第3章 基因工程章末复习 课件(共62张PPT)-2025-2026学年 高中生物 人教版 选择性必修 第三册
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| 名称 | 第3章 基因工程章末复习 课件(共62张PPT)-2025-2026学年 高中生物 人教版 选择性必修 第三册 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 2.4MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-08-04 20:45:10 | ||
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文档简介
(共62张PPT)
章末复习课
第三章 基因工程
生物学
学习目标
①通过复习基因工程的基本原理和操作流程，结合抗虫棉案例，强化生命观念与科学思维能力，提升对基因工程核心原理和操作逻辑的理解。（生命观念）
②通过分析基因工程在抗虫棉研发中的应用，梳理基因工程操作流程的逻辑关系，提升运用科学思维解决实际问题的能力，提升对基因工程原理和应用的系统性理解。（科学思维）
③通过对蛋白质工程改造抗虫蛋白的复习，回顾实验设计的关键步骤，提升在复习中整合知识、设计实验方案的能力，进一步提升科学探究素养。（科学探究）
④结合基因工程和蛋白质工程在农业等领域的应用实例，回顾基因工程技术和蛋白质工程技术对社会和人类健康的积极影响，增强对科学知识应用的社会责任感。（社会责任）
学习重难点
重点：
1.基因工程的基本工具与操作流程（包括PCR扩增目的基因）。
2.基因工程和蛋白质工程在农业等领域的典型应用。
难点：
1.限制酶和载体构建的双酶切策略。
2.PCR扩增过程的关键条件。
章末复习
情境导入
中国农科院郭三堆研究员为代表的科研人员通过基因工程的方法，培育出转基因抗虫棉，不仅有效控制了棉铃虫和红铃虫的危害，而且打破了抗虫棉主要依赖美国进口的局面。我国培育出多种类型的转基因抗虫棉新品种，这些新品种不仅保证了棉花高产、稳产、优质，还较好地保护了生态环境，提升了我国农业高新技术的国际竞争力。
尽管 Bt 微生物制剂和转基因抗虫棉已经在全球范围内取得了巨大成功， 但是抗虫蛋白存在毒力有限、抗虫谱较窄、害虫对 Bt 抗虫蛋白的抗性上升等诸多问题，严重制约Bt 抗虫蛋白在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。
基因工程的基本工具
章末复习
任务一
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
资料1：将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。
实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。
如图表示常用的限制酶识别序列和切割
位点以及质粒上的限制酶切割位点。
请思考以下问题：
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
(3)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？
防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
深度思考：若目的基因内部存在MunⅠ酶切位点，应该如何调整实验方案？
①寻找与 Mun I 产生相同黏性末端的其他限制酶（同尾酶），以避免内部切割。
②重新设计引物引入新的酶切位点：通过 PCR 引物设计，在目的基因的两端引入新的酶切位点，避开 MunI的切割位点。
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
【拓展训练1】(2023·新课标卷，6)
某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
C
章末复习
[任务一]基因工程的基本工具
【解析】
酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
章末复习
【归纳总结】限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
章末复习
【归纳总结】限制酶的选择
(2)保留 原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
标记基因、启动子、终止子、复制原点
SmaⅠ
章末复习
【归纳总结】限制酶的选择
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点是：
即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择 和 两种限制酶。
①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接
Pst Ⅰ
EcoR Ⅰ
章末复习
【归纳总结】限制酶的选择
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
基因工程的基本操作程序
章末复习
任务二
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
回答下列问题：
(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
章末复习
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？
经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n－2n)个。
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
活动一：利用PCR技术扩增Bt基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
（1）农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入的目的分别是什么？
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
(2)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？
目的基因应插入启动子与终止子之间。
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
深度思考
（1）在抗虫棉培育过程中，为了防止花粉随意传播导致的“基因污染”，可以采取什么措施？
①叶绿体转基因技术：将目的基因转入作物的叶绿体基因组中。由于植物的花粉一般只含有核基因组，而不含叶绿体基因组，因此通过该技术获得的转基因植物花粉本身不含转基因，从而限制了转基因通过花粉传播。
②雄性不育技术：利用雄性不育植株，将抗虫基因导入这些植株中。雄性不育植株的花粉无法正常发育或传播，从而限制了基因通过花粉的传播。
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
（2）为了优化Bt基因的表达，提高转基因抗虫棉的抗虫效果，科研工作者选择不同的启动子开展实验，启动子的作用是什么？如何检测效果情况？
启动子作用：启动子是基因表达调控的重要元件，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
检测方法：①抗原——抗体杂交法：通过特异性抗体检测Bt蛋白在转基因棉花中的表达水平。
②个体性状检测：将棉铃虫幼虫放置在转基因棉花叶片上，观察其生长发育情况和死亡率，评估抗虫效果。
章末复习
【拓展训练2】
制备荧光标记的 DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA 聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP 和碱基被荧光标记的 dATP）的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链 DNA 区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链 DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
D
章末复习
【解析】
题干中给定的条件为“在反应管中只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸”，其中缺少引物和模板，所以加入的单链DNA既要提供模板，又要同时作为引物。分析给定的四组DNA，均可以形成双链DNA，且②④两组的引物还可以自身折叠，结合题干信息“本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”可知自身折叠部分无法形成，所以给定引物均可以两两结合形成双链DNA区作为模板和引物进行延伸，需要注意的是提供的原料中只有dATP的碱基被荧光标记，故要想得到带有荧光标记的DNA探针，扩增的模板链中应含碱基T。
章末复习
分析反应管①～④中加入的单链DNA，看哪种情况下可得到符合要求的双链DNA，即带有荧光标记的DNA探针，如表所示：
章末复习
①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3‘端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，根据题干信息“在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条单链可以形成双链DNA区，由于合成DNA的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3’端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3‘端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
章末复习
【归纳总结】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号
(正常情况下，不编码氨基酸)
基因工程与蛋白质工程的应用
章末复习
任务三
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
资料3：近年来，科学家们通过引入双价抗虫基因，进一步提高了抗虫棉的抗虫效果。双价抗虫基因是指将两个具有不同杀虫机制的基因（如Bt基因和CpTI基因）共同转入棉花。Bt基因编码的Bt毒素能够杀死或抑制害虫的生长和繁殖，而CpTI基因编码的蛋白酶抑制剂可以抑制害虫消化道中的蛋白酶，阻止其消化功能，从而增强抗虫效果。
资料4：亚洲玉米螟因APN受体发生Q212L突变，导致Cry1Ac蛋白抗虫效果下降。科研团队计划利用蛋白质工程对Cry1Ac的β-片层区（450-470位氨基酸）进行改造，以恢复其与突变受体的结合能力。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
（1）上述抗虫棉能抗病毒、细菌、真菌吗？为什么？
不能。抗虫基因具有专一性，体内未导入抗病毒、细菌和真菌的基因。
(2)从环境保护和抗虫效果角度出发，分析双价抗虫棉与单基因转基因抗虫棉、普通棉相比在害虫防治方面的优越性有哪些。
与单基因抗虫棉相比，增强了对害虫的杀伤力，还延缓了害虫对单一抗虫基因产生抗性的速度。与普通棉相比，减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
(3)请结合资料4，利用蛋白质工程对上述蛋白进行功能改造，提升抗虫棉的抗虫效果。
从预期功能出发（恢复Cry1Ac与突变APN受体的结合能力） → 设计蛋白质结构（调整β-片层区的化学性质） → 推测氨基酸序列 → 改造或合成基因（通过基因定点突变）→ 获得所需要的蛋白质。
通过ELISA结合实验（原理抗原—抗体结合，检测Cry1Ac蛋白和APN受体的结合能力）和活体饲喂实验，验证Cry1Ac-M的结合效率及杀虫效果。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
不同之处
1.操作对象和层面
基因工程：主要是对基因进行操作。
蛋白质工程：主要是对蛋白质进行改造。
2.技术手段
基因工程：常用的技术手段包括基因克隆、基因重组、限制酶切割和DNA连接酶连接等。
蛋白质工程：常用的技术手段包括基因定点突变、PCR技术等。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
不同之处
3.应用目标和结果
基因工程：主要目标是将苏云金芽孢杆菌的杀虫基因转移到其他生物中，使其具有抗虫特性。
蛋白质工程：主要目标是优化苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，提高其性能。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
联系
1.基础联系。基因工程是蛋白质工程的基础。蛋白质的合成是由基因控制的，通过对基因的操作可以间接影响蛋白质的合成和功能。例如，基因工程中对Cry基因的改造可以直接影响其编码的Cry蛋白的性质。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
2.共同目标。两者在利用苏云金芽孢杆菌时，共同的目标是提高其杀虫效果，开发更高效、更环保的生物农药。例如，基因工程和蛋白质工程都可以通过改造Cry基因或Cry蛋白，提高其对特定害虫的杀虫活性。
3.相互促进。基因工程为蛋白质工程提供了基因资源和表达系统。例如，通过基因工程将Cry基因导入大肠杆菌中，使其高效表达，为蛋白质工程提供了大量的Cry蛋白进行改造。
章末复习
【归纳总结】判断基因工程和蛋白质工程
(1)如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换、增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。
(2)如果合成的蛋白质是自然界中已存在的蛋白质(天然蛋白质)，则是基因工程；如果合成的蛋白质与天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。
【练习1】
当堂训练
用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
D
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
【解析】
【练习2】
RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是( )
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等
D
当堂训练
过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。
【解析】
【练习3】
自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
当堂训练
【练习3】
下列相关叙述错误的是( )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ
C．同时使用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率
D．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
B
当堂训练
靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ，则会将终止子一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B错误。
【解析】
【练习4】
(不定项)苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性，但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是( )
A．对Cry蛋白的改造是通过直接替换Cry蛋白中的氨基酸来实现的
B．Cry蛋白的毒性提高了3～7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构
C．改造Cry蛋白应从Cry蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构
D．使用蛋白质工程改造Cry蛋白过程中需要使用限制酶和DNA连接酶
AC
当堂训练
对Cry蛋白的改造是通过改造Cry蛋白的相关基因来实现的，A错误；改造Cry蛋白应从Cry蛋白的预期功能出发设计其特有的结构，并改造或合成相关基因，C错误。
【解析】
【练习5】
当堂训练
研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-____ _-3'和5'-____ __-3'。
低
4
GTTT
AAAC
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素___________筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
卡那霉素
SacⅠ
④
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，由图可知该序列中有两个该酶切位点，因此最多可产生4种黏性末端。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-AAAC-3'。
【解析】
(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
【解析】
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测呢却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为（1/2）×（1/2）=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【解析】
课堂小结
谢谢大家
章末复习课
第三章 基因工程
生物学
学习目标
①通过复习基因工程的基本原理和操作流程，结合抗虫棉案例，强化生命观念与科学思维能力，提升对基因工程核心原理和操作逻辑的理解。（生命观念）
②通过分析基因工程在抗虫棉研发中的应用，梳理基因工程操作流程的逻辑关系，提升运用科学思维解决实际问题的能力，提升对基因工程原理和应用的系统性理解。（科学思维）
③通过对蛋白质工程改造抗虫蛋白的复习，回顾实验设计的关键步骤，提升在复习中整合知识、设计实验方案的能力，进一步提升科学探究素养。（科学探究）
④结合基因工程和蛋白质工程在农业等领域的应用实例，回顾基因工程技术和蛋白质工程技术对社会和人类健康的积极影响，增强对科学知识应用的社会责任感。（社会责任）
学习重难点
重点：
1.基因工程的基本工具与操作流程（包括PCR扩增目的基因）。
2.基因工程和蛋白质工程在农业等领域的典型应用。
难点：
1.限制酶和载体构建的双酶切策略。
2.PCR扩增过程的关键条件。
章末复习
情境导入
中国农科院郭三堆研究员为代表的科研人员通过基因工程的方法，培育出转基因抗虫棉，不仅有效控制了棉铃虫和红铃虫的危害，而且打破了抗虫棉主要依赖美国进口的局面。我国培育出多种类型的转基因抗虫棉新品种，这些新品种不仅保证了棉花高产、稳产、优质，还较好地保护了生态环境，提升了我国农业高新技术的国际竞争力。
尽管 Bt 微生物制剂和转基因抗虫棉已经在全球范围内取得了巨大成功， 但是抗虫蛋白存在毒力有限、抗虫谱较窄、害虫对 Bt 抗虫蛋白的抗性上升等诸多问题，严重制约Bt 抗虫蛋白在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。
基因工程的基本工具
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任务一
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[任务一]基因工程的基本工具
资料1：将从苏云金杆菌中获取的Bt基因转入棉花细胞内培育转基因抗虫棉的过程中，需借助多种分子工具且经历多个操作步骤。
实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒。
如图表示常用的限制酶识别序列和切割
位点以及质粒上的限制酶切割位点。
请思考以下问题：
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[任务一]基因工程的基本工具
(1)请用图示法写出限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割后形成黏性末端的过程。
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[任务一]基因工程的基本工具
限制酶EcoRⅠ：
限制酶NheⅠ：
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[任务一]基因工程的基本工具
(2)切割图示中的目的基因应选用哪类限制酶？请说明理由。
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[任务一]基因工程的基本工具
用限制酶MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。限制酶MunⅠ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶NheⅠ和SpeⅠ切割后形成的黏性末端相同，实验人员使用限制酶EcoRⅠ和NheⅠ切割质粒，应选用MunⅠ和SpeⅠ切割目的基因。
(3)用两种不同的限制酶切割目的基因的优点是什么？
防止质粒和目的基因的自我环化及质粒和目的基因的反向连接。
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[任务一]基因工程的基本工具
深度思考：若目的基因内部存在MunⅠ酶切位点，应该如何调整实验方案？
①寻找与 Mun I 产生相同黏性末端的其他限制酶（同尾酶），以避免内部切割。
②重新设计引物引入新的酶切位点：通过 PCR 引物设计，在目的基因的两端引入新的酶切位点，避开 MunI的切割位点。
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[任务一]基因工程的基本工具
【拓展训练1】(2023·新课标卷，6)
某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示
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[任务一]基因工程的基本工具
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
C
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[任务一]基因工程的基本工具
【解析】
酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。
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【归纳总结】限制酶的选择
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择 ，而不选择 。
PstⅠ
SmaⅠ
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【归纳总结】限制酶的选择
(2)保留 原则：质粒作为载体必须具备标记基因，所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择 。若载体上有两个及以上的标记基因，则可合理对其中一些标记基因进行酶切破坏，从而达到比一个标记基因更高的筛选成功率，防止只有一个标记基因时出现的“假阳性”(即未成功导入目的基因的载体也能正常表达标记基因，造成无效筛选)。
标记基因、启动子、终止子、复制原点
SmaⅠ
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【归纳总结】限制酶的选择
(3)善用“双酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和载体上存在多种酶切位点时，一般需要选择在目的基因所在序列和载体上都存在切割位点的两种不同的限制酶，对目的基因所在序列和载体进行剪切，即“双酶切法”。其优点是：
即用DNA连接酶连接后形成的重组DNA分子上，目的基因和载体启动子的方向必须是相同的，否则目的基因导入后无法正常表达。如图甲、乙也可选择 和 两种限制酶。
①防止目的基因环化；②避免目的基因与载体反向连接
Pst Ⅰ
EcoR Ⅰ
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【归纳总结】限制酶的选择
(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指来源不同，但能产生相同黏性末端的限制酶。当不适合选择某种限制酶时，可用其同尾酶替换，以获得相同的黏性末端。
基因工程的基本操作程序
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任务二
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[任务二]基因工程的基本操作程序
引物是指一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。在DNA扩增时，DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，因此复制DNA时应加入两种引物。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
回答下列问题：
(1)什么是引物？DNA复制时为什么需要引物？
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[任务二]基因工程的基本操作程序
不需要，只要知道Bt基因两端的部分核苷酸序列即可(以便根据这部分序列合成两种引物)。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
回答下列问题：
(2)PCR扩增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列吗？
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[任务二]基因工程的基本操作程序
引物是依据Bt毒蛋白基因的一段已知序列设计合成的(或引物能与Bt基因的cDNA特异性结合)。
活动一：利用PCR技术扩增Bt目的基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
(3)为检测Bt基因在转基因抗虫棉细胞中是否转录，科研人员提取棉花细胞中的总RNA，经逆转录过程获得总cDNA，通过PCR技术可在总cDNA中专一性地扩增出Bt基因的cDNA，原因是什么？
章末复习
(4)PCR扩增过程中的循环图示与规律如图所示，若一个Bt基因在PCR中经过n轮循环，理论上得到多少个DNA分子？含引物的DNA分子多少个？含其中一种引物的DNA分子多少个？同时含两种引物的DNA分子多少个？共需要消耗多少个引物？含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？含等长脱氧核苷酸链的DNA分子多少个？
经过n轮循环，得到2n个DNA分子，含引物的DNA分子2n个，含其中一种引物的DNA分子数(2n－1)个，同时含两种引物的DNA分子(2n－2)个，共需要消耗(2n＋1－2)个引物。含不等长脱氧核苷酸链的DNA分子2n个，含等长脱氧核苷酸链的DNA分子(2n－2n)个。
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[任务二]基因工程的基本操作程序
不需要解旋酶，因为PCR过程中，DNA双链在高温下即可完成解旋。由于PCR过程温度较高，故所需要的DNA聚合酶应具有耐高温的特点。
活动一：利用PCR技术扩增Bt基因
资料2：Bt抗虫蛋白基因(简称Bt基因)是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因，筛选Bt基因后可以利用PCR技术对其进行大量扩增。
(5)PCR扩增Bt基因的过程中需要解旋酶吗？并说明理由。所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
（1）农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入的目的分别是什么？
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
章末复习
[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
(2)为了保证目的基因在受体细胞中能正确表达，对目的基因在质粒中的插入位点有什么要求？
目的基因应插入启动子与终止子之间。
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[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
深度思考
（1）在抗虫棉培育过程中，为了防止花粉随意传播导致的“基因污染”，可以采取什么措施？
①叶绿体转基因技术：将目的基因转入作物的叶绿体基因组中。由于植物的花粉一般只含有核基因组，而不含叶绿体基因组，因此通过该技术获得的转基因植物花粉本身不含转基因，从而限制了转基因通过花粉传播。
②雄性不育技术：利用雄性不育植株，将抗虫基因导入这些植株中。雄性不育植株的花粉无法正常发育或传播，从而限制了基因通过花粉的传播。
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[任务二]基因工程的基本操作程序
活动二：利用农杆菌转换法培育抗虫棉
（2）为了优化Bt基因的表达，提高转基因抗虫棉的抗虫效果，科研工作者选择不同的启动子开展实验，启动子的作用是什么？如何检测效果情况？
启动子作用：启动子是基因表达调控的重要元件，位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
检测方法：①抗原——抗体杂交法：通过特异性抗体检测Bt蛋白在转基因棉花中的表达水平。
②个体性状检测：将棉铃虫幼虫放置在转基因棉花叶片上，观察其生长发育情况和死亡率，评估抗虫效果。
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【拓展训练2】
制备荧光标记的 DNA探针时，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA 聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸（dCTP、dTTP、dGTP 和碱基被荧光标记的 dATP）的反应管①～④中，分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链 DNA 区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链 DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有（ ）
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
D
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【解析】
题干中给定的条件为“在反应管中只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸”，其中缺少引物和模板，所以加入的单链DNA既要提供模板，又要同时作为引物。分析给定的四组DNA，均可以形成双链DNA，且②④两组的引物还可以自身折叠，结合题干信息“本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”可知自身折叠部分无法形成，所以给定引物均可以两两结合形成双链DNA区作为模板和引物进行延伸，需要注意的是提供的原料中只有dATP的碱基被荧光标记，故要想得到带有荧光标记的DNA探针，扩增的模板链中应含碱基T。
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分析反应管①～④中加入的单链DNA，看哪种情况下可得到符合要求的双链DNA，即带有荧光标记的DNA探针，如表所示：
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①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，但双链DNA区之外的3‘端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有自身互补的序列，根据题干信息“在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”，故一条单链DNA分子不发生自身环化，但两条单链可以形成双链DNA区，由于合成DNA的链中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列，且双链DNA区之外的3’端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，一条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的3‘端有模板和碱基T，因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。
章末复习
【归纳总结】启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 DNA DNA mRNA mRNA
位置 目的基因上游 目的基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
功能 RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 使转录在所需要的地方停下来 翻译的起始信号(编码氨基酸) 翻译的结束信号
(正常情况下，不编码氨基酸)
基因工程与蛋白质工程的应用
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任务三
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[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
资料3：近年来，科学家们通过引入双价抗虫基因，进一步提高了抗虫棉的抗虫效果。双价抗虫基因是指将两个具有不同杀虫机制的基因（如Bt基因和CpTI基因）共同转入棉花。Bt基因编码的Bt毒素能够杀死或抑制害虫的生长和繁殖，而CpTI基因编码的蛋白酶抑制剂可以抑制害虫消化道中的蛋白酶，阻止其消化功能，从而增强抗虫效果。
资料4：亚洲玉米螟因APN受体发生Q212L突变，导致Cry1Ac蛋白抗虫效果下降。科研团队计划利用蛋白质工程对Cry1Ac的β-片层区（450-470位氨基酸）进行改造，以恢复其与突变受体的结合能力。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
（1）上述抗虫棉能抗病毒、细菌、真菌吗？为什么？
不能。抗虫基因具有专一性，体内未导入抗病毒、细菌和真菌的基因。
(2)从环境保护和抗虫效果角度出发，分析双价抗虫棉与单基因转基因抗虫棉、普通棉相比在害虫防治方面的优越性有哪些。
与单基因抗虫棉相比，增强了对害虫的杀伤力，还延缓了害虫对单一抗虫基因产生抗性的速度。与普通棉相比，减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
(3)请结合资料4，利用蛋白质工程对上述蛋白进行功能改造，提升抗虫棉的抗虫效果。
从预期功能出发（恢复Cry1Ac与突变APN受体的结合能力） → 设计蛋白质结构（调整β-片层区的化学性质） → 推测氨基酸序列 → 改造或合成基因（通过基因定点突变）→ 获得所需要的蛋白质。
通过ELISA结合实验（原理抗原—抗体结合，检测Cry1Ac蛋白和APN受体的结合能力）和活体饲喂实验，验证Cry1Ac-M的结合效率及杀虫效果。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
不同之处
1.操作对象和层面
基因工程：主要是对基因进行操作。
蛋白质工程：主要是对蛋白质进行改造。
2.技术手段
基因工程：常用的技术手段包括基因克隆、基因重组、限制酶切割和DNA连接酶连接等。
蛋白质工程：常用的技术手段包括基因定点突变、PCR技术等。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
不同之处
3.应用目标和结果
基因工程：主要目标是将苏云金芽孢杆菌的杀虫基因转移到其他生物中，使其具有抗虫特性。
蛋白质工程：主要目标是优化苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白，提高其性能。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
联系
1.基础联系。基因工程是蛋白质工程的基础。蛋白质的合成是由基因控制的，通过对基因的操作可以间接影响蛋白质的合成和功能。例如，基因工程中对Cry基因的改造可以直接影响其编码的Cry蛋白的性质。
章末复习
[任务三]基因工程与蛋白质工程的应用
【合作交流】基因工程和蛋白质工程用到了苏云金芽孢杆菌，请结合所学知识对二者在其利用方面存在的不同和联系进行归纳。
2.共同目标。两者在利用苏云金芽孢杆菌时，共同的目标是提高其杀虫效果，开发更高效、更环保的生物农药。例如，基因工程和蛋白质工程都可以通过改造Cry基因或Cry蛋白，提高其对特定害虫的杀虫活性。
3.相互促进。基因工程为蛋白质工程提供了基因资源和表达系统。例如，通过基因工程将Cry基因导入大肠杆菌中，使其高效表达，为蛋白质工程提供了大量的Cry蛋白进行改造。
章末复习
【归纳总结】判断基因工程和蛋白质工程
(1)如果仅将基因用限制酶从DNA片段中切割下来，没有经过对编码蛋白序列进行修饰、加工，或仅对其调控序列进行加工，则属于基因工程；如果将目的基因经过了一些实质性的改造，如对编码蛋白序列进行了碱基替换、增添或缺失某几个碱基，则属于蛋白质工程。
(2)如果合成的蛋白质是自然界中已存在的蛋白质(天然蛋白质)，则是基因工程；如果合成的蛋白质与天然蛋白质有差异，甚至是自然界中所没有的，则为蛋白质工程。
【练习1】
当堂训练
用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
D
A．若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
若用Hind Ⅲ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，转录的产物可能不同，A正确；若用PvuⅠ酶切，重组质粒和质粒中都有四环素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四环素)培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；DNA凝胶电泳技术可以分离出不同大小的DNA片段，重组质粒的大小与原质粒不同，能够鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；Sph Ⅰ的酶切位点位于四环素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重组质粒中含氨苄青霉素抗性基因(AmpR)，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet的培养基中不能形成菌落，D错误。
【解析】
【练习2】
RT－PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术，可利用此技术获取目的基因，具体过程如图所示。下列说法不正确的是( )
A．设计扩增目的基因的引物时需考虑目的基因两端的碱基序列
B．G/C含量高的引物在与模板链结合时，复性的温度较高
C．该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D．过程Ⅰ需要加入缓冲液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等
D
当堂训练
过程Ⅰ是逆转录过程，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和引物A等，D错误。
【解析】
【练习3】
自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如图)，通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
当堂训练
【练习3】
下列相关叙述错误的是( )
A．上述获得蓝色玫瑰的方案中不需要转入能调控液泡pH的基因
B．将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ
C．同时使用Spe Ⅰ和Sac Ⅰ能提高idgS基因和Ti质粒的重组效率
D．sfp和idgS基因具有各自的启动子，表达是相互独立进行的
B
当堂训练
靛蓝能够稳定显色，不受pH的影响，故本题方案中不需要转入能调控液泡pH的基因，A正确；将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是Pme Ⅰ和BamH Ⅰ，则会将终止子一同切除，故只能用BamH Ⅰ，B错误。
【解析】
【练习4】
(不定项)苏云金芽孢杆菌中的杀虫晶体蛋白Cry具有杀虫毒性，但Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限等问题，制约了其在农业生产中的进一步应用。科学家通过定点突变，将Cry蛋白第168位的组氨酸替换为精氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了3倍；将Cry蛋白第282位、第283位的丙氨酸和亮氨酸分别替换成甘氨酸和丝氨酸后，Cry蛋白对烟草天蛾的毒性提高了7倍。下列有关叙述错误的是( )
A．对Cry蛋白的改造是通过直接替换Cry蛋白中的氨基酸来实现的
B．Cry蛋白的毒性提高了3～7倍的原因可能是改变了该蛋白质的空间结构
C．改造Cry蛋白应从Cry蛋白基因的脱氧核苷酸序列出发设计其特有的结构
D．使用蛋白质工程改造Cry蛋白过程中需要使用限制酶和DNA连接酶
AC
当堂训练
对Cry蛋白的改造是通过改造Cry蛋白的相关基因来实现的，A错误；改造Cry蛋白应从Cry蛋白的预期功能出发设计其特有的结构，并改造或合成相关基因，C错误。
【解析】
【练习5】
当堂训练
研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-____ _-3'和5'-____ __-3'。
低
4
GTTT
AAAC
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素___________筛选到具有该抗生素抗性的植株①∶④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是______，其中纯合的突变植株是______（填序号）。
卡那霉素
SacⅠ
④
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，由图可知该序列中有两个该酶切位点，因此最多可产生4种黏性末端。根据图甲所示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-AAAC-3'。
【解析】
(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在差异，BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。
【解析】
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测呢却发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为（1/2）×（1/2）=1/4，纯突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【解析】
课堂小结
谢谢大家