浙科版（2019）选择性必修三 1.2 纯净的目标微生物可通过分离和纯化获得 课件(共28张PPT)

(共28张PPT)
第一节　体液调节是通过化学信号实现的调节
第一章 发酵工程
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节　神经系统通过下丘脑控制内分泌系统
第二节 纯净的目标微生物可通过
分离和纯化获得
一、采用划线或涂布的接种方法能够实现对目标微生物的分离和纯化
1.单菌落：在固体培养基上通过接种、培养获得的由一个细胞分裂形成的、肉眼可见的、有一定形态构造的子细胞集团。
在固体培养基表面形成单菌落，可以用于菌种的分离、鉴定和纯化。
2．单菌落获取方法：
意义：
单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一.
单菌落分离或接种的方法：通过平板划线法和稀释涂布平板法等方法获得单菌落
（1）平板划线法：
原理 ：接种环划线的过程中，菌液被逐渐稀释，最终出现单个细菌，培养后形成单菌落。
方法：通常用接种环蘸取液体
培养物或挑取固体表面的微生物
后，在固体培养基表面进行连续
平行划线、扇形划线或其他形式
的划线，以实现接种的目的。
平板划线操作中三种灼烧的目的不同
1.蘸取菌液前灼烧
2.每次划线前灼烧
3.划线操作结束后灼烧
避免接种环上可能存在的微生物污染菌种。
杀死残留菌种，保证每次划线接种环上的菌种直接来源于上一次划线的末端。
及时杀死接种环上残留的菌种，避免菌种污染环境和感染操作者。
能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
用接种环蘸菌液____次，在固体培养基表面划线，下一次划线应从上一次划线的______开始。每次划线前接种环要 ，聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在数次划线后培养，可以在划线的末端出现不连续的 。若共划线五次，接种环要烧灼____次。另外：每次划线都不能与之前的线条_____；不能将最后一次划线与第一次划线相连；不能_____培养基。培养基需 后，放入培养箱培养。
划破
重叠
6
末端
1
灭菌
单菌落
倒置
注意：1.无论是何种划线法，蘸取菌种前和划线后，接种环都要灼烧灭菌。
2.无论是何种划线法，菌种只蘸取一次。
思考
1
2
3
4
5
（1）灼烧接种之后，要冷却后再进行操作，以免温度太高杀死菌种。
(2）划线时最后一区域不要与第一区域相连。
(3)划线用力要大小适当，防止用力过大划破培养基
(4)每次实验：划3个平板（重复实验）1个不接种（空白对照）
划线注意事项
（2）稀释涂布平板法
a.原理 ：用无菌水将菌液进行一系列的梯度稀释，在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的单菌落。
b.过程：
稀释菌液 （10-5 ~ 10-7倍）
涂布
培养
用移液管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液，依次方法得到10-5 ~ 10-7倍稀释液。
在培养皿侧面或底面做好标记后,用移液管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将涂布器放在酒精灯火焰上灼烧，待涂布器冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
将培养皿倒置，在37℃恒温箱中培养24~48h。
这样在稀释度适当的固体培养基表面也能得到单个细胞生长繁殖成的单菌落。根据菌落的形状，大小、颜色、边缘或表面光滑与否等特征可以选取目标微生物继续培养。
分离、计数微生物——稀释涂布平板法
例：将1g土样加到盛有99ml无菌水的三角瓶中，如图进行稀释，每个稀释度涂布三个平板，根据结果计算1g土样中菌的数量？
注意：
1.分离得到单菌落一般以培养皿中有20个以内菌落为宜。
2.计算微生物数量一般以培养皿中有30~300个菌落为宜。
（159+141+150）÷3×10×105
=1.5×108个/g
无法计数 159 17 2 0
无法计数 141 13 1 0
无法计数 150 11 3 1
9ml
无菌水
加入0.1ml稀释液（移液管）
现取5mL陈泡菜汁用于测定其中的乳酸菌含量,可采取 方法进行操作:取0.5mL泡菜汁逐级稀释至10-5,取10-4、10-5稀释液各0.ImL,分别接种到固体培养基,置于特定环境培养48h后，菌落计数。若培养結果如下图所示，则5mL陈泡菜汁中乳酸菌约 个.
稀释涂布
平板法
7x107
思考：
平板划线法 稀释涂布平板法
主要步骤 接种环在固体培养基表面连续划线 系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具 接种环 涂布器
能否用于计数 不能计数 可以计数，但是操作复杂，需涂布多个平板
培养结果
共同点 都能将微生物分散到固体培养基表面，以获得单菌落，达到分离纯化微生物的目的，也可用于观察菌落特征 两种分离、纯化菌种方法的比较
1．目的要求
(1)用平板划线法或稀释涂布平板法接种酵母菌。
(2)用液体培养基大量扩增酵母菌。
2．方法步骤
(1)制作平板：对两个直径为90 mm的培养皿进行标记，分别向其中倒入未凝固的固体培养基，使培养
基铺满培养皿底部，厚度约2 mm。
标记：班级、姓名、日期、接种稀释度、
LB或尿素。(底部或者侧边)
二、活动：接种、培养并分离酵母菌
(2)接种方法
平板划线法步骤：
a场所：超净工作台上，在酒精灯旁。
b在酒精灯火焰上从接种环的圆环处依次向上灼烧灭菌。为避免灭菌后接种环的高温烫死菌种，应在挑取菌种前将接种环贴在培养器内壁上降温。
c用接种环蘸取菌液进行接种:连续平行划线， 或扇形划线，或多次连续平行划线
d 接种环灼烧灭菌
e平板倒置，置于25℃，培养24h。
注意：初次划线时可参照培养皿底部的标记点进行划线，以保证有最好的划线分离效果。
（2）接种方法
稀释涂布平板法接种的步骤：
a场所：超净工作台上，在酒精灯旁。
b.用无菌水对酵母菌菌液进行一定浓度的稀释。
c.移液枪取0.1 mL的稀释菌液加入平板中央。
d.蘸有酒精的涂布器，应先在火焰上使酒精烧尽。对平板中的菌液进行涂布均匀。
e 接种环、涂布器灭菌
f平板倒置，置于25℃，培养24h。
注意：手持涂布器的部位应高于火焰，以免酒精沿器具流下，烧伤手指。
(3)将菌种接种到液体培养基中。在无菌条件下用接种环将菌液接种到液体培养基中，同时以不接种菌液的液体培养基作为对照。
3.观察培养结果。获得单菌落后，可挑取菌落，并利用平板划线法接种至斜面培养基中。
思考：在划线操作时，如果接种环不慎划破培养基，可以继续正常进行操作吗？为什么？
【答案】不能。因为划破培养基会造成划线不均匀，难以分离单菌落，可能导致微生物的无氧呼吸或杂菌污染。
讨论
1.判断液体培养基成功接种酵母菌的依据是什么？
2.如何判断是否分离出酵母菌的单菌落？判断依据是什么？
3.在固体培养基表面涂布的菌种是否出现形态、颜色不同的单菌落？你认为出现该现象的原因是什么？
4.仅从菌落特征是否能够认定你分离出了酵母菌？怎样进行进一步的鉴定？
否。①挑取单菌落接入糖水中,培养一段时间检查是否能产生酒味
②接入面团中观察能否发面;
③挑取菌落样品，制作临时装片，在显微镜下观察、识别
与未接种的培养基相比，接种的培养基由于酵母菌的增殖而变浑浊。
与用酵母菌纯种在固体培养基表面接种的结果相比，用样品稀释液接种的固体培养基表面出现特征相同的、最小菌落即认为可能是分离出了酵母菌单菌落。
若出现，可能是在接种过程中有杂菌污染
三、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
倒平板的具体要求
(1)培养基灭菌后，需冷却至60 ℃时才能倒平板
(2)整个操作在酒精灯火焰旁进行
(3)平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置
(4)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间，否则此培养基不能用来培养微生物
注意事项
二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
1.稀释涂布平板法（可计数活菌）
(2)原则：在保证能准确计数的前提下，减小稀释度。在实际操作中，适于计算的平板上菌落数的数目通常为30到300。统计的菌落数往往比活菌的实际数目要少，因为当两个或多个细胞，连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(3)计数要求：在同一稀释度下涂布3个(或3个以上)平板，取平均值。
(4)公式：每毫升菌液中微生物细胞的数量＝某一稀释倍数下至少3个培养皿的平均菌落数÷菌液稀释液体积×稀释倍数。
(1)原理： 当样品稀释度足够高时,平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时,通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。
计数原理：利用特定血细胞计数板，在显微镜下观察计数一定体积的样品中微生物的数量。
二、稀释涂布平板法和显微镜计数法可测定微生物的数量
2.显微镜计数法（血细胞计数板计数法）
1. 每个血细胞计数板的正中央有2个计数区（图上红圈内），任选一个区。每个计数区分 9个大方格，中央为红细胞计数区，4个角为白细胞计数区。
认识血细胞计数板
2. 中间的红细胞计数区共25个中方格（蓝色圈内），每个中方格又分为16个小方格，小方格共400个小方格（黑点）。
上下玻璃
间距0.1mm
计数区
计数区
红细胞计数区
V红=1mm*1mm*0.1mm
16中*25小
第 4 天
第 6 天
红细胞计数区
(2)原则：
①随机取样原则
“五点取样”
②压线：数上不数下，数左不数右
③3次计数后取平均值
充分混匀，取液
若5个中方格中细菌共计M个，该培养液中细菌浓度是________个/ml
Q：统计的菌数往往比活菌的实际数目要？
⑤用血细胞计数板对酵母菌计数时，吸取培养液前要轻轻振荡几次试管的目的是 。
使酵母菌分布均匀，计数准确
菌体的培养液
M/80×400×10× 1000
偏大,不能区分死菌和活菌
思考：
（1）先盖盖玻片再滴加菌液，让菌液自行渗入，多余的菌液用滤纸吸去。
（2）对压线细胞计数时，数上不数下，数左不数右。
（3）为减小误差，应对同一红细胞计数区中的细胞进行3次计数后取平均值。
(4)血细胞计数板计数时不能区分死菌和活菌。
显微镜计数法注意事项
例4：回答下列相关问题。
若计数室为1mm×1mm×0.1mm方格，由400个小方格组成，如果一个小方格内酵母菌过多,难以计数,应先_______后再计数。若多次重复计数后，算得每个小方格中平均有5个酵母菌，则10mL该培养液中酵母菌总数有________个。
稀释
2×108
例题5.红细胞计数区由25×16=400个小方格组成,容纳液体的总体积为0.1 mm3。现将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释,用无菌吸管吸取少许摇匀的酵母菌悬液滴在盖玻片边缘,使其自行渗入计数区,并用滤纸吸去多余菌液。
现观察到图中所示a、b、c、d、e5个中方格内共有酵母菌44个,则上述
1 mL酵母菌样品中约有菌体(　　)
A.2.2×108个 B.2.2×107个 C.2.2×106个 D.2.2×104个
A