第2课时 微生物的选择培养和计数
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
知识点1 选择培养基和微生物的选择培养
1．选择培养基
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的____________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在____________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时____________其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许__________的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基。
(3)选择培养基配方的设计
①原理：分解尿素的细菌合成的______将尿素分解产生NH3。
②培养基配方设计：以______为唯一氮源的选择培养基。
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
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2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
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2．微生物的选择培养
(1)方法
对土样进行充分稀释，然后再将______涂布到制备好的______培养基上。
(2)稀释涂布平板法的操作过程
①系列梯度稀释操作
a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL________。
b．将____ g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c．取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②涂布平板操作
取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到________表面
↓
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有______的烧杯中
↓
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒精燃尽、涂布器______后，再进行涂布
↓
涂布平板：用涂布器将______均匀地涂布在培养基表面。涂布时可______培养皿，使涂布均匀
(3)培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板______，放入30～37 ℃的____________中培养1～2 d，观察。
3．若要判断选择培养基是否起到筛选的作用，对照组应如何设置？
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基于对选择培养基和微生物的选择培养的认识，判断下列表述是否正确。
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 ( )
2．由于使用了选择培养基，因此实验不需要设置对照组。 ( )
3．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。 ( )
4．在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 ( )
1．通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。下表是从土壤中筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方。
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
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(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
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(3)为什么能分解尿素的微生物能在该培养基上生长？
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2．用平板划线法接种培养结果的图片如下。
请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
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3．当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养结果的图片如图。
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
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1．选择培养基的选择作用
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物
无氮培养基 分离自生固氮微生物
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者 石油作为唯一碳源的培养基 分离出能降解石油的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基 分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长 加入青霉素等抗生素 能分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长
加入高浓度的食盐 分离金黄色葡萄球菌
利用培养条件进行的选择培养 在高温环境中培养 分离耐高温的微生物
将培养基pH调至较低水平 分离耐酸的微生物
在无氧环境中培养 分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物
2．两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
接种工具 接种环 涂布器
单菌落 的获得 从最后划线区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落 ②用于计数
接种效果图
相同点 ①都能分离纯化菌种 ②都是在固体培养基上进行
1．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再用高压蒸汽灭菌法灭菌
B．步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，获得单菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
2．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图。下列有关叙述，错误的是( )
A．图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法
B．这两种方法所用的接种工具分别是接种针和接种环
C．图丙的接种方法是图乙
D．两种方法的接种操作都要在酒精灯火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域
知识点2 微生物的数量测定
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
(2)计数原则：一般选择菌落数为_________的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对 ___个平板进行重复计数，然后求出________。
(3)注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目____，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是______菌落。因此，统计结果一般用________而不是用活菌数来表示。
2．显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是________________的总和。
稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何？
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(选择性必修3 P18“相关信息”)酵母菌细胞、霉菌孢子等常用______________进行计数。细菌等较小的细胞用____________进行观察和计数。
基于对微生物的数量测定的认识，判断下列表述是否正确。
1．当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。 ( )
2．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 ( )
3．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。 ( )
某班同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
1．甲同学在稀释倍数为106的浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？若不可靠，应如何改进？
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2．下表数据是乙同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板获得的菌落数目。请计算每克土壤样品中的活菌数。
稀释度 平板1 平板2 平板3
1×104 320 360 356
1×105 212 234 287
1×106 21 23 18
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3．为什么选择菌落数为30～300的平板进行计数？
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两种微生物计数方法的比较
1．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A．某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B．3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D．该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
2．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的叙述，不正确的是( )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数
知识点3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
2．基础知识
组分 含量 提供的主要营养
KH2PO4 1.4 g ________
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
葡萄糖 10.0 g ______
尿素 1.0 g ______
琼脂 15.0 g ________
H2O 定容至1 000 mL 水
3．实验设计
(1)土壤取样
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表__________的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用________________________倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放____一点。
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养______和培养时间。细菌一般在________ ℃的温度下培养______ d。
②观察
a．观察方法：每隔____ h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的______、______和______等。
为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
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4．操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要______。
②实验操作均应在______________进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的________等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物学实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
判断下列表述是否正确。
1．测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同。 ( )
2．尿素分解菌产生的脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源。 ( )
3．菌落特征是鉴别菌种的重要依据。 ( )
1．测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？
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2．在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
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3．欲判断培养基是否具有选择作用和培养基是否有杂菌污染，应如何分别设置对照组？
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4．利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。
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5．细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何为分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？
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1．“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验结果分析
2．土壤中分解尿素的细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性增强，pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．(2022·江苏选择性考试)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是( )
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
2．分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物学实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题。
(1)分解尿素的微生物能产生________；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
(2)该小组在接种前， 随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间， 这样做的目的是__________________________；然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养________和培养________。
②观察：每隔24 h统计一次________数目，选取菌落数目________时的记录作为结果。
1．核心概念
选择培养基：指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．结论语句
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
(2)为确保结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )
A．菌落中的细菌数目是固定的
B．平板上的一个菌落就是一个细菌
C．通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D．平板上的一个单菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
3．判断选择培养基是否起到选择作用时，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是216和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题。
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是_______________ ___________________________________________________________________。
(3)一般依据尿素分解菌菌落的____________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数目为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
第2课时 微生物的选择培养和计数
知识点1
自主梳理
1．(1)水生栖热菌 70～80 ℃ (2)目的菌 抑制或阻止 特定种类 抑制或阻止 (3)脲酶 尿素 2．(1)菌液 选择 (2)无菌水 10 培养基 酒精 冷却 菌液 转动 (3)倒置 恒温培养箱
微思考
1．提示：从大豆田土壤中取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．提示：应从富含纤维素的土壤中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
3．提示：用牛肉膏蛋白胨培养基接种后在相同条件下同时培养。
基础诊断
1．× 提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。
2．× 提示：应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
3．× 提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开培养皿盖。
4．√
合作探究
1．(1)提示：提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素。
(2)提示：该选择培养基的配方中，尿素是唯一氮源，因此，只有能利用尿素的微生物和自生固氮微生物才能够生长。
(3)提示：分解尿素的微生物能合成脲酶将尿素分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的氮源。
2．提示：不能，平板划线法最开始的划线，细菌很可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌。
3．提示：稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液的细菌数量。
对点练习
1．C [配制培养基时，应先调pH后再用高压蒸汽灭菌法灭菌，防止杂菌污染，A正确；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，不需要加入牛肉膏和蛋白胨，C错误；步骤④鉴定细菌分解尿素的能力时，挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。]
2．B [图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法，A正确；这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器，B错误；图丙的接种方法是图乙，C正确；两种方法的接种操作都要在酒精灯火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域，D正确。]
知识点2
自主梳理
1．(1)活菌 活菌 (2)30～300 3 平均值 (3)少 一个 菌落数 2．活菌数和死菌数
微思考
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小。显微镜直接计数法计数的结果比实际值大。
教材隐性知识
血细胞计数板 细菌计数板
基础诊断
1．√
2．× 提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
3．× 提示：利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。
合作探究
1．提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
2．提示：1×105倍稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300，计算平均值为(212＋234＋287)/3≈244，由此可换算出每克土壤样品中的活菌数约为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
3．提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌种的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌种形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
对点练习
1．C [设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂布3个平板；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少，A正确。据题图可知，将10 g土样加入90 mL无菌水中定容至100 mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是 104 倍，B正确。5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109个，C错误。要判断选择培养基是否起到选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨的培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的菌落种类数目，则说明起到了选择作用，D正确。]
2．C [显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值偏小，显微镜直接计数时不能区分死菌和活菌，故统计值大于实际值，因此两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。]
知识点3
自主梳理
2．无机盐 碳源 氮源 凝固剂 3．(1)3～8 cm (2)1×104、1×105和1×106 宽 (3)温度 30～37 1～2 24 形状 大小 颜色 4．(1)灭菌 酒精灯火焰旁 (2)稀释度
微思考
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌种开始看不出来明显的菌落。
基础诊断
1．× 提示：土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度。
2．× 提示：脲酶能催化尿素分解产生NH3，NH3再转化为、等被植物吸收。
3．√
合作探究
1．提示：不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
2．提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
3．提示：判断培养基是否具有选择作用，还需用牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。判断培养基是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。
4．提示：不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
5．提示：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。
对点练习
1．D [农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A合理；为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B合理；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C合理；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成NH3，NH3会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D不合理。]
2．解析：(1)分解尿素的微生物能产生脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测平板灭菌是否合格。每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数＝(39＋42＋45)÷3÷0.1×10 000＝4.2×106个。(3)不同种类的微生物，在培养时往往需要不同的培养温度和培养时间，在培养过程中，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
答案：(1)脲酶 尿素 (2)检测平板灭菌是否合格 4.2×106 (3)①温度 时间 ②菌落 稳定
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1．D [不含有机物的培养基中能筛选出自养型微生物，如硝化细菌；缺氮培养基可以筛选出固氮微生物，如固氮菌；含尿素(不含其他氮源)的培养基能筛选出合成脲酶的微生物，如分解尿素的细菌，D正确。]
2．D [用稀释涂布平板法进行微生物计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，一般来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌，D正确。]
3．B [选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组判断选择培养基是否起到选择作用，需要用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
4．D [在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]
5．解析：(1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，用尿素作为氮源，因为只有能合成脲酶的细菌和自生固氮菌才能在该培养基上生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度和颜色等，据此来统计菌落的数目。1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含同种培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
答案：(1)脲酶 (2)无机盐 只有以尿素作为唯一氮源的细菌和自生固氮菌才能在该培养基上生长 (3)形状、大小 4.2×108 稀释涂布平板法 (4)单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含同种培养基)进行培养
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第2课时 微生物的选择培养和计数
第1章 发酵工程
第2节 微生物的培养技术及应用
1．举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
2．概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
课标要求
对应学生用书第18页
1．选择培养基
(1)自然界中目的菌的筛选
①实例：聚合酶链式反应(PCR)中用到的耐高温的DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出的____________中提取出来的。
②依据：水生栖热菌能在____________的高温条件下生存，而绝大多数微生物在此条件下不能生存。
知识点1 选择培养基和微生物的选择培养
水生栖热菌
70～80 ℃
(2)实验室中目的菌的筛选
①原理：人为提供有利于________生长的条件(包括营养、温度和pH等)，同时____________其他微生物的生长。
②方法：利用选择培养基分离。
选择培养基：允许__________的微生物生长，同时____________其他种类微生物生长的培养基。
(3)选择培养基配方的设计
①原理：分解尿素的细菌合成的______将尿素分解产生NH3。
②培养基配方设计：以______为唯一氮源的选择培养基。
目的菌
抑制或阻止
特定种类
抑制或阻止
脲酶
尿素
1．如何从大豆田土壤中分离出固氮微生物？
提示：从大豆田土壤中取土样，利用缺乏氮源的培养基可分离出固氮微生物。
2．要分离出分解纤维素的微生物，应在什么样的环境中取土样？应配制什么样的培养基？
提示：应从富含纤维素的土壤中取土样，如树林中多年落叶形成的腐殖土。应配制以纤维素为唯一碳源的培养基。
2．微生物的选择培养
(1)方法
对土样进行充分稀释，然后再将______涂布到制备好的______培养基上。
菌液
选择
(2)稀释涂布平板法的操作过程
①系列梯度稀释操作
a．编号为1×102～1×107试管中分别盛有9 mL________。
b．将____ g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。
c．取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
无菌水
10
②涂布平板操作
取菌液：取0.1 mL菌液，滴加到________表面
↓
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有______的烧杯中
↓
涂布器灭菌：将涂布器放在火焰上灼烧，待酒
精燃尽、涂布器______后，再进
行涂布
↓
培养基
酒精
冷却
涂布平板：用涂布器将______均匀地涂布在培养基
表面。涂布时可______培养皿，使涂布
均匀
菌液
转动
(3)培养
待涂布的菌液被培养基吸收后，将平板______，放入30～37 ℃的____________中培养1～2 d，观察。
倒置
恒温培养箱
3．若要判断选择培养基是否起到筛选的作用，对照组应如何设置？
提示：用牛肉膏蛋白胨培养基接种后在相同条件下同时培养。
基于对选择培养基和微生物的选择培养的认识，判断下列表述是否正确。
1．选择分解尿素的细菌的培养基为液体培养基。 ( )
提示：选择分解尿素的细菌的培养基为固体培养基，固体培养基具有分离、鉴定作用。
2．由于使用了选择培养基，因此实验不需要设置对照组。 ( )
提示：应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
×
×
3．在用涂布器涂布平板时，为了操作方便可完全打开培养皿盖。
( )
提示：为了防止杂菌污染，不能完全打开培养皿盖。
4．在同一稀释度下，至少要涂布3个平板。 ( )
×
√
1．通常1 g土壤中有几亿到几百亿个土壤微生物，其中，细菌的数量最多，能分解尿素的细菌是其中的一部分。下表是从土壤中筛选分解尿素的细菌的选择培养基的配方。
组分 含量
KH2PO4 1.4 g
Na2HPO4 2.1 g
MgSO4·7H2O 0.2 g
组分 含量
葡萄糖 10.0 g
尿素 1.0 g
琼脂 15.0 g
H2O 定容至1 000 mL
(1)该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
提示：提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素。
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
提示：该选择培养基的配方中，尿素是唯一氮源，因此，只有能利用尿素的微生物和自生固氮微生物才能够生长。
(3)为什么能分解尿素的微生物能在该培养基上生长？
提示：分解尿素的微生物能合成脲酶将尿素分解产生NH3，NH3可作为微生物生长的氮源。
2．用平板划线法接种培养结果的图片如下。
请结合图片分析，平板划线法能否达到对细菌进行计数的目的？为什么？
提示：不能，平板划线法最开始的划线，细菌很可能会长成一片，导致无法计数，此外灼烧接种环的时候也会杀死一部分细菌。
3．当菌液稀释倍数足够高时，培养基表面生长的一个单菌落来源于一个活菌。用稀释涂布平板法接种培养结果的图片如图。
与平板划线法相比，为什么稀释涂布平板法可以用于细菌的计数？
提示：稀释涂布平板法会进行等比稀释，在合适的稀释倍数下，均匀涂布得到的菌落互不接触，可以确定菌落的密度，再通过计算可以得知原液的细菌数量。
深化归纳
1．选择培养基的选择作用
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用营养缺陷选择培养基进行的选择培养 不加含碳有机物的无碳培养基 分离自养型微生物
无氮培养基 分离自生固氮微生物
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用微生物(目的菌)对某种营养物质的特殊需求，使该营养物质成为某类微生物的唯一供给者 石油作为唯一碳源的培养基 分离出能降解石油的微生物
尿素作为唯一氮源的培养基 分离能分解尿素的微生物
在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制部分微生物生长或利于部分微生物生长 加入青霉素等抗生素 能分离出酵母菌和霉菌等真菌，同时抑制细菌的生长
加入高浓度的食盐 分离金黄色葡萄球菌
选择培养原理 具体处理 分离菌种
利用培养条件进行的选择培养 在高温环境中培养 分离耐高温的微生物
将培养基pH调至较低水平 分离耐酸的微生物
在无氧环境中培养 分离厌氧微生物和兼性厌氧微生物
2．两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
纯化原理 通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释程度的菌液分别涂布到固体培养基的表面，进行培养，以得到单菌落
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种工具 接种环 涂布器
单菌落 的获得 从最后划线区域挑取 稀释度合适，整个平板上都可找到单菌落
用途 分离纯化菌种，获得单菌落 ①分离纯化菌种，获得单菌落
②用于计数
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
接种效 果图
相同点 ①都能分离纯化菌种 ②都是在固体培养基上进行 对点练习
1．如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的过程示意图，下列有关叙述错误的是( )
A．在配制步骤②③的培养基时，应先调pH再用高压蒸汽灭菌法灭菌
B．步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散，获得单菌落
C．步骤③采用稀释涂布平板法接种，并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
D．步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力
√
C [配制培养基时，应先调pH后再用高压蒸汽灭菌法灭菌，防止杂菌污染，A正确；步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌通过稀释涂布平板法分散，获得单细胞菌落，B正确；步骤③筛选分解尿素的细菌，培养基中应以尿素为唯一氮源，不需要加入牛肉膏和蛋白胨，C错误；步骤④鉴定细菌分解尿素的能力时，挑取③中不同种的菌落分别接种，比较细菌分解尿素的能力，D正确。]
2．如图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，图丙是接种后培养的效果图。下列有关叙述，错误的是( )
A．图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法
B．这两种方法所用的接种工具分别是接种针和接种环
C．图丙的接种方法是图乙
D．两种方法的接种操作都要在酒精灯火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域
√
B [图甲是平板划线法，图乙是稀释涂布平板法，A正确；这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器，B错误；图丙的接种方法是图乙，C正确；两种方法的接种操作都要在酒精灯火焰附近进行，因为火焰附近存在着无菌区域，D正确。]
1．稀释涂布平板法
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少______。
知识点2 微生物的数量测定
活菌
活菌
(2)计数原则：一般选择菌落数为_________的平板进行计数。样品的稀释度将直接影响平板上的菌落数目，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养。在同一稀释度下，应至少对 ___个平板进行重复计数，然后求出________。
(3)注意事项：统计的菌落数往往比活菌的实际数目____，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是______菌落。因此，统计结果一般用________而不是用活菌数来表示。
30～300
3
平均值
少
一个
菌落数
2．显微镜直接计数法
一种常用的、快速直观的测定微生物数量的方法。该方法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下观察、计数，然后再计算一定体积的样品中微生物的数量，统计的结果一般是________________的总和。
活菌数和死菌数
稀释涂布平板法和显微镜直接计数法对微生物计数产生的实验误差如何？
提示：稀释涂布平板法计数的值比实际值小。显微镜直接计数法计数的结果比实际值大。
(选择性必修3 P18“相关信息”)酵母菌细胞、霉菌孢子等常用______________进行计数。细菌等较小的细胞用____________进行观察和计数。
血细胞计数板
细菌计数板
基于对微生物的数量测定的认识，判断下列表述是否正确。
1．当菌落数目稳定时，选取菌落数为30～300的平板进行计数。
( )
2．统计菌落数目时，统计的菌落数就是活菌的实际数目。 ( )
提示：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。
√
×
3．利用显微镜直接计数法统计的细菌数量就是活菌的数量。 ( )
提示：利用显微镜直接计数法统计的细菌数量无法区分死菌和活菌。
×
某班同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。
1．甲同学在稀释倍数为106的浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？若不可靠，应如何改进？
提示：不可靠。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下至少涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
2．下表数据是乙同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板获得的菌落数目。请计算每克土壤样品中的活菌数。
稀释度 平板1 平板2 平板3
1×104 320 360 356
1×105 212 234 287
1×106 21 23 18
提示：1×105倍稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300，计算平均值为(212＋234＋287)/3≈244，由此可换算出每克土壤样品中的活菌数约为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
3．为什么选择菌落数为30～300的平板进行计数？
提示：若平板上菌落数过多，说明稀释度过低，菌种的密度大，就会出现更多的两个或两个以上的菌种形成的菌落，结果不准确，且计数较困难。若平板上菌落数过少，菌落形成的偶然性大，结果也不准确。
深化归纳
两种微生物计数方法的比较
对点练习
1．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验中样品稀释示意图。据图分析错误的是( )
A．某一稀释度下至少涂布3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目少
B．3号试管中的样品溶液稀释倍数为104倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×108个
D．该实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照，用以判断选择培养基是否有选择作用
√
C [设置重复组，增强实验的说服力与准确性，故某一稀释度下至少涂布3个平板；稀释涂布平板得到的菌落可能存在两个或多个细胞长成一个菌落，使该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要少，A正确。据题图可知，将10 g土样加入90 mL无菌水中定容至100 mL后，此时土样稀释倍数为10倍，再经3次10倍稀释得到3号试管中的样品，故3号试管中样品的稀释倍数是104 倍，B正确。5号试管进行稀释涂布平板法计数的结果表明每克土壤中的菌株数为(168＋175＋167)÷3×106÷0.1＝1.7×109个，C错误。要判断选择培养基是否起到选择作用，需设置接种了的牛肉膏蛋白胨的培养基作对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落种类数目多于选择培养基上的菌落种类数目，则说明起到了选择作用，D正确。]
2．下列有关稀释涂布平板法计数和显微镜直接计数法的叙述，不正确的是( )
A．利用血细胞计数板计数属于显微镜直接计数法，其缺点是不能区分死菌与活菌
B．两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同
C．两种计数方法均能在计数的同时能观察到所研究微生物的形态特征
D．当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数
√
C [显微镜直接计数法无法区分死菌和活菌，A正确；稀释涂布平板法计数时，当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的往往是一个菌落，故而统计值比实际值偏小，显微镜直接计数时不能区分死菌和活菌，故统计值大于实际值，因此两种计数方法，其统计值与实际值相比均有差异，但差异原因不同，B正确；稀释涂布平板法观察到的是菌落的形态特征，而不是微生物的形态特征，显微镜直接计数法观察到的是微生物的形态特征，C错误；当菌落数目稳定时，一般选取菌落数在30～300的且差异不大的平板进行计数，D正确。]
1．提出问题
土壤中含有能分解尿素的细菌，我们如何分离它们？每克土壤样品究竟含有多少这样的细菌？
知识点3 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
2．基础知识
组分 含量 提供的主要营养
KH2PO4 1.4 g ________
Na2HPO4 2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖 10.0 g ______
尿素 1.0 g ______
琼脂 15.0 g ________
H2O 定容至1 000 mL 水
无机盐
碳源
氮源
凝固剂
3．实验设计
(1)土壤取样
①土壤要求：酸碱度接近中性且潮湿。
②取样部位：距地表__________的土壤层。
(2)样品的稀释
测定土壤中细菌的数量，一般选用________________________倍稀释的稀释液进行平板培养，当第一次做这个实验的时候，可以将稀释的范围放____一点。
3～8 cm
1×104、1×105和1×106
宽
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养______和培养时间。细菌一般在________ ℃的温度下培养______ d。
②观察
a．观察方法：每隔____ h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b．记录菌落的特征：包括菌落的______、______和______等。
温度
30～37
1～2
24
形状
大小
颜色
为什么要选取菌落数目稳定时的记录作为结果？
提示：尽量缩小统计的菌落数与实际活菌数的差值，因为繁殖慢的菌种开始看不出来明显的菌落。
4．操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要______。
②实验操作均应在______________进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管较多，为了避免混淆，最好在使用前做好标记。例如，在标记培养皿时应该注明组别、培养日期和平板上培养样品的________等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物学实验，需要事先规划时间，以便提高实验效率，在操作时有条不紊。
灭菌
酒精灯火焰旁
稀释度
判断下列表述是否正确。
1．测定不同微生物数量时，接种的土壤稀释液的稀释度相同。
( )
提示：土壤中各种微生物的数量不同，因此分离不同的微生物要采用不同的稀释度。
×
2．尿素分解菌产生的脲酶能催化尿素分解产生N2，N2可作为细菌生长的氮源。 ( )
提示：脲酶能催化尿素分解产生NH3，NH3再转化为、等被植物吸收。
3．菌落特征是鉴别菌种的重要依据。 ( )
×
√
1．测定土壤中细菌的总量和能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？为什么？
提示：不相同；因为土壤中能分解尿素的细菌的数量比细菌的总量要少。
2．在稀释涂布平板法中，为何需至少涂布3个平板？
提示：作为重复实验，统计时取平均值，以减少偶然因素对实验结果的影响，增强实验结果的说服力。
3．欲判断培养基是否具有选择作用和培养基是否有杂菌污染，应如何分别设置对照组？
提示：判断培养基是否具有选择作用，还需用牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。判断培养基是否有杂菌污染，需将未接种的培养基同时进行培养。
4．利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物都是能分解尿素的微生物吗？并说明理由。
提示：不一定；因为有些微生物可以利用能分解尿素的细菌的代谢物进行生长繁殖。
5．细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，因此可以通过检测培养基pH的变化来判断是否发生了该化学反应，进而判断该菌是否为尿素分解菌。依据以上原理，如何为分离得到的微生物是否是分解尿素的细菌作进一步鉴定？
提示：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若菌落周围出现红色环带，则可说明该菌种能够分解尿素。
深化归纳
1．“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验结果分析
2．土壤中分解尿素的细菌的鉴定原理
分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3，使培养基的碱性增强，pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
对点练习
1．(2022·江苏选择性考试)下列是某同学分离高产脲酶菌的实验设计，不合理的是( )
A．选择农田或公园土壤作为样品分离目的菌株
B．在选择培养基中需添加尿素作为唯一氮源
C．适当稀释样品是为了在平板上形成单菌落
D．可分解酚红指示剂使其褪色的菌株是产脲酶菌
√
D [农田或公园土壤中含有较多的产脲酶的微生物，A合理；为了筛选可分解尿素的细菌，配置的培养基应选择尿素作为唯一氮源，产脲酶的微生物在该培养基上能生长，B合理；当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，C合理；在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成NH3，NH3会使培养基的pH升高，酚红指示剂将变红，因此在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，能对分离的菌种做进一步鉴定，D不合理。]
2．分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物学实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题。
(1)分解尿素的微生物能产生________；配制培养基时应以________作为唯一氮源。
(2)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是__________________________；然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数为________个。
脲酶
尿素
检测平板灭菌是否合格
4.2×106
(3)微生物的培养与观察
①培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养________和培养________。
②观察：每隔24 h统计一次________数目，选取菌落数目________时的记录作为结果。
温度
时间
菌落
稳定
[解析] (1)分解尿素的微生物能产生脲酶；配制培养基时应以尿素作为唯一氮源。(2)在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，其目的是检测平板灭菌是否合格。每毫升样液中分解尿素的微生物活菌数＝某一稀释度下培养基上生长的平均菌落数÷涂布平板时所用的稀释液的体积×稀释倍数＝(39＋42＋45)÷3÷0.1×10 000＝4.2×106个。(3)不同种类的微生物，在培养时往往需要不同的培养温度和培养时间，在培养过程中，每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
1．核心概念
选择培养基：指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
2．结论语句
(1)只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作为唯一氮源的选择培养基分离能分解尿素的细菌。
(2)为确保结果准确，一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。
(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
1．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
课堂检测 素养测评
2
4
3
题号
1
5
√
D [不含有机物的培养基中能筛选出自养型微生物，如硝化细菌；缺氮培养基可以筛选出固氮微生物，如固氮菌；含尿素(不含其他氮源)的培养基能筛选出合成脲酶的微生物，如分解尿素的细菌，D正确。]
2
4
3
题号
1
5
2．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )
A．菌落中的细菌数目是固定的
B．平板上的一个菌落就是一个细菌
C．通过此方法统计的菌落数与活菌的实际数目相同
D．平板上的一个单菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
√
2
4
3
题号
1
5
D [用稀释涂布平板法进行微生物计数时，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，一般来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌，D正确。]
2
4
3
题号
1
5
3．判断选择培养基是否起到选择作用时，需要设置的对照是
( )
A．未接种的选择培养基
B．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
C．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
√
2
4
3
题号
1
5
B [选择培养基的作用是只允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长，若设置对照组判断选择培养基是否起到选择作用，需要用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基，若该培养基上微生物能生长且并非只有特定种类，则可证明选择培养基起到选择作用，B项符合题意。]
2
4
3
题号
1
5
4．用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是
( )
A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是216和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是212、240和250，取平均值234
2
4
3
题号
1
5
√
D [在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，A、B错误。C项虽然涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与其他的相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，此时，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值，C错误。]
2
4
3
题号
1
5
5．尿素是一种重要的氮肥，农作物不能将其直接吸收利用，而是通过土壤中的细菌将其分解为氨和CO2后才能被农作物利用。请回答下列问题。
(1)土壤中的某些细菌能分解尿素是因为该种细菌能合成________。
(2)为筛选尿素分解菌而制备的培养基中含有的营养物质除尿素外，还包括水、碳源、________等，该培养基能筛选出目的菌株的原因是____________________________________________________ ___________。
2
4
3
题号
1
5
脲酶
无机盐
只有以尿素作为唯一氮源的细菌和自生固氮菌才能在该培养基上生长
(3)一般依据尿素分解菌菌落的____________、隆起程度和颜色等特征来统计菌落数目。现将10 mL尿素分解菌悬液进行梯度稀释，分别取0.1 mL稀释倍数为106的样液接种到3个培养基上，培养一段时间后，统计菌落数分别为39、42、45，则1 mL悬液中活细菌数目为________个。上述过程采用的接种方法是______________。
(4)为检验培养基及培养皿灭菌是否合格，可采取的措施是_________________________________________________________________。
2
4
3
题号
1
5
形状、大小
4.2×108
稀释涂布平板法
单独设置一个灭菌后不接种样液的培养皿(含同种培养基)进行培养
[解析] (1)分解尿素的细菌能合成脲酶，将尿素分解。(2)微生物的培养基中需含有水、无机盐、碳源和氮源，用尿素作为氮源，因为只有能合成脲酶的细菌和自生固氮菌才能在该培养基上生长，因此该培养基能筛选出分解尿素的细菌。(3)一个菌落为一个细菌繁殖的后代，不同的微生物的菌落特征不同，菌落的特征包括形状、大小、隆起程度和颜色等，据此来统计菌落的数目。1 mL悬液中活细菌的数目为(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(个)。(4)可单独设置一个灭菌后不接种样液的含同种培养基的培养皿进行培养，观察该培养基上是否出现菌落，从而判断灭菌是否合格。
2
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题号
1
5
课时分层作业(3)
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微生物的选择培养和计数
（WORD版）
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夯实基础知识 · 熟悉命题方式
自我检测提能 · 及时矫正不足
本节课掌握了哪些考点？
本节课还有什么疑问点？
课后训练
学习反思
课时小结
THANKS课时分层作业(3) 微生物的选择培养和计数
题组一 选择培养基
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
2．(2023·广东选择性考试)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是( )
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
3．为了从土壤中分离获得尿素分解菌的单菌落，某同学设计了A、B两种培养基，其成分如下表所示。请回答下列相关问题。
项目 葡萄糖 KH2PO4 Na2HPO4 MgSO4·7H2O 尿素 琼脂 水
培养 基A ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
培养 基B ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
(1)培养基中的葡萄糖能为细菌的生长繁殖提供__________和________。通常情况下，制备培养基时要根据所培养微生物的不同来调节培养基的pH，其原因是_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)据表判断，培养基A________(填“能”或“不能”)用于分离获得尿素分解菌的单菌落，原因是_____________________________________________________
_____________________________________________________________________；
培养基B不能用于分离尿素分解菌，原因是________________________________
_____________________________________________________________________。
题组二 微生物的选择培养
4．下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是( )
A．用全营养马铃薯琼脂培养基筛选酵母菌
B．用高盐的培养基筛选抗盐突变菌
C．含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的细菌
D．利用高温条件筛选水生栖热菌
5．某同学成功分离出了土壤中的固氮菌，结果如图所示。该实验使用了( )
A．平板划线法
B．液体培养基
C．不含氮源的培养基
D．不含碳源的培养基
6．(2023·河北选择性考试)为筛选能平衡肠道菌群和降解胆固醇的乳酸菌，下列相关实验设计错误的是( )
A．从酸奶和泡菜中采样分离乳酸菌
B．平板倒置培养为筛选乳酸菌创造无氧环境
C．对目的菌株进行胆固醇降解能力的测定
D．检测目的菌株对消化道环境的耐受力
7．处理生活垃圾的有效方法之一是用微生物对其进行降解。如图表示筛选高效降解淀粉菌种的过程。相关分析正确的是( )
A．筛选所用培养基中的碳源应为牛肉膏和蛋白胨
B．将菌液接种到培养基的方法是平板划线法
C．菌落①与菌落②透明圈大小不同的原因是其对碘的分解能力不同
D．扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好
题组三 微生物的数量测定
8．下列有关统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用稀释涂布平板法获得的菌落数往往少于实际的活菌数目
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌往往会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用菌落密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布3个平板，若3个平板统计的菌落数在30～300之间且差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
9．下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌与计数的实验，请回答下列问题。
实验原理：农田的表层土壤中自生固氮菌的数量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
材料用具：农田的表层土壤、配制无氮培养基和牛肉膏蛋白胨培养基的材料、盛有9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱等。
(1)方法步骤
①培养基的制备：分别配制无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基，倒平板应在________________________操作。
②制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释到1×107倍。
③涂布平板操作：按照由1×107～1×103倍稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行涂布平板操作，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个。
④培养：放入恒温箱内，在28～30 ℃下培养3～4 d。
⑤计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果在稀释倍数为1×105的平板上测定的平均值为50，则每克样品中的菌体数是________个。
(2)预期结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数________(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________。
10．(2023·山东等级考)平板接种常用在微生物培养中。下列说法正确的是( )
A．不含氮源的平板不能用于微生物培养
B．平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒
C．接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃
D．利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物
11．(2023·辽宁选择性考试)细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度(菌落数/m3)。下列叙述错误的是( )
A．采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B．细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C．同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D．稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
12．生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类，研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒入平板，然后在平板上划分数区，将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域，培养结果如图所示。下列说法错误的是( )
A．倒入平板后直接培养可判断培养基有无污染
B．倒入平板后培养基需要进行灭菌处理
C．图示结果表明该菌需要生长因子乙和丙
D．生长图形法还可用于某些菌种的筛选
13．熔喷布是口罩生产的重要原料，主要成分是聚丙烯，其易降解程度是评价口罩合格性的重要指标之一。某研究小组从土壤中分离出高效降解聚丙烯的细菌，部分流程如图所示。下列说法错误的是( )
A．②中的选择培养基以聚丙烯为唯一碳源
B．步骤③所用的接种工具是接种环
C．在配制步骤②、③的培养基时，应先调pH后高压蒸汽灭菌
D．步骤④得到的聚丙烯分解菌可用显微镜直接计数，活菌数目往往比计数结果低
14．大熊猫是我国特有的珍稀野生动物，每只成年大熊猫每日进食竹子量可达12～38 kg。大熊猫可利用竹子中8%的纤维素和27%的半纤维素。研究人员从大熊猫粪便和土壤中筛选纤维素分解菌。回答下列问题：
(1)为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以________为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于________________培养基。
(2)配制的培养基必须进行________________灭菌处理，目的是_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
检测固体培养基灭菌效果的常用方法是__________________________________ _____________________________________________________________________。
(3)若要测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，应将大熊猫新鲜粪便样液______________后，取________mL涂布到若干个平板，每个稀释度至少涂布________个平板，对菌落数在________的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。
(4)为高效降解农业秸秆废弃物，研究人员利用从土壤中筛选获得的3株纤维素分解菌，在37 ℃条件下进行玉米秸秆降解实验，结果如表所示。在该条件下纤维素酶活力最高的是菌株________，理由是________________________________ __________________________________________________________________。
菌株 秸秆 总重(g) 秸秆 残重(g) 秸秆 失重(%) 纤维素 降解率(%)
A 2.00 1.51 24.50 16.14
B 2.00 1.53 23.50 14.92
C 2.00 1.42 29.00 23.32
课时分层作业(3)
1 2 4 5 6 7 8 10 11 12 13
C D A C B D C D D B B
3．(1)能量(能源) 碳源(合成其他有机物的原料或中间物质) 不同微生物生长繁殖所需要的(适宜)pH不同 (2)不能 该培养基缺少氮源，尿素分解菌不能获得氮源而无法生长繁殖 培养基没有凝固剂(琼脂)，是液体培养基，不能将目的菌分散成单个细菌，无法获得单菌落
9．(1)①酒精灯火焰附近 ③3 1 ⑤30～300 5×107 (2)多于 无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌能生长繁殖，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有微生物生长
14．(1)纤维素 选择 (2)高压蒸汽 为了杀死培养基中的所有微生物 将未接种的培养基进行培养 (3)稀释适当倍数 0.1 三 30～300 (4)C 接种C菌株后秸秆失重最多，纤维素降解率最大
1．C [尿素和硝酸盐都能作为氮源，而培养尿素分解菌的培养基应是以尿素为唯一氮源的固体培养基。因此培养基中应不加硝酸盐，加入尿素和琼脂，葡萄糖作为碳源，也需要加入，C正确。]
2．D [研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以在c点取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，故D正确，A、B、C错误。]
3．(1)培养基中的葡萄糖能作为能源物质，即作为细菌细胞呼吸的底物，为细菌的生长繁殖提供能量；葡萄糖氧化分解的中间产物能为合成其他有机物提供原料。不同微生物生长繁殖所需的最适pH不同，如培养霉菌时一般需要将培养基调至酸性，培养细菌时一般需要将培养基调至中性或弱碱性。(2)培养基A没有添加尿素或其他氮源物质，尿素分解菌不能获得氮源而无法生长繁殖。培养基B没有添加凝固剂——琼脂，属于液体培养基。液体培养基不能将培养的目的菌分散成单个细菌，无法获得单菌落。
4．A [全营养马铃薯琼脂培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对酵母菌无选择作用，筛选酵母菌应在选择培养基中培养，A错误；抗盐突变菌具有耐高盐的能力，因此可以利用高盐的培养基进行选择培养，B正确；分解尿素的细菌能将尿素分解产生氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的细菌，C正确；利用高温条件可以筛选水生栖热菌，D正确。]
5．C [题图所示结果呈现的是单个菌落，故题述实验采用了稀释涂布平板法，A错误；在固体培养基上才能形成菌落，B错误；要分离土壤中的固氮菌，应该用不含氮源的选择培养基，C正确；固氮菌为异养型生物，因此所用培养基需要加入碳源，D错误。]
6．B [平板倒置培养的目的是防止培养基中的水分蒸发，不能创造无氧环境。]
7．D [筛选所用培养基应以淀粉作为唯一的碳源，这样才能将降解淀粉的菌种筛选出来，A错误；由培养基上的单个菌落可知，将菌液接种到培养基的方法是稀释涂布平板法，B错误；由于培养基中的唯一碳源是淀粉，而淀粉遇碘液会变蓝，故菌落①与②周围透明圈的大小不同的原因可能是两个菌群对淀粉的分解能力不同，C错误；液体培养基可增大溶氧量，也能增加菌种与营养物质的接触面积，故扩大培养时用不加琼脂的液体培养基效果更好，D正确。]
8．C [稀释涂布平板法常用来统计样品中活菌的数目，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，值得注意的是，该方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，A、B正确。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，密度较大会不好计数；设计实验时，在同一稀释度下，应至少对3个平板做重复实验，才能增强实验的说服力和准确性；分析结果时，一定要考虑所设置的重复实验的结果是否一致，若3个平板统计的菌落数在30～300之间且差别不大，取平均值作为统计结果，C错误，D正确。]
9．(1)在酒精灯火焰旁倒平板，可以减少杂菌的污染。为了保证结果准确，一般每个稀释度下设置3个或3个以上平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值，则每克样品中的菌体数为50÷0.1×105＝5×107(个)。(2)可用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组来说明无氮培养基的选择作用，牛肉膏蛋白胨培养基适合其他细菌生存，所以它比无氮培养基上的菌落数目多。
10．D [不含氮源的平板可用于固氮菌的培养，A错误；平板涂布时涂布器使用前必须浸在酒精中，然后在火焰上灼烧灭菌，这种操作属于灭菌，不属于消毒，B错误；使用后的培养基即使未长出菌落也要在丢弃前进行灭菌处理，不能直接丢弃，以免污染环境，C错误；脲酶可以催化尿素分解，在以尿素为唯一氮源的平板上，能合成脲酶的微生物可以分解尿素获得氮源而进行生长繁殖，但是不能合成脲酶的微生物因缺乏氮源而无法生长，因此以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物，D正确。]
11．D [为防止杂菌感染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌，对实验操作者的双手进行消毒，A正确；纯化培养时，为防止污染培养基和水分蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确；微生物计数时在同一稀释度下，应至少需要对3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏小，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。]
12．B [平板上不含任何生长因子，若倒入平板后直接培养，出现菌落说明培养基已被杂菌感染，因为该嗜热菌不能在缺乏生长因子的培养基中生长，A正确；制备培养基时，先灭菌再倒平板，B错误；题图中菌落生活在乙、丙区域之间，表明该菌需要生长因子乙和丙，C正确；不同菌种所需生长因子不同，可利用生长图形法筛选菌种，D正确。]
13．B [根据题意，熔喷布是口罩生产的重要原料，主要成分是聚丙烯，本实验目的是筛选出可以高效降解一次性口罩的细菌，②中的选择培养基要以聚丙烯为唯一碳源，A正确；据题图分析可知，步骤③的接种方法为稀释涂布平板法，接种工具为涂布器，B错误；在配制步骤②、③的培养基时，为避免杂菌污染，应先调pH后再进行高压蒸汽灭菌，C正确；筛选出的纤维素降解菌可用显微镜直接计数，由于该方法不能区分死菌与活菌，因此活菌数目往往比统计结果低，D正确。]
14．(1)为筛选纤维素分解菌，将大熊猫新鲜粪便样品稀释液接种至以纤维素为唯一碳源的固体培养基上进行培养，该培养基从功能上分类属于选择培养基。(2)配制培养基常用高压蒸汽灭菌，目的是杀死培养基中的所有微生物。为检测灭菌效果可将未接种的培养基在适宜条件下培养一段时间，若在适宜条件下培养无菌落出现，说明培养基灭菌彻底，否则说明培养基灭菌不彻底。(3)为测定大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数，常采用稀释涂布平板法，将大熊猫新鲜粪便样液稀释适当倍数后，取0.1 mL涂布到若干个平板，每个稀释度至少涂布三个平板，对菌落数在30～300的平板进行计数，则可根据公式推测大熊猫新鲜粪便中纤维素分解菌活菌数。(4)测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。由表格可知，在适宜的条件下，C菌株在相同的温度和时间下，秸秆失重最多，纤维素降解率最大，说明该菌株的纤维素分解菌产生的纤维素酶活力最大。
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