取各稀释度菌液涂布于培养基表面，分离并计数，B正确；
C、连续划线时，从上一次划线的末端开始划线，以逐步稀释菌体，C错误；
D、斜面培养基保存菌种需置于4℃短期保存，长期保存应使用甘油管藏法（﹣20℃），室温下无法长期保存，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查微生物培养的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
7．（2025 选择性）我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是（ ）
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
【考点】发酵工程的基本环节；发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】正推法；从生物材料提取特定成分；理解能力．
【答案】C
【分析】黑曲霉发酵时需通入空气，为异养需氧型。
【解答】解：A、淀粉水解形成的糖类，元素组成为C、H、O，可以为发酵提供碳源，氧化分解后还可以为黑曲霉提供能源，A正确；
B、通过液体培养基的扩大培养，可以为后续的发酵罐内发酵提供足量的黑曲霉菌种，B正确；
C、空气一般用过滤除菌的方式，培养基一般用高压蒸汽灭菌的方式，发酵罐可以用高温灭菌的方式等，灭菌方法不相同，C错误；
D、通气、搅拌有利于溶解氧增加，有利于发酵产物柠檬酸的积累，D正确。
故选：C。
【点评】本题考查发酵工程的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
8．（2025 江苏）某同学利用红叶李果实制作果醋，图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是（ ）
A．果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B．过程①中添加适量果胶酶，有利于提高出汁率
C．过程②中，为使菌种充分吸收营养物质，需每日多次开盖搅拌
D．过程③发酵时会产生大量气泡，需拧松瓶盖放气
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】模式图；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】B
【分析】1、果酒制作菌种是酵母菌，代谢类型是异养兼性厌氧型真菌，属于真核细胞，条件是18～30℃，前期需氧，后期不需氧。2、果醋制作菌种是醋酸菌，属于原核细胞，适宜温度为30～35℃，需要持续通入氧气。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【解答】解：A、果酒发酵所需的菌种是酵母菌，是真核生物，果醋发酵所需的菌种是醋酸菌，是原核生物，两者的细胞结构不同，A错误；
B、过程①为榨汁，果胶酶能分解细胞壁中的果胶，添加适量果胶酶，有利于提高出汁率，B正确；
C、过程②为果酒发酵，需要在无氧条件下进行，每日多次开盖会引入氧气抑制无氧呼吸，抑制酒精发酵，并增加杂菌污染风险，C错误；
D、过程③是利用乙醇的果醋发酵，醋酸菌利用乙醇产醋过程中不产生气体，不会产生大量气泡，也无需放气，D错误。
故选：B。
【点评】本题考查传统发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
9．（2025 山东）深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下，该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜，实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是（ ）
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 ﹣ + ﹣
② 常压 + ﹣ ﹣
③ 高压 ﹣ + ﹣
④ 高压 + ﹣ +
注：“+”表示有；“﹣”表示无
A．可用平板划线法对该菌计数
B．制备培养基的过程中，应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C．由②④组可知，在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长
D．由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】D
【分析】培养基是人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质；分为固体培养基和液体培养基，培养基中一般含有水、碳源、氮源和无机盐，其中碳源和氮源常采用蛋白胨和牛肉膏，因为它们来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。在提供上述几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对特殊营养物质和氧气的要求。
【解答】解：A、平板划线法主要用于微生物的分离和纯化，不能用于计数，计数通常采用稀释涂布平板法，A错误；
B、制备培养基时，应先进行高压蒸汽灭菌，再倒平板，若先倒平板再灭菌，会导致培养基被污染，B错误；
C、由②④组对比可知，②组在常压、以纤维素为唯一碳源的培养基上有菌落，④组在高压、以纤维素为唯一碳源的培养基上无菌落，说明在以纤维素为唯一碳源的培养基上，该菌可在常压下生长，C错误；
D、③组在高压、以淀粉为唯一碳源的培养基上无菌落，④组在高压、以纤维素为唯一碳源的培养基上有菌落，由③④组可知，高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长，D正确。
故选：D。
【点评】本题主要考查微生物培养的相关知识，考查学生对微生物接种方法的掌握情况和筛选微生物的过程的理解，难度适中。
10．（2025 选择性）科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素（C22H23ClN2O8）能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是（ ）
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；选择培养基．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】D
【分析】在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
【解答】解：A、以金霉素为唯一碳源的选择培养基，可以筛选出能利用金霉素为碳源的微生物，抑制其他不能利用金霉素微生物生长被抑制，从而达到筛选目的，A正确；
B、逐步提高金霉素浓度可模拟环境胁迫，筛选出耐受性更强的菌株，B正确；
C、制备选择培养基时，人为提供有利于目的菌生长的条件（包括营养、温度和pH等），C正确；
D、将菌液均匀地涂布在培养基表面需要用涂布器，D错误。
故选：D。
【点评】本题考查微生物培养的相关内容，要求学生能运用所学的知识正确作答。
11．（2025 浙江）传统发酵技术为我们提供了多种食品、饮料及调味品。下列叙述错误的是（ ）
A．泡菜的风味由乳酸菌的种类决定
B．用果酒发酵制作果醋的主要菌种是醋酸菌
C．家庭酿制米酒的过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸
D．传统发酵通常是利用多种微生物进行的混合发酵
【考点】果酒、果醋的制作；制作泡菜．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】A
【分析】1、参与果酒制作的微生物是酵母菌，其新陈代谢类型为异养兼性厌氧型。
2、参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
3、参与腐乳制作的微生物主要是毛霉，其新陈代谢类型是异养需氧型。腐乳制作的原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪分解成甘油和脂肪酸。
4、泡菜的制作原理：泡菜的制作离不开乳酸菌。在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸。
【解答】解：A、泡菜的风味不仅取决于乳酸菌的种类，还与原料的种类、发酵条件（如温度、时间、盐浓度等）以及可能存在的其他微生物等多种因素有关，并非仅由乳酸菌的种类决定，A错误；
B、果醋发酵是利用醋酸菌在有氧条件下将酒精氧化为醋酸，用果酒发酵制作果醋的主要菌种确实是醋酸菌，B正确；
C、家庭酿制米酒时，开始阶段酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖，随着氧气消耗，后期进行无氧呼吸产生酒精，所以该过程既有需氧呼吸又有厌氧呼吸，C正确；
D、传统发酵通常不进行严格的无菌操作，利用的是原材料或环境中多种微生物进行的混合发酵，D正确。
故选：A。
【点评】本题主要考查传统发酵的相关知识，要求学生有一定的理解分析能力，能够结合题干信息和所学知识进行分析应用。
二．多选题（共2小题）
（多选）12．（2025 河北）隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，是工业生产DHA（一种功能性脂肪酸）的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻，可用于DHA的发酵生产。下列叙述正确的是（ ）
A．隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B．采集海水中腐烂的叶片，湿热灭菌后接种到固体培养基，以获得隐甲藻
C．选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素，以减少杂菌生长
D．适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，以提高DHA产量
【考点】发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；解决问题能力．
【答案】ACD
【分析】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种技术。发酵工程的内容包括菌种选育、培养基的配制、灭菌、种子扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯（生物分离工程）等方面。
【解答】解：A、隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖，可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源，如纤维素等，A正确；
B、隐甲藻在湿热灭菌条件下会被杀死，B错误；
C、抗生素可抑制杂菌生长，有利于筛选隐甲藻，C正确；
D、隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻，提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量，从而提高DHA产量，D正确。
故选：ACD。
【点评】本题主要考查发酵工程的应用等内容，要求考生识记相关知识，并结合所学知识准确答题。
（多选）13．（2025 山东）酿造某大曲白酒的过程中，微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，制曲过程需经堆积培养，培养时温度可达60℃左右；将大曲和酿酒原料混合，初步发酵后放入窖池；窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法正确的是（ ）
A．堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B．大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C．窖池发酵过程中，酵母菌以无氧呼吸为主
D．窖池密封不严使酒变酸是因为乳酸含量增加
【考点】果酒、果醋的制作．
【专题】正推法；果酒、果醋、腐乳和泡菜的制作；理解能力．
【答案】BC
【分析】1、果醋制作中起到主要作用的微生物是醋酸菌，醋酸菌是一种好氧细菌，只有当氧气充足时，才能进行旺盛的生理活动，其代谢类型属于异养需氧型。当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解为醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。醋酸菌的最适生长温度为30～35℃。
2、果酒的制作离不开酵母菌，酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。故果酒的制作原理是酵母菌无氧呼吸产生酒精，酵母菌最适宜生长繁殖的温度范围是18～30℃；生产中是否有酒精的产生，可用酸性重铬酸钾来检验，该物质与酒精反应呈现灰绿色。
【解答】解：A、酿酒酵母适宜在适宜温度下生长繁殖，堆积培养过程中温度达60℃左右，高温会抑制甚至杀死酿酒酵母，不利于筛选酿酒酵母，A错误；
B、大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物，而糖化是将淀粉分解为糖的过程，所以大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物，将原料中的淀粉分解，B正确；
C、窖池发酵过程中，初期氧气含量相对较多，酵母菌会进行有氧呼吸大量繁殖，后期氧气逐渐消耗，酵母菌以无氧呼吸产生酒精为主，C正确；
D、若窖池密封不严，酒变酸是因为醋酸菌在有氧条件下将酒精转化为醋酸，使醋酸含量增加，而不是乳酸含量增加，D错误。
故选：BC。
【点评】本题考查发酵技术的相关知识，要求考生识记果酒、果醋的制作原理等知识，意在考查考生的识记和分析能力。
三．解答题（共5小题）
14．（2025 云南）我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法，流程如图。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，需要进行灭菌以结束第一步发酵。
在两步发酵法的基础上，我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌（原始菌MCS）中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图a，MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时，产物含量变化曲线如图b。
回答下列问题：
（1）要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有 标记基因、目的基因、终止子、复制原点 。
（2）绘制图a需统计活菌数，常用方法是 稀释涂布平板法 。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是 能抑制细菌增殖 ，开始发挥作用的时间是 15h ，判断理由是 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升 。
（3）基于图b，利用IR3C三菌混菌发酵的产量 高于 （填“高于”或“低于”）MCS三菌混菌发酵的产量，其原因是 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C 。
【考点】发酵工程在食品、医药、农牧业等工业上的应用．
【专题】图像坐标类简答题；微生物的分离、培养和应用；理解能力．
【答案】（1）标记基因、目的基因、终止子、复制原点
（2）稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
（3）高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C
【分析】基因工程是指按照人类的愿望，将不同生物的遗传物质在体外人工剪切并和载体重组后转入细胞内进行扩增，并表达产生所需蛋白质的技术，基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化为人类提供有用产品及服务。
【解答】解：（1）基因工程中构建的基因表达载体，除启动子外、还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。
（2）统计活菌数目常用稀释涂布平板法，从图2看出，随着时间推移，种群数量不断增加，在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升，所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质诱导能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡，发挥作用的时间大约在15h。
（3）从图丙看出，IR3C三菌混菌发酵产生的2﹣酮﹣L﹣古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵产量高，因此可以推测，IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高，可能的原因是IR3C转入了ccdB基因，诱导细菌死亡，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C。
故答案为：
（1）标记基因、目的基因、终止子、复制原点
（2）稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15h 在15h时，IR3C数量下降，而MSC数量上升
（3）高于 IR3C转入了ccdB基因，阻止细胞增殖，减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖，从而更多山梨糖被用于合成维生素C
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力，运用所学知识综合分析问题的能力是解答本题的关键。
15．（2025 河南）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
（1）选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 。将培养后的菌液混匀并充分 稀释 ，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coliDNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 BamHⅠ 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 ，随后在含 卡拉胶 和 四环素 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度（保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键），如图2所示。根据分析结果，选择第 44 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小 。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；微生物的分离、培养和应用；基因工程；理解能力．
【答案】（1）在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
（2）BamHⅠ重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
（3）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
（4）44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【分析】基因工程的基本操作步骤主要包括四步：①目的基因的获取；②基因表达载体的构建；③将目的基因导入受体细胞；④目的基因的检测与表达。其中，基因表达载体的构建是基因工程的核心。
【解答】解：（1）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大，因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
（2）E.coliDNA连接酶只能连接具有黏性末端的片段，因此切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRV酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自连、甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有BamHI酶切位点。T4DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
（3）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种可分解卡拉胶，使其菌落周围形成透明圈，且重组质粒上含有四环素抗性基因，因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
（4）据图可知，虚线长度代表氨基酸间的空间距离，由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小，因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
故答案为：
（1）在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
（2）BamHⅠ重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
（3）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
（4）44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
16．（2025 广东）大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。
回答下列问题：
（1）研究者首先构建质粒①（图a）用于在细胞内表达C﹣末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及 核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ） 检测，筛选获得重组菌株W1。
（2）将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有 稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 （答一种）。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 。培养结果（图b）表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 。
（3）研究者选用启动子Px、X基因（编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录），重新构建质粒②（图a），导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为 先上升后保持稳定 。
（4）莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路： 首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒② 。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】正推法；微生物的分离、培养和应用；基因工程；理解能力．
【答案】（1）核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）
（2）稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
（3）先上升后保持稳定
（4）首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒②
【分析】1、基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。（4）目的基因的检测与鉴定。
2、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物能使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。用于PCR的引物长度通常为20—30个核苷酸。
3、启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因的上游，紧挨转录的起始位点，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终表达出人类需要的蛋白质。
【解答】解：（1）在基因工程中，筛选重组菌株时，常用的检测方法除了PCR，还有核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）。核酸分子杂交可以检测目的基因是否导入受体细胞以及是否转录，抗原﹣抗体杂交可以检测目的基因是否表达出相应的蛋白质。
（2）检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法（通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度）、显微镜直接计数法（利用血细胞计数板在显微镜下直接对细胞进行计数）。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰，作为空白对照。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C﹣末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。
（3）在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在培养初期，细胞处于快速生长阶段，随着细胞数量的增加，阻遏蛋白X的量相对不足，PX启动子可能会有一定程度的启动，从而合成mKate2，使荧光强度上升；随着培养的进行，阻遏蛋白X的量逐渐增多，对PX启动子的阻遏作用增强，转录受到抑制，荧光强度保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为先上升后保持稳定。
（4）为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶因被降解而减少对莽草酸的转化；同时导入质粒②，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸。
故答案为：
（1）核酸分子杂交（或DNA﹣DNA分子杂交、DNA﹣RNA分子杂交、抗原﹣抗体杂交 ）
（2）稀释涂布平板法、显微镜直接计数法 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGro在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解
（3）先上升后保持稳定
（4）首先对野生型大肠杆菌进行改造，增强酶A的活性，降低酶B的活性；然后导入质粒①和质粒②
【点评】本题考查基因工程和微生物培养的相关知识，意在考查学生的识记能力和判断能力、运用所学知识综合分析问题的能力。
17．（2025 北京）链霉菌A能产生一种抗生素M，可用于防治植物病害，但产量很低。为提高M的产量，科研人员用紫外线和亚硝酸对野生型链霉菌A的孢子悬液进行诱变处理，筛选M产量提高的突变体（M+株），以应用于农业生产。
（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的 碱基序列（或脱氧核苷酸序列） ，诱发基因突变。
（2）因基因突变频率低，孢子悬液中突变体占比很低；又因基因突变的 不定向 性，M+株在全部突变体中的占比低。要获得M+株，需进行筛选。
（3）链霉菌A主要进行孢子繁殖。研究者对链霉菌A发酵液进行了粗提浓缩，得到粗提液，测定粗提液对野生型链霉菌A孢子萌发的影响，结果如图。由图可知，粗提液对野生型孢子萌发有 抑制 作用。
（4）随后研究者进行筛选实验。诱变处理后，将适量孢子悬液涂布在含有不同浓度粗提液的筛选平板上，每个浓度的筛选平板设若干个重复，28℃培养7天。从每个浓度的筛选平板上挑取100个单菌落，再次分别培养后逐一测定M+产量，统计结果如表。
组别 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
筛选平板中粗提液浓度（mL/100mL） 2 5 8 10 12 15
所取菌落中M+株占比（%） 0 13 25 65 20 3
①用图中信息，解释表中Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组的原因。 Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活
②表中Ⅲ组和Ⅴ组中M+株占比接近，但在筛选平板上形成的菌落有差异。下列叙述正确的有 CD （多选）。
A．Ⅲ组中有野生型菌落，而Ⅴ组中没有野生型菌落
B．Ⅴ组中有M产量未提高的突变体菌落，而Ⅲ组中没有
C．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体在Ⅴ组中被抑制
D．与Ⅲ组相比，诱变处理后的孢子悬液中更多的M+株在Ⅴ组中被抑制
综上所述，用粗提液筛选是获得M+株的有效方法。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因突变的概念、原因、特点及意义．
【专题】坐标曲线图；对照实验思想；对比分析法；基因重组、基因突变和染色体变异；解决问题能力．
【答案】（1）碱基序列（或脱氧核苷酸序列）
（2）不定向
（3）抑制
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活 ②CD
【分析】基因突变
（1）概念：DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而引起的基因结构改变．基因突变若发生在配子中，将遵循遗传规律传递给后代；若发生在体细胞中则不能遗传。
（2）诱发因素可分为：
①物理因素（紫外线、X射线及其他辐射能损伤细胞内的DNA）；
②化学因素（亚硝酸、碱基类似物等能改变核酸的碱基）；
③生物因素（某些病毒的遗传物质能影响宿主细胞的DNA）。
【解答】解：（1）紫外线和亚硝酸均通过改变DNA的碱基序列（或脱氧核苷酸序列），诱发基因突变。因为基因突变是指DNA分子中发生碱基对的替换、增添和缺失，而这些处理会影响DNA的碱基组成和排列顺序。
（2）基因突变具有不定向性，即一个基因可以向不同的方向发生突变，产生一个以上的等位基因，所以即使发生了基因突变，也不一定是我们想要的M+株。
（3）由图可知，随着培养基中粗提液浓度的升高，野生型孢子萌发率下降，所以粗提液对野生型孢子萌发有抑制作用。
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，结合前面得出粗提液对孢子萌发有抑制作用，且M+株可能对粗提液有更强的耐受性，所以在较高浓度的粗提液下，更多的野生型孢子萌发受抑制，而M+株相对更容易存活，导致Ⅳ组M+株占比明显高于Ⅲ组。
②A、Ⅴ组中也可能有野生型菌落，只是可能由于粗提液浓度更高，其生长受到了更强的抑制，A 错误；
B、Ⅲ组和Ⅴ组中都可能有M+ 产量未提高的突变体菌落，B 错误；
C、Ⅴ组粗提液浓度高于Ⅲ组，与Ⅲ组相比，所取菌落中M+株占比也降低，诱变处理后的孢子悬液中更多的突变体（包括非M+株的突变体）在Ⅴ组中被抑制，C正确；
D、从结果看，Ⅴ组M+株占比低，是因为更多的M+株在Ⅴ组中被抑制，D 正确。
故选：CD。
故答案为：
（1）碱基序列（或脱氧核苷酸序列）
（2）不定向
（3）抑制
（4）①Ⅳ组粗提液浓度高于Ⅲ组，更多的野生型孢子萌发受抑制，M+株相对更容易存活 ②CD
【点评】解答此题需要掌握基因突变的相关知识，需要较强的识图能力和逻辑思维能力。
18．（2025 安徽）稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题。
（1）采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用 稀释涂布平板法 （填方法）将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是 分离不同条件下生长的内生放线菌 。
（2）经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R﹣U和下游片段R﹣D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的 大量扩增 。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落 ② （填序号），出现菌落④的可能原因是 重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中 。
（3）内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。 设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【考点】微生物的选择培养（稀释涂布平板法）；基因工程的操作过程综合．
【专题】图文信息类简答题；微生物的分离、培养和应用；基因工程；实验探究能力．
【答案】（1）稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
（2）大量扩增 ②重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中
（3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【分析】1、PCR原理：目的基因受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3'端，如此重复循环多次。由于延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸。
【解答】解：（1）根据题意，要观察菌落的生长情况，可用等量的研磨液进行稀释涂布。由于水稻叶片有不同的内生放线菌，在不同选择培养基，不同温度下培养内生放线菌，可分离不同条件下生长的内生放线菌。
（2）PCR是通过半保留复制对DNA进行大量扩增。若R基因被敲除，引物1和2只能扩增出R﹣U和R﹣D片段，长度为1000bp；出现菌落④的可能原因是重组质粒上的R﹣U与内生放线菌DNA的R﹣U互换后，形成了一个含R基因和重组质粒的长链DNA，导致引物1和2扩增后得到了7000bp的片段。
（3）实验思路是：设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
故答案为：
（1）稀释涂布平板法 分离不同条件下生长的内生放线菌
（2）大量扩增 ②重组质粒上的R﹣U（或R﹣D）与内生放线菌DNA的R﹣U（或R﹣D）互换后，重组质粒整合到了内生放线菌的基因组中
（3）设置三个培养基，甲和乙为正常培养基，丙为缺铁的正常培养基，并在三个培养基上均接种等量的稻瘟病致病菌，甲和丙不作处理，乙接种适量内生放线菌，培养相同时间后观察，可以看到乙和丙中的稻瘟病致病菌的菌落直径均小于甲。
【点评】本题综合考查了微生物培养、基因工程等内容，旨在考查考生对知识的综合应用能力，以及实验设计能力。
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