第1节 重组DNA技术的基本工具
1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
知识点1 基因工程的概念和工具酶
1．基因工程的概念
(1)操作场所：__________。
(2)操作技术：________等技术。
(3)操作结果：赋予生物新的__________，从而创造出更符合人们需要的新的__________和生物产品。
(4)操作水平：_________水平。
2．基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
①来源：主要来自__________。
②功能：能够识别双链DNA分子的特定____________，并且使每一条链中特定部位的____________断开。
③结果：产生__________或________。
④应用：已知EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列和酶切位点分别为和，如图为两种限制酶切割DNA后产生的末端，写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的__________不同，切割位点______(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有________。
(选择性必修3 P71“图3-3”)限制酶______(填“能”或“不能”)切开RNA分子的磷酸二酯键。限制酶切一次可断开___个磷酸二酯键，产生___个游离的磷酸基团，消耗___分子水。
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？原核生物中的限制酶会切割自己的DNA分子吗？为什么？
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(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的____________。
②E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的比较
种类 比较 E.coli DNA 连接酶 T4 DNA连接酶
来源 __________ __________
特点 连接具有平末端的DNA片段的效率__________T4 DNA连接酶 连接具有平末端的DNA片段的效率__________E.coli DNA连接酶
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用有什么不同？
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基于对基因工程的概念和工具酶的认识，判断下列表述是否正确。
1．基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种。 ( )
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。 ( )
3．限制酶和解旋酶的作用部位相同。 ( )
4．E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远高于T4 DNA连接酶。 ( )
1．基于基因工程的概念和理论基础思考回答。
(1)基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
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(2)为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
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(3)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
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2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
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(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
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(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
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3．DNA连接酶的识别有无特异性？能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端？
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1．与DNA分子相关的四种酶的比较
比较 项目 限制酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶
作用 底物 DNA分子 DNA分子 脱氧核 苷酸 DNA 分子
作用 部位 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 氢键
作用 特点 识别特定核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开，切割目的基因及质粒载体 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA 两条链 之间的 氢键打开
作用 结果 形成黏性末端或平末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链DNA分子
应用 基因工程 DNA复制
2．同尾酶
(1)概念：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
(2)应用：同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
1．下图所示的三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是( )
A．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
B．这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C．BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
D．图中的DNA片段被EcoR Ⅰ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段
限制酶和DNA连接酶
(1)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
(2)限制酶和DNA连接酶作用部位相同，但作用正好相反，都作用于特定部位的磷酸二酯键，前者是“切割”，后者是“缝合”。
(3)DNA连接酶种类少：DNA连接酶无识别的特异性，所以，限制酶种类多，DNA连接酶种类少。
知识点2 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1．种类：质粒、________、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有__________能力的环状双链DNA分子。
(2)质粒适于作基因运载体的特点
①质粒DNA分子上有一个至多个____________位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。
②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中______________，或_________________，随_________同步复制。
③人工改造的质粒常有特殊的__________，便于___________________。
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入__________。
②质粒携带_____________在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
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基于对基因进入受体细胞的载体的认识，判断下列表述是否正确。
1．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 ( )
2．作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 ( )
3．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。 ( )
1．探究用于“分子运输车”的质粒应具有的条件。
(1)载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
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(2)要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
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(3)我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
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2．质粒作为基因工程中的“分子运输车”，通常含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。请举例说明标记基因的筛选原理是什么？
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3．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
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4．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
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1．质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段(基因)插入其中
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用 避免受体细胞受到损伤
2．标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体或空质粒的受体细胞。如图所示：
1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切割位点，以便目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便重组DNA分子的鉴定和选择
2．某一质粒载体如图甲所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化后，得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述不正确的是( )
A．图甲所示的质粒中还应含有复制原点以便在受体细胞中复制
B．将经处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法
C．配制培养基乙时应加入氨苄青霉素
D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
知识点3 DNA的粗提取与鉴定
1．实验原理
(1)_____不溶于酒精，但某些________溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于___________的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。
2．实验步骤
(1)研磨：称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL________，充分研磨。
(2)去杂：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取________，也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取________放入烧杯中。
(3)提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的_____。
方法一：用玻璃棒沿______(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
方法二：在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的________(粗提取的DNA)晾干。
(4)鉴定
项目 A B
2 mol/L的NaCl溶液5 mL
丝状物或沉淀物 不加 加入
________试剂4 mL
________加热5 min
现象 无色 ______
基于对DNA的粗提取与鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。 ( )
2．研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。 ( )
3．DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。 ( )
1．新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等都可作为实验材料提取DNA，能否利用廉价易得的猪血作为实验材料？
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2．上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？为什么要求玻璃棒沿着一个方向搅拌？
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1．DNA的粗提取与鉴定实验关键步骤分析
方法步骤 加入物质 目的
研磨洋葱 研磨液 释放DNA
粗提取 DNA 预冷的酒精溶液 (体积分数为95%) 有利于DNA析出
鉴定 DNA 2 mol/L的NaCl溶液 溶解DNA
二苯胺试剂 DNA遇二苯胺 (沸水浴)变蓝色
2．实验中进行了两次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开，第1次操作后，DNA存在于上清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管沉淀中。
1．下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述，不正确的是( )
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶 解DNA
B 2 mol/L NaCl溶液 与提取出的 DNA混合 溶解 DNA
C 预冷的 酒精溶液 加入离心后 的上清液中 溶解 DNA
D 二苯胺 试剂 加入溶解有DNA 的NaCl溶液中 鉴定 DNA
2．(2023·广东选择性考试)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
结论语句
(1)基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
(2)重组DNA技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
(3)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
(4)E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
(5)质粒作为基因工程的载体需具备的条件：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
(6)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1．下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是( )
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
B．一种DNA连接酶只能连接一种黏性末端
C．将单个脱氧核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
D．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和一个至多个限制酶切割位点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
4．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
5．下表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题。
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
(1)从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶________切割。
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙____________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：__________________________________________。
第1节 重组DNA技术的基本工具
知识点1
自主梳理
1．(1)生物体外 (2)转基因 (3)遗传特性 生物类型 (4)DNA分子 2．(1)原核生物 核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 平末端 黏性末端 平末端 碱基序列 不同 专一性 (2)磷酸二酯键 大肠杆菌 T4噬菌体 远远低于 远远高于
教材隐性知识
不能 2 2 2
微思考
1．提示：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
不会切割自己的DNA分子。因为它自身的DNA分子可能不具备这种酶的识别序列或者自身DNA分子相关序列被甲基化修饰，不被识别。
2．提示：DNA连接酶连接的是DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
基础诊断
1．√
2．× 提示：DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3．× 提示：限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
4．× 提示：E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。
合作探究
1．(1)提示：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
(2)提示：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)提示：①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。
2．(1)提示：
(2)提示：同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会产生相同的黏性末端。
(3)提示：限制酶XbaⅠ；因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
3．提示：DNA连接酶的识别无特异性。对于互补的黏性末端以及平末端(T4 DNA连接酶可连接)都能连接，不同限制酶切割形成的黏性末端只要互补，DNA连接酶就可催化二者连接。
对点练习
1．C [限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键，其中限制酶能将磷酸二酯键切开，而DNA连接酶能将磷酸二酯键连接起来，A正确；由图示三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，B正确；用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA会形成相同的黏性末端，故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能够彼此连接，C错误；图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D正确。]
2．A [DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。]
知识点2
自主梳理
1．噬菌体 2.(1)自我复制 (2)限制酶切割 进行自我复制 整合到受体DNA上 受体DNA 标记基因 重组DNA分子的筛选 (3)受体细胞 外源DNA片段
微思考
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如动植物病毒、噬菌体等。(2)功能不同：细胞膜上的载体是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
基础诊断
1．√
2．× 提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因。
3．× 提示：重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶，载体不是工具酶。
合作探究
1．(1)提示：具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
(2)提示：能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
(3)提示：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
2．提示：质粒上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，而受体细胞中不含该种抗生素的抗性基因，因此受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。例如将含有四环素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对四环素产生抗性。在含有四环素的培养基上，只有导入了基因表达载体或空质粒的受体细胞才能生存。
3．提示：合理；因为仅导入载体的和导入含目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。
4．提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
对点练习
1．A [作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便重组DNA分子的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无伤害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]
2．D [质粒能够在受体细胞中复制应含有复制原点，A正确。据图分析可知，培养基乙上菌落分布分散，是用稀释涂布平板法接种的，B正确。配制培养基乙时应加入氨苄青霉素，以筛选出含有质粒载体的大肠杆菌，C正确。培养基乙中生长的菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌；培养基丙中生长的菌落为导入质粒载体的大肠杆菌，故不能在培养基丙中生长，但能在培养基乙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。]
知识点3
自主梳理
1．(1)DNA 蛋白质 (2)2 mol/L (3)二苯胺 2.(1)研磨液 (2)上清液 上清液 (3)DNA 一个 沉淀物 (4)二苯胺 沸水中 蓝色
基础诊断
1．√
2．× 提示：研磨之后，通过过滤或离心，DNA保留在上清液中。
3．× 提示：在沸水浴加热的条件下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。
合作探究
1．提示：不能。因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，不能提取出DNA。
2．提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，有利于丝状DNA完整地缠在玻璃棒上。
对点练习
1．C [DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质，C错误。]
2．D [将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，还需要沸水浴处理才能呈现蓝色，D错误。]
课堂检测素养测评
1．B [一种限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]
2．A [DNA连接酶连接的是两条DNA链上的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，A正确，D错误；DNA连接酶可以连接互补的黏性末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖，所以一种DNA连接酶可以连接多种黏性末端，B错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键，C错误。]
3．A [质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒，A错误；质粒作为载体时，应具有标记基因和一个至多个限制酶切割位点，B正确；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中，C正确；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制，D正确。]
4．B [低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，可能有些蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。]
5．解析：(1)由表中4种限制酶的切割位点可知，SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割。(4)由图1、图2可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
答案：(1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ (4)能 二者具有相同的黏性末端
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第1节 重组DNA技术的基本工具
第3章 基因工程
1．概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2．阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
课标要求
对应学生用书第68页
1．基因工程的概念
(1)操作场所：__________。
(2)操作技术：________等技术。
(3)操作结果：赋予生物新的__________，从而创造出更符合人们需要的新的__________和生物产品。
(4)操作水平：_________水平。
知识点1 基因工程的概念和工具酶
生物体外
转基因
遗传特性
生物类型
DNA分子
2．基因工程的工具酶
(1)限制性内切核酸酶(简称限制酶)——“分子手术刀”
①来源：主要来自__________。
②功能：能够识别双链DNA分子的特定____________，并且使每一条链中特定部位的____________断开。
③结果：产生__________或________。
原核生物
核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
平末端
④应用：已知EcoR Ⅰ和Sma Ⅰ限制酶识别的碱基序列和酶切位点分别为 和 ，如图为两种限制酶切割DNA后产生的末端，写出末端的种类。
EcoR Ⅰ限制酶和Sma Ⅰ限制酶识别的__________不同，切割位点______(填“相同”或“不同”)，说明限制酶具有________。
碱基序列
不同
专一性
(选择性必修3 P71“图3-3”)限制酶______(填“能”或“不能”)切开RNA分子的磷酸二酯键。限制酶切一次可断开___个磷酸二酯键，产生___个游离的磷酸基团，消耗___分子水。
不能
2
2
2
1．推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么？原核生物中的限制酶会切割自己的DNA分子吗？为什么？
提示：限制酶是原核生物的一种防御工具，用来切割侵入细胞的外源DNA，以保证自身安全。
不会切割自己的DNA分子。因为它自身的DNA分子可能不具备这种酶的识别序列或者自身DNA分子相关序列被甲基化修饰，不被识别。
(2)DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的____________。
②E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的比较
种类 比较 E.coli DNA 连接酶 T4 DNA连接酶
来源 __________ __________
特点 连接具有平末端的DNA片段的效率__________T4 DNA连接酶 连接具有平末端的DNA片段的效率__________E.coli DNA连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
T4噬菌体
远远低于
远远高于
2．DNA连接酶和DNA聚合酶的作用有什么不同？
提示：DNA连接酶连接的是DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
基于对基因工程的概念和工具酶的认识，判断下列表述是否正确。
1．基因工程可以实现遗传物质在不同物种间的转移，人们可以定向选育新品种。 ( )
2．DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。 ( )
提示：DNA连接酶能将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
√
×
3．限制酶和解旋酶的作用部位相同。 ( )
提示：限制酶和解旋酶的作用部位不同，限制酶作用于磷酸二酯键，解旋酶作用于氢键。
4．E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远高于T4 DNA连接酶。 ( )
提示：E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。
×
×
1．基于基因工程的概念和理论基础思考回答。
(1)基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什么？
提示：有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行重组；基因工程可以实现遗传物质在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改变生物的性状。
(2)为什么不同生物的DNA分子能拼接起来？
提示：①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。②双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)为什么一种生物的基因可以在另一种生物细胞内表达？
提示：①基因是控制生物性状的独立遗传单位。②遗传信息的传递都遵循中心法则。③生物界共用一套遗传密码。
2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如图。
(1)请写出限制酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、XbaⅠ和XhoⅠ切割形成的黏性末端。
提示：
(2)同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
提示：同种限制酶切割产生的黏性末端相同；不同的限制酶切割可能会产生相同的黏性末端。
(3)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？连接完成后，该重组DNA分子的新连接处能否再被所用的限制酶识别？为什么？
提示：限制酶XbaⅠ；因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。不能再被所用的限制酶识别；因为所用的两种限制酶均不能识别该重组DNA分子的新连接处的脱氧核苷酸序列。
3．DNA连接酶的识别有无特异性？能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端？
提示：DNA连接酶的识别无特异性。对于互补的黏性末端以及平末端(T4 DNA连接酶可连接)都能连接，不同限制酶切割形成的黏性末端只要互补，DNA连接酶就可催化二者连接。
深化归纳
1．与DNA分子相关的四种酶的比较
比较 项目 限制酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶
作用 底物 DNA分子 DNA分子 脱氧核 苷酸 DNA
分子
作用 部位 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 磷酸二 酯键 氢键
比较 项目 限制酶 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 解旋酶
作用 特点 识别特定核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开，切割目的基因及质粒载体 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复磷酸二酯键 将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上 将DNA
两条链
之间的
氢键打开
作用 结果 形成黏性末端或平末端 形成重组 DNA分子 形成新的 DNA分子 形成单链DNA分子
应用 基因工程 DNA复制 2．同尾酶
(1)概念：识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。
(2)应用：同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
对点练习
1．下图所示的三个DNA片段依次表示EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制酶的识别序列与切割位点。下列有关叙述错误的是( )
A．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
B．这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端
C．BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ切割DNA片段形成的末端不能彼此连接
D．图中的DNA片段被EcoR Ⅰ切割后，会增加两个游离的磷酸基团
√
C [限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键，其中限制酶能将磷酸二酯键切开，而DNA连接酶能将磷酸二酯键连接起来，A正确；由图示三种限制酶的切割位点可知，这三种限制酶切割后形成的都是黏性末端，B正确；用BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA会形成相同的黏性末端，故BamHⅠ和Sau3AⅠ切割DNA片段形成的末端能够彼此连接，C错误；图中的DNA片段被EcoRⅠ切割后，会断裂两个磷酸二酯键，从而增加两个游离的磷酸基团，D正确。]
2．DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是( )
A．DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B．DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C．DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D．E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段
A [DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。]
√
规律总结 限制酶和DNA连接酶
(1)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
(2)限制酶和DNA连接酶作用部位相同，但作用正好相反，都作用于特定部位的磷酸二酯键，前者是“切割”，后者是“缝合”。
(3)DNA连接酶种类少：DNA连接酶无识别的特异性，所以，限制酶种类多，DNA连接酶种类少。
1．种类：质粒、________、动植物病毒等。
2．常用载体——质粒
(1)本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有__________能力的环状双链DNA分子。
知识点2 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
噬菌体
自我复制
(2)质粒适于作基因运载体的特点
①质粒DNA分子上有一个至多个____________位点，供外源DNA片段(基因)插入其中。
②携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，能在细胞中______________，或_________________，随_________同步复制。
③人工改造的质粒常有特殊的__________，便于_______________ ____。
限制酶切割
进行自我复制
整合到受体DNA上
受体DNA
标记基因
重组DNA分子的
筛选
(3)作用
①作为运输工具，将外源基因导入__________。
②质粒携带_____________在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
受体细胞
外源DNA片段
细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？
提示：(1)化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如动植物病毒、噬菌体等。(2)功能不同：细胞膜上的载体是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
基于对基因进入受体细胞的载体的认识，判断下列表述是否正确。
1．载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等，其中动植物病毒必须是DNA病毒。 ( )
2．作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。 ( )
提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因。
√
×
3．重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体。
( )
提示：重组DNA技术所需要的工具酶有限制酶和DNA连接酶，载体不是工具酶。
×
1．探究用于“分子运输车”的质粒应具有的条件。
(1)载体要与外源DNA片段连接，需要具备什么条件？
提示：具有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入其中。
(2)要使携带的外源DNA片段在受体细胞中稳定存在，载体需要具备什么条件？
提示：能在受体细胞中自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制，这样它携带的外源DNA片段才能在受体细胞中复制，不至于丢失。
(3)我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件？
提示：具有标记基因，便于重组DNA分子的筛选。
2．质粒作为基因工程中的“分子运输车”，通常含有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。请举例说明标记基因的筛选原理是什么？
提示：质粒上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，而受体细胞中不含该种抗生素的抗性基因，因此受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。例如将含有四环素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对四环素产生抗性。在含有四环素的培养基上，只有导入了基因表达载体或空质粒的受体细胞才能生存。
3．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
提示：合理；因为仅导入载体的和导入含目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。
4．若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
深化归纳
1．质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个限制酶切割位点 供外源DNA片段(基因)插入其中
具有特殊的标记基因 便于重组DNA分子的筛选
无毒害作用 避免受体细胞受到损伤
2．标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了基因表达载体或空质粒的受体细胞。如图所示：
对点练习
1．作为基因的运输工具——载体，必须具备的条件之一及理由是
( )
A．能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因
B．具有多个限制酶切割位点，以便目的基因的表达
C．具有某些标记基因，以使目的基因能够与其结合
D．对宿主细胞无伤害，以便重组DNA分子的鉴定和选择
√
A [作为载体必须能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便提供大量的目的基因，A正确；作为载体必须具有一个或多个限制酶切割位点，以便目的基因的插入，而不是表达，B错误；作为载体必须具有标记基因，以便重组DNA分子的筛选，C错误；作为载体必须是安全的，对受体细胞无伤害，以便宿主细胞能进行正常的生命活动，D错误。]
2．某一质粒载体如图甲所示，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化后，得到多种大肠杆菌，并利用培养基乙和丙筛选出导入重组质粒的大肠杆菌。下列叙述不正确的是( )
A．图甲所示的质粒中还应含有复制原点以便在受体细胞中复制
B．将经处理后的大肠杆菌菌液接种至培养基乙使用的是稀释涂布平板法
C．配制培养基乙时应加入氨苄青霉素
D．培养基丙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌
√
D [质粒能够在受体细胞中复制应含有复制原点，A正确。据图分析可知，培养基乙上菌落分布分散，是用稀释涂布平板法接种的，B正确。配制培养基乙时应加入氨苄青霉素，以筛选出含有质粒载体的大肠杆菌，C正确。培养基乙中生长的菌落为转化质粒载体或者含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌；培养基丙中生长的菌落为导入质粒载体的大肠杆菌，故不能在培养基丙中生长，但能在培养基乙中生长的菌落即为导入重组质粒的大肠杆菌，D错误。]
1．实验原理
(1)_____不溶于酒精，但某些________溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于___________的NaCl溶液。
(3)在一定温度下，DNA遇________试剂会呈现蓝色。
知识点3 DNA的粗提取与鉴定
DNA
蛋白质
2 mol/L
二苯胺
2．实验步骤
(1)研磨：称取约30 g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10 mL________，充分研磨。
(2)去杂：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4 ℃冰箱中放置几分钟后，再取________，也可以直接将洋葱研磨液倒入塑料离心管中，在1 500 r/min的转速下离心5 min，再取________放入烧杯中。
研磨液
上清液
上清液
(3)提取：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2～3 min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的_____。
方法一：用玻璃棒沿______(填“一个”或“两个”)方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分。
方法二：在10 000 r/min的转速下离心5 min，弃上清液，将管底的________(粗提取的DNA)晾干。
DNA
一个
沉淀物
(4)鉴定
项目 A B
2 mol/L的NaCl溶液5 mL 丝状物或沉淀物 不加 加入
________试剂4 mL ________加热5 min 现象 无色 ______
二苯胺
沸水中
蓝色
基于对DNA的粗提取与鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。 ( )
2．研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。 ( )
提示：研磨之后，通过过滤或离心，DNA保留在上清液中。
3．DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。 ( )
提示：在沸水浴加热的条件下，DNA与二苯胺试剂会呈现蓝色。
√
×
×
1．新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等都可作为实验材料提取DNA，能否利用廉价易得的猪血作为实验材料？
提示：不能。因为哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，不能提取出DNA。
2．上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？为什么要求玻璃棒沿着一个方向搅拌？
提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，有利于丝状DNA完整地缠在玻璃棒上。
深化归纳
1．DNA的粗提取与鉴定实验关键步骤分析
方法步骤 加入物质 目的
研磨洋葱 研磨液 释放DNA
粗提取 DNA 预冷的酒精溶液 (体积分数为95%) 有利于DNA析出
鉴定 DNA 2 mol/L的NaCl溶液 溶解DNA
二苯胺试剂 DNA遇二苯胺
(沸水浴)变蓝色
2．实验中进行了两次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开，第1次操作后，DNA存在于上清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管沉淀中。
对点练习
1．下表关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的表述，不正确的是
( )
选项 试剂 操作 作用
A 研磨液 与生物材料混合 提取溶
解DNA
B 2 mol/L NaCl溶液 与提取出的 DNA混合 溶解
DNA
C [DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质，C错误。]
√
选项 试剂 操作 作用
C 预冷的 酒精溶液 加入离心后 的上清液中 溶解
DNA
D 二苯胺 试剂 加入溶解有DNA 的NaCl溶液中 鉴定
DNA
2．(2023·广东选择性考试)“DNA的粗提取与鉴定”实验的基本过程是裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是( )
A．裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B．分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C．沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D．鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
√
D [将DNA溶于NaCl溶液中，加入二苯胺试剂，混合均匀后，还需要沸水浴处理才能呈现蓝色，D错误。]
结论语句
(1)基因工程的基本原理是基因重组，外源DNA能在受体细胞表达的理论基础是密码子的通用性。
(2)重组DNA技术的基本工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和使目的基因进入受体细胞的载体。
(3)限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割。
(4)E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
(5)质粒作为基因工程的载体需具备的条件：能在宿主细胞内稳定保存并自我复制；具有一个或多个限制酶切割位点；具有标记基因。
(6)在基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体、动植物病毒等。
1．下列有关基因工程中限制酶的描述，正确的是( )
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．限制酶只能识别和切割DNA，不能识别RNA
C．限制酶与DNA连接酶的作用部位不相同
D．限制酶只能从原核生物中提取
课堂检测 素养测评
2
4
3
题号
1
5
√
B [一种限制酶能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并在特定位点上切割DNA分子，既可以切割目的基因又可以切割质粒，体现了酶的专一性，A错误；限制酶与DNA连接酶的作用部位相同，都是磷酸二酯键，C错误；限制酶主要从原核生物中提取，D错误。]
2
4
3
题号
1
5
2．下列关于DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．DNA连接酶不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
B．一种DNA连接酶只能连接一种黏性末端
C．将单个脱氧核苷酸加到某DNA片段末端，形成磷酸二酯键
D．连接两条DNA链上碱基之间的氢键
√
2
4
3
题号
1
5
A [DNA连接酶连接的是两条DNA链上的磷酸和脱氧核糖，形成磷酸二酯键，不需要识别特定的脱氧核苷酸序列，A正确，D错误；DNA连接酶可以连接互补的黏性末端两条链主链上的磷酸和脱氧核糖，所以一种DNA连接酶可以连接多种黏性末端，B错误；DNA连接酶连接的是两个DNA片段，DNA聚合酶是将单个脱氧核苷酸加到某个DNA片段末端，形成磷酸二酯键，C错误。]
2
4
3
题号
1
5
3．质粒是基因工程最常用的载体，下列有关质粒的说法错误的是( )
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为载体时，应具有标记基因和一个至多个限制酶切割位点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核(区)外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
√
2
4
3
题号
1
5
A [质粒为小型环状DNA分子，不仅存在于细菌中，也存在于某些真核生物中，但病毒中没有质粒，A错误；质粒作为载体时，应具有标记基因和一个至多个限制酶切割位点，B正确；质粒为小型环状DNA分子，存在于细胞核或拟核外的细胞质基质中，C正确；质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制，D正确。]
2
4
3
题号
1
5
4．(2022·山东等级考)关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是( )
A．过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质
2
4
3
题号
1
5
√
B [低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，可能有些蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与DNA一起析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。]
2
4
3
题号
1
5
5．下表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题。
2
4
3
题号
1
5
限制酶 BamHⅠ HindⅢ EcoRⅠ SmaⅠ
识别序 列及切 割位点
(1)从表中4种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
SmaⅠ
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是_________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶________切割。
2
4
3
题号
1
5
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙_______(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：_______________________。
DNA连接
氢键
EcoRⅠ
能
二者具有相同的黏性末端
[解析] (1)由表中4种限制酶的切割位点可知，SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割。(4)由图1、图2可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
2
4
3
题号
1
5
课时分层作业(12)
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重组DNA技术的基本工具
（WORD版）
巩固课堂所学 · 激发学习思维
夯实基础知识 · 熟悉命题方式
自我检测提能 · 及时矫正不足
本节课掌握了哪些考点？
本节课还有什么疑问点？
课后训练
学习反思
课时小结
THANKS课时分层作业(12) 重组DNA技术的基本工具
题组一 基因工程的概念及其诞生和发展
1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
2．下列有关基因工程诞生的说法，错误的是( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
题组二 基因工程的工具酶
3．以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是( )
A．以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B．②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的
C．①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D．限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
4．下列有关DNA连接酶的叙述，正确的是( )
A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来
B．E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率高于T4 DNA连接酶
C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键，使双链延伸
5．根据图表的内容回答下列问题。
几种限制酶的识别序列及其切割位点
限制酶 SmaⅠ EcoRⅠ PstⅠ
切割位点
(1)假设所用的限制酶均能将所识别的位点完全切开，采用EcoRⅠ和PstⅠ酶切含有目的基因的DNA，能得到________种DNA片段。如果将质粒载体和含目的基因的DNA片段只用EcoRⅠ酶切，酶切产物再加入DNA连接酶，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有____________________、________________________、________________________。
(2)为了防止目的基因和质粒载体酶切后的末端任意连接，酶切时应该选用的酶是____________、____________。
题组三 基因工程的载体
6．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA分子的筛选
7．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是和。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为限制酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
A B C D
题组四 DNA的粗提取与鉴定
8．下列关于DNA粗提取与鉴定的叙述，正确的是( )
A．取材时可选用鸡血、洋葱、香蕉等富含DNA的材料进行实验
B．将白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，离心后弃去上清液
C．可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
D．鉴定DNA时，将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，混匀后即呈蓝色
9．如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析回答下列问题：
(1)上述图示中，该实验的正确操作顺序是______________________________(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目的是______________________________。
(3)步骤①的目的是___________________________________________________，
其依据的原理是_______________________________________________________。
(4)步骤①中所得到的丝状物为________色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴加________试剂，________________后，如果出现________，则证明该丝状物的主要成分为DNA。
(5)由于鸡血较难找到，某学生试图用猪血代替，结果没有成功，其原因最可能是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
10．某细菌质粒如图所示，通过标记基因可以推知外源基因插入的位置，图示中的a、b、c是外源基因插入位置，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况 细菌在含四环素的培养基上的生长状况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
11．在基因工程中，筛选含有目的基因的受体细胞过程特别重要。图中pUC18是一种常用质粒，其中ori为复制原点，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，lacZ基因能合成某种酶，该酶能将无色染料X-gal变成蓝色。已知目的基因插入的位置如图所示，为快速筛选出获得目的基因的大肠杆菌，平板培养基内除了大肠杆菌生长所必需的营养物质和琼脂，还必须加入( )
A．氨苄青霉素
B．无色染料X-gal
C．氨苄青霉素和无色染料X-gal
D．氨苄青霉素或无色染料X-gal
12．如表为常用的限制酶及其识别序列和切割位点，据表分析以下说法不正确的是( )
限制酶 BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Hind Ⅱ
识别序列和切割位点 G↓GATCC G↓AATTC GTY↓RAC
限制酶 Kpn Ⅰ Sau3A Ⅰ Sma Ⅰ
识别序列和切割位点 GGTAC↓C ↓GATC CCC↓GGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一种限制酶只能识别一种脱氧核苷酸序列
B．限制酶的切割位点不一定位于识别序列的内部
C．不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端
D．限制酶切割后形成的不一定都是黏性末端
13．下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B．DNA不溶于95%的冷酒精，但溶于2 mol/L的NaCl溶液
C．新鲜的洋葱和猪肝可作为实验材料提取DNA，而菠菜不能用于提取DNA
D．鉴定DNA时，应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
14．目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如图一所示。
(1)构建人工质粒时要有抗性基因，以便____________________________。
(2)pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
(3)pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶的作用恢复________键，成功地获得了重组质粒，这说明______________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)为了检测上述重组质粒是否导入原本无Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是________________________，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是______________。
课时分层作业(12)
1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13
D D D C D A A A C A B
5．(1)4 质粒载体—质粒载体连接物 目的基因—目的基因连接物 质粒载体—目的基因连接物 (2)EcoRⅠ SmaⅠ
9．(1)③→②→①→④→⑤ (2)溶解DNA (3)析出并获得DNA DNA不溶于酒精 (4)白 二苯胺 沸水浴冷却 蓝色 (5)猪是哺乳动物，哺乳动物血液中成熟的红细胞没有细胞核
14．(1)重组DNA分子的鉴定和筛选(或鉴别目的基因是否导入受体细胞)
(2)
(3)磷酸二酯 两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同 (4)能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素 pBR322质粒
1．D [该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D。]
2．D [基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的，A正确；工具酶(限制酶和DNA连接酶)和载体的发现使基因工程的实施成为可能，B正确；遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据，与基因工程直接相关，C正确；1973年，科学家证明质粒可以作为基因工程的载体，打破了物种间的障碍，实现物种间的基因交流，D错误。]
3．D [图中①④可能是同一种限制酶切割形成的，因此题图DNA片段可能是由3种限制酶切割后产生的，A错误；②片段是在识别序列为的限制酶作用下形成的，B错误；①④连接形成重组DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误。]
4．C [E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接具有黏性末端的DNA片段和具有平末端的DNA片段，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4 DNA连接酶。DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。]
5．(1)含目的基因的DNA分子上含有2个EcoRⅠ和1个PstⅠ的酶切位点，3个切点全部切开，则形成4种DNA片段。质粒与含目的基因的DNA片段都用EcoRⅠ酶切，目的基因两端和质粒载体切口处的黏性末端相同，只考虑两个DNA片段相连，则会形成3种连接产物，即质粒载体与质粒载体相连、质粒载体与目的基因相连、目的基因与目的基因相连。(2)为了防止任意连接，可选用EcoRⅠ和SmaⅠ两种酶同时切割。
6．D [质粒不只分布于原核生物中，在真核生物如酵母菌细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。]
7．A [用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后会被破坏，因此不适于作为目的基因的载体。]
8．A [DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，将白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象，离心后应保留上清液，B错误；将洋葱置于清水中，由于细胞壁的支持和保护作用，植物细胞不会吸水涨破，C错误；鉴定DNA时，将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂，混匀后置于沸水中加热，冷却后会出现蓝色，D错误。]
9．(1)题述图示中，该实验的正确操作顺序是③→②→①→④→⑤。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液。(3)步骤①的目的是利用DNA不溶于酒精的性质，除去细胞中溶于酒精的物质提取DNA。(4)步骤①提取的DNA为白色丝状物，鉴定DNA用二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，冷却后溶液呈蓝色。(5)猪是哺乳动物，哺乳动物血液中的成熟红细胞没有细胞核和众多的细胞器，因此用猪血代替鸡血来进行该实验难以取得成功。
10．A [①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长，说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因没有被破坏，所以插入点是c；②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因正常而四环素抗性基因被破坏，故插入点为b；③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长，能在含四环素的培养基上生长，说明其氨苄青霉素抗性基因被外源基因插入而破坏，故插入点为a。]
11．C [插入的目的基因破坏了lacZ基因，不能合成将无色染料X-gal变成蓝色的酶，但没有破坏氨苄青霉素抗性基因，能在含氨苄青霉素和无色染料X-gal的培养基中生存且不会将无色染料变成蓝色的菌落即含有目的基因的大肠杆菌。]
12．A [由于Y表示C或T，R表示A或G，说明一种限制酶能识别一种或多种特定的脱氧核苷酸序列，A错误；限制酶的切割位点不一定在识别序列的内部，如Sau3AⅠ，B正确；由表可知，BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后形成的黏性末端相同，说明不同限制酶切割后可形成相同的黏性末端，C正确；限制酶切割后可形成平末端，D正确。]
13．B [家兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA含量高并且材料易得的生物都可以作为提取DNA的材料，所以菠菜也可以作为提取DNA的材料，C错误；鉴定DNA时，将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂，进行沸水浴，冷却后溶液呈蓝色，D错误。]
14．(1)构建人工质粒时要有抗性基因作为标记基因，用于重组DNA分子的鉴定和筛选或便于鉴别目的基因是否导入受体细胞。(2)EcoRⅠ只能识别核酸序列—GAATTC—，并只能在G与A之间切割。根据限制酶的识别序列和切割位点进行解答。(3)DNA连接酶的作用是恢复磷酸二酯键；由题干分析可知，两种限制酶(BamHⅠ和BglⅡ)切割得到的黏性末端相同，这样才能进行相应的碱基互补配对。(4)与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素；图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是能抗氨苄青霉素和四环素的人工质粒，即pBR322质粒。
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