第1节 重组DNA技术的基本工具
知识点一 基因工程及其诞生与发展
1.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是（ ）
A.定向提取生物体的DNA分子
B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.定向地改造生物体的遗传性状
2.玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是（ ）
A.该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B.该技术的操作环境是生物体内
C.该技术的原理是基因重组
D.该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
3.科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是（ ）
A.所有生物共用一套遗传密码
B.基因能控制蛋白质的合成
C.兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D.兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
知识点二 重组DNA技术的基本工具
4.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
5.（2024·河南开封高二期末）以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（ ）
A.以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的
B.若要把相应片段连接起来，应选用DNA连接酶
C.上述能进行连接的两个黏性末端，其连接后形成的DNA序列是
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
6.（2024·天津静海高二阶段练习）有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是（ ）
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的黏性末端不互补
C.DNA连接酶的作用位点是a处
D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是“CAATTG”
7.（2024·湖北孝感期末）20世纪60年代末美国微生物学家哈密尔顿·史密斯发现第一种限制性内切核酸酶，获得了开启DNA宝藏的钥匙，目前已发现的限制酶超过了四千种，极大地推动了对DNA分子的研究和操作。表中列出了几种限制酶的识别序列和切割位点。下列叙述正确的是（ ）
限制酶 识别序列和切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATCC-3'
Sau3A Ⅰ 5'-↓GATC-3'
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3'
Kpn Ⅰ 5'-GGTAC↓C-3'
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
A.表中的6种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端相互连接后，不能再被Sau3AⅠ切割
C.Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的末端相互连接后，可以重新被Acc65Ⅰ或KpnⅠ切割
D.分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA，前者得到的片段长度明显短于后者
8.下图为不同限制酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（ ）
A.若DNA上的碱基随机排列，理论上每4 096个碱基对会有一个BamH Ⅰ限制酶的切割位点
B.若DNA上的碱基随机排列，Not Ⅰ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低
C.作为基因工程的通用载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位点
D.BamHⅠ限制酶切割的DNA无法连接到用Bgl Ⅱ切割的载体DNA中
知识点三 DNA的粗提取与鉴定
9.以菜花为材料进行“DNA粗提取与鉴定”的实验，下列操作与其目的错误的是（ ）
选项 A B C D
加入试剂 蒸馏水 2 mol/LNaCl溶液 研磨液 95％的冷酒精
目的 使细胞破裂 溶解DNA 裂解细 胞膜 析出DNA
10.（2024·广东珠海高二期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B.DNA不溶于95％的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.新鲜的洋葱和猪肝可作为实验材料提取DNA，而菠菜不能用于提取DNA
D.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
11.（2024·山东聊城期末）“SDS法”是提取DNA的常用方法，其提取液成分中的SDS能使蛋白质变性，EDTA是DNA酶抑制剂，Tris作为缓冲剂。下列说法错误的是（ ）
A.SDS能破坏蛋白质空间结构，从而促进DNA和蛋白质分离
B.EDTA能减少DNA水解，提高DNA的完整性
C.Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定，保证DNA结构正常
D.提取到的DNA可在常温下用二苯胺试剂进行鉴定
12.某线性DNA分子含有5 000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是（ ）
酶a切割产物长度/bp 酶b再次切割产物长度/bp
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000； 500
A.酶a与酶b切断的化学键不相同
B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C.该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有 3个和2个
D.若酶a完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有4种
13.（2024·河北衡水冀州一中期中）酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。下列叙述错误的是（ ）
A.多个片段乙与多个片段丁混合在一起，可用DNA连接酶拼接得到环状DNA
B.多个片段乙与多个片段丁混合，只由两个DNA片段连接成的DNA共有4种
C.一种限制性内切核酸酶只能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列
D.若酶M特异性剪切的DNA片段是，则酶N特异性剪切的DNA片段是
14.（2024·山东枣庄高二期末）如表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，错误的是（ ）
限制酶名称 识别序列和 切割位点 限制酶名称 识别序列和 切割位点
BamHⅠ ↓ GGATCC KpnⅠ ↓ GGATCC
EcoRⅠ ↓ CAATTC Sau3AⅠ ↓ GATC
HindⅡ ↓ GTYRAC SmaⅠ ↓ CCCGGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.限制酶SmaⅠ切割后形成的末端不能用E.coli DNA连接酶连接
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
15.图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段，几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点如下：
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
回答下列问题。
（1）限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有 。
（2）经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与上述其余限制酶中的 （填限制酶名称）切割后得到的DNA片段连接，理由是 。图中甲质粒经Sau3AⅠ完全切割后可得到 种DNA片段。
（3）图甲中的TetR和AmpR在载体上可作为 ，用于重组DNA的筛选。
16.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。
（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于
。
（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复 键，成功获得了重组质粒，说明 。
（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无AmpR和TetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面蘸上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是 ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是 。
17.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
↓ ↓ ↓ ↓
GAATTC CCCGGG CTGCAG GATATC
CTTAAG GGGCCC GACGTC CTATAG
↑ ↑ ↑ ↑
限制酶：EcoRⅠ SmaⅠ PstⅠ EcoRⅤ
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和 T4 DNA 连接酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是 。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能 ；质粒DNA分子上有 ，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是 。
第1节 重组DNA技术的基本工具
1.D 基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物体的遗传性状，D正确。
2.B 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。
3.D 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
4.B DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。
5.A 从黏性末端是否相同可以看出，①④是由同一种限制酶切割的，其他片段是由不同的限制酶切割的，因此以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的，A错误；DNA相应片段的连接应用DNA连接酶，B正确；①④黏性末端相同，连接后形成的DNA序列是，C正确；DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D正确。
6.D 切割产生甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别序列为CAATTG∥GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为CTTAAG∥GAATTC。三者的识别序列和切割位点不同，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子；但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，a处是磷酸二酯键，C正确。切割产生甲的限制酶的识别序列为“GAATTC”，D错误。
7.D 表中的6种限制酶切割形成的末端中，均为黏性末端，A错误；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端，可以相互连接，连接形成的DNA序列中还存在Sau3AⅠ的识别序列和切割位点，故能再被Sau3AⅠ切割，B错误；Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的黏性末端序列无法配对，而且磷酸端（5'端）也不能与磷酸端（5'端）连接，既然不能连接也就不存在重新切割，C错误；Sau3A Ⅰ识别序列为4个碱基，而BglⅡ识别序列为6个碱基，因此分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA，前者得到的片段长度明显短于后者，D正确。
8.D BamH Ⅰ限制酶的识别序列具有6个碱基对，若DNA上的碱基随机排列，理论上每46＝4 096个碱基对会有一个BamHⅠ限制酶的切割位点，A正确；NotⅠ限制酶的识别序列具有8个碱基对，而其他三种限制酶的识别序列均为6个碱基对，故若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B正确；作为基因工程的最常用的载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位点，C正确；BamHⅠ限制酶切割的DNA产生的黏性末端和用BglⅡ切割的载体DNA产生的黏性末端可以互补配对，故BamHⅠ限制酶切割的DNA可以连接到用BglⅡ切割的载体DNA中，D错误。
9.A 植物细胞具有细胞壁，加入蒸馏水不会使细胞吸水涨破，A错误；DNA可溶于2 mol/L NaCl溶液，加入2 mol/L NaCl溶液是为了溶解DNA，B正确；加入研磨液的作用是裂解细胞膜，有利于DNA释放，C正确；DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，故加入95％的冷酒精可析出DNA，D正确。
10.B 家兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA含量高，并且材料易得的生物都可以作为提取DNA的材料，所以菠菜也可以作为提取DNA的材料，C错误；鉴定DNA时，应先将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂，进行沸水浴，冷却后溶液呈蓝色，D错误。
11.D 由题干可知，SDS能使蛋白质变性，破坏蛋白质空间结构，从而促进DNA和蛋白质分离，A正确；EDTA是DNA酶抑制剂，能减少DNA水解，提高DNA的完整性和总量，B正确；Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定，可以防止DNA结构被破坏，保证DNA结构正常，C正确；鉴定DNA的方法是沸水浴下用二苯胺试剂鉴定，D错误。
12.C 酶a与酶b切断的化学键均为磷酸二酯键，A错误。酶a与酶b切出的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起来，B错误。由题表可知，限制酶a可以把DNA分子切成4段，说明该DNA分子上限制酶a的切割位点有3个；限制酶b把长度为2 100 bp的DNA片段切割成长度分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把长度为1 400 bp的DNA片段切割成长度分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明限制酶b在该DNA分子上有2个切割位点，所以酶a与酶b的识别序列分别有3个和2个，C正确。用酶a切割与该DNA序列相同的质粒（环状的），可得到3种大小不同的切割产物，D错误。
13.B 多个片段乙和多个片段丁混合在一起，用DNA连接酶拼接可得到环状DNA，A正确；多个片段乙和多个片段丁混合，只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有3种，即片段乙自身连接、片段丁自身连接，片段乙和片段丁连接，B错误；限制酶具有特异性，一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列，C正确；根据图中酶M和酶N切割后的结果，若酶M特异性剪切的DNA片段是，则酶N特异性剪切的DNA片段是，D正确。
14.D 限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，A正确；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
15.（1）磷酸二酯键 EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ （2）BamHⅠ、BclⅠ 它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端 3 （3）标记基因
解析：（1）限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏性末端。（2）经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒有3个Sau3AⅠ的切割位点（TetR上有1个，AmpR上有2个），所以经Sau3A Ⅰ完全切割后可得到3种DNA片段。（3）图甲中的TetR和AmpR都是抗性基因，在载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的筛选。
16.（1）筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞
（2）如下所示：
目的基因
—G AATTC—…… —G AATTC—
—CTTAA G—…… —CTTAA G—
（3）磷酸二酯 两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同 （4）能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
解析：（1）质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞。（2）同一种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为见答案。（3）DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。（4）由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因TetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
17.（1）EcoRⅠ、PstⅠ EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoR Ⅴ （2）磷酸二酯键 （3）复制 一个至多个限制酶切割位点 选择性培养
解析：（1）由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有一个至多个限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。
5 / 5第1节 重组DNA技术的基本工具
导学 聚焦 1.运用结构与功能观，分析基因工程过程中三种基本工具的作用。 2.关注基因工程的诞生和发展历程， 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 3.明确DNA的粗提取与鉴定的原理，进行相关实验操作
知识点（一） 基因工程及其操作的工具酶
1.基因工程及其诞生与发展
（1）基因工程的概念
（2）基因工程的诞生和发展
基础理论 技术支持
①DNA是遗传物质的证明 ② 的提出和半保留复制的证明 ③中心法则的确立 ④遗传密码的破译 ①基因转移载体和工具酶的发现 ② 体外重组的实现 ③重组DNA表达实验的成功 ④DNA测序和合成技术的发明 ⑤ 技术的发明
2.基因工程的工具酶
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）——“分子手术刀”
①来源：主要来自 。
②功能：能够识别双链DNA分子的特定 ，并使每一条链中特定部位的 断开。
③结果：产生 或 。
（2）DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将 连接起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的 。
②种类及特点：在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
3.判断下列有关表述的正误
（1）基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。（ ）
（2）DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。（ ）
（3）限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。（ ）
（4）不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。（ ）
（5）DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。（ ）
探讨 探究基因工程的工具酶
1.已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为和，分析回答下列问题：
（1）在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
（2）限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列不同，切割位点 （填“相同”或“不同”），说明限制酶具有 。
（3）要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要 。
（4）请结合下图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
2.（1）DNA连接酶与DNA聚合酶是同类酶吗？在下面的箭头上标注相应的酶。
（2）两种酶作用的相同点是：都能形成 键。
（3）两种酶作用的不同点是：DNA聚合酶的作用是 ，DNA连接酶的作用是 。
（4）请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别。
①若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcoRⅠ）切割后所得， （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
②若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得， （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
1.基因工程的理论基础
2.限制酶与DNA连接酶的比较
（1）区别
项目 作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于基因表达载体的构建
（2）两者的关系可表示为
1.（2024·江苏淮安期末）基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是（ ）
A.限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5'末端
D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
2.DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是（ ）
A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B.DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D.有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
知识点（二） 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.种类：质粒、 、动植物病毒等。
2.常用载体——质粒
（1）化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 分子。
（2）质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
能在细胞中进行 ，随受体DNA同步复制 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个 供外源DNA片段（基因）插入其中
常有特殊的 便于重组DNA分子的
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
（3）功能
①相当于一种运输工具，将外源基因送入 。
②携带 在受体细胞内大量复制。
3.判断下列有关表述的正误
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。（ ）
（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。（ ）
（3）载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。（ ）
（4）载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等。（ ）
探讨 探究载体需具备的条件和载体的选择
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图思考：
（1）所有载体都是质粒吗？为什么？
（2）将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
（3）根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
（4）若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
1.载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
2.基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别
1.（2024·山东枣庄高二联考）质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是（ ）
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
2.下面是四种不同质粒的结构模式图，其中ori为复制必需的序列，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A.基因AmpR和TetR是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因
B.质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和动植物病毒的DNA
C.限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D.用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长
知识点（三） DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
2.实验步骤
3.判断下列有关表述的正误
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。（ ）
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。（ ）
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。（ ）
探讨 探究DNA的粗提取与鉴定
1.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
2.上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？
3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
4.该实验进行了几次静置或离心，目的是什么？DNA是在上清液中还是在沉淀中？
1.DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），可选用鸡血细胞作材料。
（2）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
（3）提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。
（4）在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95％的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
2.DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同
项目 溶解规律 物质的量 浓度为 2 mol/L的 NaCl溶液 物质的量 浓度为 0.14 mol/L 的NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋 白 质 部分发生 盐析沉淀 溶解
1.（2022·山东高考13题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
2.（2024·江苏启东中学检测）如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述错误的是（ ）
A.图1中的溶液a是上清液
B.图1所示操作的原理是蛋白质等杂质能溶于酒精，而DNA不溶
C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D.图2中试管1的作用是证明2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
（1）限制性内切核酸酶的作用是
。
（2）E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用不同点是
。
（3）质粒作为基因工程的载体需具备的条件是
。
1.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
2.（2024·安徽宣城高二检测）下列关于转基因技术的叙述，错误的是（ ）
A.能将不同物种优良性状集中到一起，定向地改造生物的遗传性状
B.所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提
C.艾弗里等人通过实验证明遗传物质是DNA可以说是基因工程的先导
D.沃森、克里克解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗传信息流动的方向
3.（2024·天津蓟州高二期中）下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。下图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（ ）
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及 切割位点 ↓ AGCT TCGA ↑ ↓ GGATCC CCTAGG ↑ ↓ CCCGGG GGGCCC ↑ ↓ GATC CTAG ↑
A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的黏性末端能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割
C.DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D.E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低
4.（2024·重庆一中期末）下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同
B.细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的
C.质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所
D.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
5.（2024·北京东城高二期末）利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时（ ）
A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B.离心后上清液中加入75％冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA
C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D.可利用DNA在低温下遇二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定
第1节 重组DNA技术的基本工具
【核心要点·巧突破】
知识点（一）
自主学习
1.（1）转基因 DNA分子 遗传特性 生物类型
（2）DNA双螺旋结构 DNA PCR
2.（1）①原核生物 ②核苷酸序列 磷酸二酯键 ③黏性末端 平末端 （2）①两个DNA片段 限制酶 磷酸二酯键
3.（1）√
（2）× 提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。
（3）× 提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。
（4）√
（5）× 提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
互动探究
1.（1）① ②
（2）不同 专一性 （3）T4 DNA连接酶
（4）提示：断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
2.（1）DNA连接酶 DNA聚合酶 （2）磷酸二酯
（3）提示：将单个的脱氧核苷酸连接到已经形成的脱氧核苷酸链上 连接DNA分子的两个片段
（4）①能 ②不能
学以致用
1.B 限制酶EcoR Ⅰ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，形成2个游离的5'末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，故不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。
2.A DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。
知识点（二）
自主学习
1.噬菌体
2.（1）环状双链DNA （2）自我复制或整合到受体DNA上 限制酶切割位点 标记基因 筛选 （3）①受体细胞 ②外源基因
3.（1）× 提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
（2）√
（3）× 提示：质粒是DNA，细胞膜中的载体是蛋白质。
（4）√
互动探究
（1）提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体等。
（2）提示：不可行；因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
（3）提示：合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
（4）提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
学以致用
1.D 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物（如酵母菌）细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。
2.D 基因AmpR和TetR在同一个DNA分子上，不是一对等位基因，A错误；质粒是指一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，动植物病毒的DNA不属于质粒，B错误；限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；重组质粒④中，氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，因此用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长，D正确。
知识点（三）
自主学习
1. 酒精 NaCl溶液 2 mol/L 蓝色
2.纱布 4 酒精
3.（1）√
（2）× 提示：研磨之后，通过过滤或离心，DNA在上清液中。
（3）× 提示：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
互动探究
1.提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到白色丝状物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
2.提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，可以完整地缠在玻璃棒上。
3.提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
4.提示：2次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开，第1次操作后，DNA存在于上清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管沉淀中。
学以致用
1.B 低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少量蛋白质，D正确。
2.D 图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，A正确；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B正确；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
【过程评价·勤检测】
网络构建
（1）能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 （2）E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端 （3）能在宿主细胞进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因
课堂演练
1.C DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，A错误；DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误；有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接DNA片段的平末端，D错误。
2.D 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制，克里克提出中心法则，D错误。
3.B 限制酶BamH Ⅰ与Alu Ⅰ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamH Ⅰ切割↓
GGATCC
CCTAGG
↑ ，Sau3AⅠ切割↓
GATC
CTAG
↑，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，但是不能被BamHⅠ切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
4.D 细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本组成单位相同，都是脱氧核苷酸，A错误；细菌质粒的复制过程可在受体细胞内进行，B错误；细胞中蛋白质合成的场所是核糖体，C错误。
5.C 洋葱是植物细胞，其细胞壁有保护和支撑的作用，不会吸水涨破，A错误；在上清液中加入等体积的95％的冷酒精，白色丝状物是粗提取的DNA，B错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，所以将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象，C正确；DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂呈现蓝色反应，D错误。
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第1节 重组DNA技术的基本工具
导
学 聚
焦 1.运用结构与功能观，分析基因工程过程中三种基本工具的作
用。
2.关注基因工程的诞生和发展历程， 认同基因工程的诞生和发
展离不开理论研究和技术创新。
3.明确DNA的粗提取与鉴定的原理，进行相关实验操作
核心要点·巧突破
01
过程评价·勤检测
02
课时训练·提素能
03
目录
CONTENTS
核心要点·巧突破
01
精准出击 高效学习
知识点（一） 基因工程及其操作的工具酶
1. 基因工程及其诞生与发展
（1）基因工程的概念
（2）基因工程的诞生和发展
基础理论 技术支持
①DNA是遗传物质的证明 ② 的提出
和半保留复制的证明 ③中心法则的确立 ④遗传密码的破译 ①基因转移载体和工具酶的发现
② 体外重组的实现
③重组DNA表达实验的成功
④DNA测序和合成技术的发明
⑤ 技术的发明
DNA双螺旋结构
DNA
PCR
2. 基因工程的工具酶
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）——“分子手术刀”
①来源：主要来自 。
②功能：能够识别双链DNA分子的特定 ，并
使每一条链中特定部位的 断开。
③结果：产生 或 。
原核生物
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
平末端
（2）DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将 连接起来，恢复被
切开的两个核苷酸之间的 。
②种类及特点：
两个DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠
杆菌中分离得到的，称为E. coli DNA连接酶；另一类是从T4
噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。这两类酶都能将
双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯
键，但E. coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率
要远远低于T4 DNA连接酶。
3. 判断下列有关表述的正误
（1）基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向
的。 （ √ ）
（2）DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。 （ × ）
提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，
没有DNA聚合酶。
（3）限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。 （ × ）
提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之
失效，从而保护自身。
√
×
×
（4）不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。
（ √ ）
（5）DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。
（ × ）
提示：E. coli DNA连接酶不能连接平末端。
√
×
探讨 探究基因工程的工具酶
1. 已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别
为和 ，分析回答下列问题：
（1）在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
（2）限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列不同，切割位点
（填“相同”或“不同”），说明限制酶具有
。
（3）要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要
。
不
同
专一
性
T4
DNA连接酶
（4）请结合下图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯
键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗
几分子水？
提示：断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
2. （1）DNA连接酶与DNA聚合酶是同类酶吗？在下面的箭头上标注
相应的酶。
（2）两种酶作用的相同点是：都能形成 键。
磷酸二酯
（3）两种酶作用的不同点是：DNA聚合酶的作用是 ，DNA连
接酶的作用是 。
提示：将单个的脱氧核苷酸连接到已经形成的脱氧核苷酸链
上 连接DNA分子的两个片段
（4）请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再
经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所
用的限制酶识别。
①若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcoRⅠ）切割后
所得， （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识
别（如图）。
能
②若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得，
（填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
不能
1. 基因工程的理论基础
2. 限制酶与DNA连接酶的比较
（1）区别
项目 作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键
断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成
磷酸二酯键 用于基因表达载体的构建
（2）两者的关系可表示为
1. （2024·江苏淮安期末）基因工程中需使用多种工具酶，几种限制
酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是（ ）
C. 限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个
游离的5'末端
D. 若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA
连接酶相互连接
A. 限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的末端，可以通过E. coli DNA
连接酶相互连接
B. DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的
形成
解析： 限制酶EcoR Ⅰ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶
Sma Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E. coli DNA连接酶只能连接
黏性末端，而T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效
率较低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯
键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段
上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核
苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使
DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平
末端，形成2个游离的5'末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相
同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，故不一定能通
过DNA连接酶相互连接，D错误。
2. DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙
述，错误的是（ ）
A. DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B. DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C. DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D. 有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
解析： DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而
非任意的两个DNA片段，A错误。
知识点（二） 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1. 种类：质粒、 、动植物病毒等。
2. 常用载体——质粒
（1）化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞
细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力
的 分子。
噬菌体
环状双链DNA
（2）质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
能在细胞中进行
，随受体DNA同步
复制 能使目的基因稳定存在且数量
可扩增
有一个至多个 供外源DNA片段（基因）插入
其中
常有特殊的 便于重组DNA分子的
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免
受体细胞受到损伤
自我复制或整合
到受体DNA上
限制酶切割位点
标记基因
筛选
（3）功能
①相当于一种运输工具，将外源基因送入 。
②携带 在受体细胞内大量复制。
受体细胞
外源基因
3. 判断下列有关表述的正误
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基
因。 （ × ）
提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标
记基因。
（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。
（ √ ）
（3）载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。
（ × ）
提示：质粒是DNA，细胞膜中的载体是蛋白质。
（4）载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等。 （ √ ）
×
√
×
√
探讨 探究载体需具备的条件和载体的选择
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图思考：
（1）所有载体都是质粒吗？为什么？
提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体等。
（2）将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
提示：不可行；因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无
法进行自我复制和稳定存在以及表达。
（3）根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基
中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这
种说法是否合理？并说明理由。
提示：合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均
能在该培养基中存活。
（4）若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病
毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
1. 载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入
的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的
载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能
够抵抗相应抗生素，所以在受体
细胞的培养体系中加入该种抗生
素就可以只保留转入载体的受体
细胞，原理如图所示：
2. 基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别
1. （2024·山东枣庄高二联考）质粒是基因工程中最常用的目的基因
运载工具。下列有关叙述正确的是（ ）
A. 质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分
子
B. 在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C. 携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才
会随后者的复制而复制
D. 质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
解析： 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物（如酵母菌）
细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的
切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入
受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA
上后复制，C错误。
2. 下面是四种不同质粒的结构模式图，其中ori为复制必需的序列，
AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示同
一种限制酶的酶切位点。下列有关叙
述正确的是（ ）
A. 基因AmpR和TetR是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因
B. 质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和动植物病毒的
DNA
C. 限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D. 用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养
基上生长
解析： 基因AmpR和TetR在同一个DNA分子上，不是一对等位基
因，A错误；质粒是指一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细
胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链
DNA分子，动植物病毒的DNA不属于质粒，B错误；限制酶的作用
部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；
重组质粒④中，氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破
坏，因此用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素
的培养基上生长，D正确。
知识点（三） DNA的粗提取与鉴定
1. 实验原理
2. 实验步骤
3. 判断下列有关表述的正误
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理
初步分离DNA与蛋白质。 （ √ ）
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。
（ × ）
提示：研磨之后，通过过滤或离心，DNA在上清液中。
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。
（ × ）
提示：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
√
×
×
探讨 探究DNA的粗提取与鉴定
1. 实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产
生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA
量变少，导致看不到白色丝状物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
2. 上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？
提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析
出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防
止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温
有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅
拌可防止丝状DNA破碎，可以完整地缠在玻璃棒上。
3. 实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方
向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
4. 该实验进行了几次静置或离心，目的是什么？DNA是在上清液中
还是在沉淀中？
提示：2次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开，第1次操
作后，DNA存在于上清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色
丝状物或离心管沉淀中。
1. DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺
乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），可选用鸡血细胞
作材料。
（2）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
（3）提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解
DNA。
（4）在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95％的酒精的
作用是溶解杂质和析出DNA。
2. DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同
项目 溶解规律 物质的量浓度为2
mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白
质 部分发生盐析沉淀 溶解
1. （2022·山东高考13题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列
说法错误的是（ ）
A. 过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B. 离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C. 在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D. 粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析： 低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃
冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了
使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂
呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少
量蛋白质，D正确。
2. （2024·江苏启东中学检测）如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验
中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述错误的是（ ）
A. 图1中的溶液a是上清液
B. 图1所示操作的原理是蛋白质等杂质能溶于酒
精，而DNA不溶
C. 图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导
致试管2中蓝色变化不明显
D. 图2中试管1的作用是证明2 mol/L的NaCl溶液
遇二苯胺出现蓝色
解析： 图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得
到的上清液，A正确；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶
于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂
质能溶于酒精，B正确；图2所示操作中的错误是试管中的液面高
于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用
是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
过程评价·勤检测
02
反馈效果 筑牢基础
（1）限制性内切核酸酶的作用是
。
（2）E. coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用不同点是
。
（3）质粒作为基因工程的载体需具备的条件是
。
能够识别双链DNA分子的特定核
苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开
E. coli
DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，而
T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端
能在宿主细胞进行
自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；具有
一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因
1. DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述
正确的是（ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
解析： DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，A错误；DNA聚合酶
能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错
误；有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又
能连接DNA片段的平末端，D错误。
2. （2024·安徽宣城高二检测）下列关于转基因技术的叙述，错误的
是（ ）
A. 能将不同物种优良性状集中到一起，定向地改造生物的遗传性状
B. 所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提
C. 艾弗里等人通过实验证明遗传物质是DNA可以说是基因工程的先导
D. 沃森、克里克解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗
传信息流动的方向
解析： 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制，克
里克提出中心法则，D错误。
3. （2024·天津蓟州高二期中）下表列举了几种限制酶的识别序列及
其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。下图是酶切后产生的
几种末端。下列说法正确的是（ ）
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序
列及 切割位
点 ↓ AGCT TCGA ↑ ↓ GGATCC CCTAGG ↑ ↓ CCCGGG GGGCCC ↑ ↓
GATC
CTAG
↑
B. Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的黏性末端能够相连，连接后
的片段还能被Sau3AⅠ切割
C. DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D. E. coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接
效率低
A. BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
解析： 限制酶BamH Ⅰ与Alu Ⅰ切割的均是磷酸二酯键，A错误；
BamH Ⅰ切割 ，Sau3AⅠ切割 ，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，但是不能被BamHⅠ切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E. coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
4. （2024·重庆一中期末）下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A. 细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同
B. 细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的
C. 质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所
D. 质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
解析： 细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本
组成单位相同，都是脱氧核苷酸，A错误；细菌质粒的复制过程
可在受体细胞内进行，B错误；细胞中蛋白质合成的场所是核糖
体，C错误。
5. （2024·北京东城高二期末）利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA
时（ ）
A. 可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B. 离心后上清液中加入75％冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的
DNA
C. 将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D. 可利用DNA在低温下遇二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行
鉴定
解析： 洋葱是植物细胞，其细胞壁有保护和支撑的作用，不会
吸水涨破，A错误；在上清液中加入等体积的95％的冷酒精，白色
丝状物是粗提取的DNA，B错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶
解度较大，所以将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，
会发生溶解现象，C正确；DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂呈现
蓝色反应，D错误。
课时训练·提素能
03
分级练习 巩固提升
知识点一 基因工程及其诞生与发展
1. 科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工
程。实施该工程的最终目的是（ ）
A. 定向提取生物体的DNA分子
B. 定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C. 在生物体外对DNA分子进行改造
D. 定向地改造生物体的遗传性状
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解析： 基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行
人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然
后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所
需的基因产物，也就是定向地改造了生物体的遗传性状，D正确。
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2. 玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力
于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该
应用技术的叙述，不正确的是（ ）
A. 该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B. 该技术的操作环境是生物体内
C. 该技术的原理是基因重组
D. 该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
解析： 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的
操作。
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3. 科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞
中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不
正确的是（ ）
A. 所有生物共用一套遗传密码
B. 基因能控制蛋白质的合成
C. 兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构
成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D. 兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
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解析： 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过
程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控
制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的
氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合
成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA
都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正
确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关
系，D错误。
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知识点二 重组DNA技术的基本工具
4. 限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是
（ ）
A. DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸
二酯键
B. 限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C. E. coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D. 限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的
DNA
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解析： DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只
能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正
确；E. coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错
误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的
DNA，D错误。
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5. （2024·河南开封高二期末）以下是几种不同限制性内切核酸酶切
割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（ ）
① ② ③
④ ⑤
A. 以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的
B. 若要把相应片段连接起来，应选用DNA连接酶
C. 上述能进行连接的两个黏性末端，
其连接后形成的DNA序列是
D. 限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
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解析： 从黏性末端是否相同可以看出，①④是由同一种限制酶
切割的，其他片段是由不同的限制酶切割的，因此以上DNA片段
是由4种限制酶切割后产生的，A错误；DNA相应片段的连接应用
DNA连接酶，B正确；①④黏性末端相同，连接后形成的DNA序列
是—CTGCAG—，C正确；DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”
起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D正确。
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6. （2024·天津静海高二阶段练习）有关如图所示的黏性末端的说
法，错误的是（ ）
A. 甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B. 甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的
黏性末端不互补
C. DNA连接酶的作用位点是a处
D. 切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是“CAATTG”
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解析： 切割产生甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，
切割产生乙的限制酶的识别序列为CAATTG∥GTTAAC，切割产生
丙的限制酶的识别序列为CTTAAG∥GAATTC。三者的识别序列和
切割位点不同，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶
切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接
酶的作用下形成重组DNA分子；但甲、丙的黏性末端不同，它们
之间不能形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶催化磷酸基团和
脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，a处是磷酸二酯键，C正确。切割产
生甲的限制酶的识别序列为“GAATTC”，D错误。
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7. （2024·湖北孝感期末）20世纪60年代末美国微生物学家哈密尔
顿·史密斯发现第一种限制性内切核酸酶，获得了开启DNA宝藏的
钥匙，目前已发现的限制酶超过了四千种，极大地推动了对DNA
分子的研究和操作。表中列出了几种限制酶的识别序列和切割位
点。下列叙述正确的是（ ）
限制酶 识别序列和切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATCC-3'
Sau3A Ⅰ 5'-↓GATC-3'
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限制酶 识别序列和切割位点
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3'
Kpn Ⅰ 5'-GGTAC↓C-3'
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
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A. 表中的6种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B. BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端相互连接后，不能再被Sau3AⅠ切
割
C. Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的末端相互连接后，可以重新被Acc65Ⅰ或
KpnⅠ切割
D. 分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA，前者得到的片段长度明
显短于后者
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解析： 表中的6种限制酶切割形成的末端中，均为黏性末端，A
错误；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端，可以相互连接，连接形
成的DNA序列中还存在Sau3AⅠ的识别序列和切割位点，故能再被
Sau3AⅠ切割，B错误；Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的黏性末端序列无
法配对，而且磷酸端（5'端）也不能与磷酸端（5'端）连接，既然
不能连接也就不存在重新切割，C错误；Sau3A Ⅰ识别序列为4个碱
基，而BglⅡ识别序列为6个碱基，因此分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割
随机序列DNA，前者得到的片段长度明显短于后者，D正确。
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8. 下图为不同限制酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述
错误的是（ ）
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A. 若DNA上的碱基随机排列，理论上每4 096个碱基对会有一个
BamH Ⅰ限制酶的切割位点
B. 若DNA上的碱基随机排列，Not Ⅰ限制酶切割位点出现频率较其他
三种限制酶低
C. 作为基因工程的通用载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位
点
D. BamHⅠ限制酶切割的DNA无法连接到用Bgl Ⅱ切割的载体DNA中
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解析： BamH Ⅰ限制酶的识别序列具有6个碱基对，若DNA上
的碱基随机排列，理论上每46＝4 096个碱基对会有一个BamHⅠ
限制酶的切割位点，A正确；NotⅠ限制酶的识别序列具有8个碱
基对，而其他三种限制酶的识别序列均为6个碱基对，故若DNA
上的碱基随机排列，NotⅠ限制酶切割位点出现频率较其他三种
限制酶低，B正确；作为基因工程的最常用的载体，质粒上通常
会有多种限制酶的切割位点，C正确；BamHⅠ限制酶切割的
DNA产生的黏性末端和用BglⅡ切割的载体DNA产生的黏性末端
可以互补配对，故BamHⅠ限制酶切割的DNA可以连接到用BglⅡ
切割的载体DNA中，D错误。
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知识点三 DNA的粗提取与鉴定
9. 以菜花为材料进行“DNA粗提取与鉴定”的实验，下列操作与其
目的错误的是（ ）
选项 A B C D
加入 试剂 蒸馏水 2 mol/L NaCl溶液 研磨液 95％的冷酒精
目的 使细胞破裂 溶解DNA 裂解细胞
膜 析出DNA
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解析： 植物细胞具有细胞壁，加入蒸馏水不会使细胞吸水涨
破，A错误；DNA可溶于2 mol/L NaCl溶液，加入2 mol/L NaCl溶液
是为了溶解DNA，B正确；加入研磨液的作用是裂解细胞膜，有利
于DNA释放，C正确；DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质
可以溶于酒精，故加入95％的冷酒精可析出DNA，D正确。
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10. （2024·广东珠海高二期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验
的叙述，正确的是（ ）
A. 用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B. DNA不溶于95％的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C. 新鲜的洋葱和猪肝可作为实验材料提取DNA，而菠菜不能用于提
取DNA
D. 鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
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解析： 家兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细
胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA含量高，并且材料
易得的生物都可以作为提取DNA的材料，所以菠菜也可以作为提
取DNA的材料，C错误；鉴定DNA时，应先将丝状物溶于2 mol/L
的NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂，进行沸水浴，冷却后溶液呈
蓝色，D错误。
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11. （2024·山东聊城期末）“SDS法”是提取DNA的常用方法，其提
取液成分中的SDS能使蛋白质变性，EDTA是DNA酶抑制剂，Tris
作为缓冲剂。下列说法错误的是（ ）
A. SDS能破坏蛋白质空间结构，从而促进DNA和蛋白质分离
B. EDTA能减少DNA水解，提高DNA的完整性
C. Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定，保证DNA结构正常
D. 提取到的DNA可在常温下用二苯胺试剂进行鉴定
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解析： 由题干可知，SDS能使蛋白质变性，破坏蛋白质空间结
构，从而促进DNA和蛋白质分离，A正确；EDTA是DNA酶抑制
剂，能减少DNA水解，提高DNA的完整性和总量，B正确；Tris作
为缓冲剂能维持pH的稳定，可以防止DNA结构被破坏，保证DNA
结构正常，C正确；鉴定DNA的方法是沸水浴下用二苯胺试剂鉴
定，D错误。
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12. 某线性DNA分子含有5 000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，
再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所
示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法
正确的是（ ）
酶a切割产物长度/bp 酶b再次切割产物长度/bp
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000；500
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A. 酶a与酶b切断的化学键不相同
B. 酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C. 该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有 3个和2个
D. 若酶a完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有4种
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解析： 酶a与酶b切断的化学键均为磷酸二酯键，A错误。酶a
与酶b切出的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起
来，B错误。由题表可知，限制酶a可以把DNA分子切成4段，说
明该DNA分子上限制酶a的切割位点有3个；限制酶b把长度为2
100 bp的DNA片段切割成长度分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA
片段，把长度为1 400 bp的DNA片段切割成长度分别为800 bp和
600 bp的两个DNA片段，说明限制酶b在该DNA分子上有2个切割
位点，所以酶a与酶b的识别序列分别有3个和2个，C正确。用酶a
切割与该DNA序列相同的质粒（环状的），可得到3种大小不同
的切割产物，D错误。
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13. （2024·河北衡水冀州一中期中）酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。下列叙述错误的是（ ）
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A. 多个片段乙与多个片段丁混合在一起，可用DNA连接酶拼接得到
环状DNA
B. 多个片段乙与多个片段丁混合，只由两个DNA片段连接成的DNA
共有4种
C. 一种限制性内切核酸酶只能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列
D. 若酶M特异性剪切的DNA片段是 ，则酶N特异性剪切的DNA片段是
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解析： 多个片段乙和多个片段丁混合在一起，用DNA连接
酶拼接可得到环状DNA，A正确；多个片段乙和多个片段丁混
合，只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有3种，即片段乙
自身连接、片段丁自身连接，片段乙和片段丁连接，B错误；限
制酶具有特异性，一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的核
苷酸序列，C正确；根据图中酶M和酶N切割后的结果，若酶M特
异性剪切的DNA片段是 ，则酶N特异性剪切的DNA片段
是 ，D正确。
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14. （2024·山东枣庄高二期末）如表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，错误的是（ ）
限制酶名称 识别序列和切割位点 限制酶名称 识别序列和切割位点
BamHⅠ ↓ GGATCC KpnⅠ ↓
GGATCC
EcoRⅠ ↓ CAATTC Sau3AⅠ ↓
GATC
HindⅡ ↓ GTYRAC SmaⅠ ↓
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注：Y＝C或T，R＝A或G。
A. 限制酶SmaⅠ切割后形成的末端不能用E. coli DNA连接酶连接
B. Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C. BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D. 一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析： 限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，A正确；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
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15. 图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段，几种可供选
择使用的限制酶识别序列及其切割位点如下：
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
回答下列问题。
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（1）限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序
列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的
断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后
能产生黏性末端的有 。
解析： 限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏性末端。
磷酸二
酯键
EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ
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（2）经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与上述其余限
制酶中的 （填限制酶名称）切割后得到的
DNA片段连接，理由是
。图中甲质粒经Sau3AⅠ完全切割后可得到 种
DNA片段。
BamHⅠ、BclⅠ
它们切割后产生的片段具有相同的
黏性末端
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解析：经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒有3个Sau3AⅠ的切割位点（TetR上有1个，AmpR上有2个），所以经Sau3A Ⅰ完全切割后可得到3种DNA片段。
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（3）图甲中的TetR和AmpR在载体上可作为 ，用于重组
DNA的筛选。
解析：图甲中的TetR和AmpR都是抗性基因，在载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的筛选。
标记基因
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16. 目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件
为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载
体，其主要结构如下图所示。
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（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于
。
解析：质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞。
筛选（鉴别）目的
基因是否导入受体细胞
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（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识
别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目
的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧
被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
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答案：如下所示：
目的基因
—G AATTC—…… —G AATTC—
—CTTAA G—…… —CTTAA G—
解析：同一种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相
同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后
所形成的黏性末端为见答案。
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（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经
BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目
的基因，通过DNA连接酶作用恢复 键，成功获得
了重组质粒，说明
。
解析：DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。
磷酸二酯
两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到
的黏性末端相同
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（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无AmpR和TetR的大肠
杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如
图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面蘸上菌
落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三
的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈
相对应的图二中的菌落表型是
，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是
。
能抗氨苄青霉素，但不能抗
四环素
pBR322质
粒
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解析：由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因TetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
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17. 用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人
类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限
制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
↓ ↓ ↓ ↓
GAATTC CCCGGG CTGCAG GATATC
CTTAAG GGGCCC GACGTC CTATAG
↑ ↑ ↑ ↑
限制酶：EcoRⅠ SmaⅠ PstⅠ EcoRⅤ
回答下列问题：
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（1）常用的DNA连接酶有E. coli DNA连接酶和 T4 DNA 连接
酶。上图中 酶切割后的DNA片段可以用E.
coli DNA连接酶连接。上图中
酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
解析：由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E. coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。
EcoRⅠ、PstⅠ
EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoR
Ⅴ
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（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的
化学键是 。
解析：DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。
磷酸二酯键
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（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒
DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能
；质粒DNA分子上有 ，便
于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗
生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细
胞，方法是 。
复
制
一个至多个限制酶切割位点
选择性培养
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解析：复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有一个至多个限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。
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