第2节 基因工程的基本操作程序
第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
知识点1 目的基因的筛选与获取
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的____________。
(2)______________的构建。
(3)将目的基因导入__________。
(4)目的基因的____________。
2．目的基因的筛选与获取(第一步)
(1)目的基因
①概念：用于改变______________或获得______________等的基因。
②实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是________________。
(2)筛选合适的目的基因
①较为有效的方法：从相关的__________和__________的基因中进行筛选。
②实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的__________，也对Bt基因的表达产物——____________有了较为深入的了解。
③认识基因结构和功能的技术方法：______技术、______数据库、__________工具。
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：_______________。
②DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
________(体外用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的______
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
___________ 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的_____端开始连接脱氧核苷酸
③过程
基于PCR的过程，请回答下列问题：
a．过程Ⅰ为______，该阶段的温度为________以上，目的是使双链DNA解聚为______。
b．过程Ⅱ为______，该阶段的温度为__________左右，两种引物通过______________与两条单链DNA结合。
c．过程Ⅲ为______，该阶段的温度为________左右，该过程需要在耐高温的___________的作用下，利用_______________为原料，根据碱基互补配对原则从子链的_____端延伸合成新的DNA链。
④仪器：____________________。
⑤鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。
PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，原因是什么？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
基于对目的基因的筛选与获取的认识，判断下列表述是否正确。
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 ( )
2．用PCR仪对DNA分子扩增常用耐高温的DNA连接酶。 ( )
3．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( )
4．PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。 ( )
5．PCR反应中DNA分子边解旋边复制。 ( )
图1、图2分别是PCR反应相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，两组引物都不合理，请分别说明理由。
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1．PCR扩增的过程(如图)
2．PCR扩增的计算：理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3．生物体内DNA复制和PCR扩增的比较
项目 DNA复制 PCR
解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋
场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR仪内)
酶 解旋酶、普通的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶
温度 条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行
结果 DNA分子 DNA片段或目的基因
相同点 ①模板：均需要DNA的两条单链作为模板 ②原料：均为4种脱氧核苷酸 ③酶：均需DNA聚合酶
1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
知识点2 基因表达载体的构建
1．基因表达载体的构建目的
(1)使基因在__________中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够______和发挥作用。
(选择性必修3 P80“小思考”)获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会__________，即使可以转录、翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着__________而进行复制，导致子代细胞中________________。因此，获取Bt基因后，还需要__________________________，才能使棉花植株获得抗虫特性。
2．基因表达载体的组成
启动子和起始密码子有什么不同？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的________切割载体。
(2)然后用______限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用___________将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。
基于对基因表达载体的构建的认识，判断下列说法是否正确。
1．构建基因表达载体是基因工程操作程序的核心工作。 ( )
2．基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。 ( )
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 ( )
4．标记基因不一定是抗生素抗性基因。 ( )
1．下图是某质粒上的几种限制酶的酶切位点。
(1)在构建基因表达载体时，可用于切割质粒插入目的基因的位点有哪些？原因是什么？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
(2)其他位点不宜插入目的基因的原因是什么？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2．下图1、2分别表示载体和目的基因及其上的限制酶的切割位点。
与只使用EcoRⅠ相比，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和含目的基因的DNA的优点是什么？
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不能选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不能选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
原、真核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
②真核生物基因
1．下列关于基因表达载体的构建的叙述，错误的是( )
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo 表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
结论语句
(1)PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。
(2)PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。
(3)PCR扩增的过程：变性→复性→延伸。
(4)在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。
1．基因工程主要操作步骤的顺序是( )
①基因表达载体的构建 ②将目的基因导入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定 ④目的基因的获取
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
2．PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是( )
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
3．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是( )
A．目的基因插入位点
B．启动子
C．标记基因
D．DNA聚合酶识别位点
4．以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是( )
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B．表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D．表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
5．PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。请回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是______________(用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是____________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、________三步，其中复性的结果是__________________________。
(3)为了作出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指_______________________________________
_____________________________________________________________________。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
第1课时 目的基因的筛选与获取和
基因表达载体的构建
知识点1
自主梳理
1．(1)筛选与获取 (2)基因表达载体 (3)受体细胞 (4)检测与鉴定 2.(1)受体细胞性状 预期表达产物 Bt抗虫蛋白基因 (2)已知结构 功能清晰 序列信息 Bt抗虫蛋白 测序 序列 序列比对 (3)DNA半保留复制 解旋酶 模板 DNA聚合酶 3′ 变性 90 ℃ 单链 复性 50 ℃ 碱基互补配对 延伸 72 ℃ DNA聚合酶 4种脱氧核苷酸 3′ PCR扩增仪(PCR仪)
微思考
提示：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
基础诊断
1．√
2．× 提示：用PCR仪对DNA分子扩增常用耐高温的DNA聚合酶。
3．× 提示：PCR反应中温度的周期性改变是为了让DNA分子解聚、引物与DNA单链结合和子链延伸。
4．√
5．× 提示：PCR反应中DNA分子完全解旋之后再进行复制。
合作探究
1．提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
2．提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
3．提示：3轮；1/4。
4．提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
5．提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6．提示：共需消耗2n－1对引物。
对点练习
1．A [目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。]
2．D [由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。]
知识点2
自主梳理
1．(1)受体细胞 (2)表达 2.启动子 上游 RNA聚合酶 终止子 下游 转录 标记 3.(1)限制酶 (2)同种
(3)DNA连接酶
教材隐性知识
直接分解 细胞分裂 不含有目的基因 借助载体将其导入棉花细胞
微思考
提示：启动子位于DNA分子上，启动的是转录过程，起始密码子位于mRNA分子上，是翻译过程的起始位置。
基础诊断
1．√
2．× 提示：基因表达载体中含有启动子和终止子。
3．× 提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
4．√
合作探究
1．(1)提示：NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ三个位点都可用于切割质粒插入目的基因。因为这三个位点都位于启动子和终止子之间。
(2)提示：Hind Ⅲ：该位点插入目的基因会破坏启动子。
EcoRⅠ：该位点插入目的基因会破坏终止子。
KpnⅠ：该位点插入目的基因会破坏复制原点，造成目的基因不能在受体细胞中复制。
PstⅠ：该位点插入目的基因会破坏标记基因，造成无法筛选出含目的基因的受体细胞。
XhoⅠ：该位点插入目的基因不在启动子和终止子之间，基因不能表达。
2．提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
对点练习
1．B [启动子位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。]
2．D [切割外源DNA分子上的目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上可保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需要保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上的氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。]
课堂检测素养测评
1．C [基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。]
2．C [DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。]
3．B [基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。]
4．B [基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]
5．解析：(1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的酶是耐高温的DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步。复性是温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物，这样PCR反应所用的引物会与该种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
答案：(1)④②③① (2)耐高温的DNA聚合酶 延伸 引物通过碱基互补配对与单链DNA结合 (3)病原菌DNA (4)在生物体外大量快速扩增特定DNA片段的技术
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第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
课标要求
对应学生用书第76页
1．培育转基因抗虫棉的四个步骤
(1)目的基因的____________。
(2)______________的构建。
(3)将目的基因导入__________。
(4)目的基因的____________。
知识点1 目的基因的筛选与获取
筛选与获取
基因表达载体
受体细胞
检测与鉴定
2．目的基因的筛选与获取(第一步)
(1)目的基因
①概念：用于改变______________或获得______________等的基因。
②实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是________________。
受体细胞性状
预期表达产物
Bt抗虫蛋白基因
(2)筛选合适的目的基因
①较为有效的方法：从相关的__________和__________的基因中进行筛选。
②实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的__________，也对Bt基因的表达产物——____________有了较为深入的了解。
③认识基因结构和功能的技术方法：______技术、______数据库、__________工具。
已知结构
功能清晰
序列信息
Bt抗虫蛋白
测序
序列
序列比对
(3)利用PCR获取和扩增目的基因
①原理：_______________。
②DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
________(体外用高温代替) 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的______
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
___________ 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的_____端开始连接脱氧核苷酸
DNA半保留复制
解旋酶
模板
DNA聚合酶
3′
③过程
基于PCR的过程，请回答下列问题：
a．过程Ⅰ为______，该阶段的温度为________以上，目的是使双链DNA解聚为______。
b．过程Ⅱ为______，该阶段的温度为__________左右，两种引物通过______________与两条单链DNA结合。
c．过程Ⅲ为______，该阶段的温度为________左右，该过程需要在耐高温的___________的作用下，利用_______________为原料，根据碱基互补配对原则从子链的_____端延伸合成新的DNA链。
④仪器：____________________。
⑤鉴定方法：琼脂糖凝胶电泳。
变性
90 ℃
单链
复性
50 ℃
碱基互补配对
延伸
72 ℃
DNA聚合酶
4种脱氧核苷酸
3′
PCR扩增仪(PCR仪)
PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，原因是什么？
提示：真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
基于对目的基因的筛选与获取的认识，判断下列表述是否正确。
1．从已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是获取目的基因的一种有效方法。 ( )
2．用PCR仪对DNA分子扩增常用耐高温的DNA连接酶。 ( )
提示：用PCR仪对DNA分子扩增常用耐高温的DNA聚合酶。
√
×
3．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应。 ( )
提示：PCR反应中温度的周期性改变是为了让DNA分子解聚、引物与DNA单链结合和子链延伸。
4．PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。 ( )
5．PCR反应中DNA分子边解旋边复制。 ( )
提示：PCR反应中DNA分子完全解旋之后再进行复制。
×
√
×
图1、图2分别是PCR反应相关过程，请思考回答下列问题：
1．PCR扩增的是完整的模板DNA分子吗？并说明理由。
提示：不是；PCR扩增的仅仅是两种引物之间所对应的特定DNA片段。
2．如果已知某目的基因的序列和结构，利用PCR筛选和扩增出该目的基因的关键是什么？
提示：根据目的基因两端的核苷酸序列设计引物。
3．图1所示利用PCR技术扩增目的基因，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段？比例是多少？
提示：3轮；1/4。
4．图2是某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)，两组引物都不合理，请分别说明理由。
提示：第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物Ⅰ′自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
5．要保证目的基因能与载体相连接，还要对引物进行什么操作？
提示：要在两种引物的5′端分别添加上限制酶的识别序列。
6．如果循环n次，则共需消耗多少对引物？
提示：共需消耗2n－1对引物。
深化归纳
1．PCR扩增的过程(如图)
2．PCR扩增的计算：理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA提供模板，则循环n次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3．生物体内DNA复制和PCR扩增的比较
项目 DNA复制 PCR
解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温作用下变性解旋
场所 细胞内(主要在细胞核内) 细胞外(主要在PCR仪内)
酶 解旋酶、普通的DNA聚合酶 耐高温的DNA聚合酶
项目 DNA复制 PCR
温度 条件 细胞内温和条件 需控制温度，在较高温度下进行
结果 DNA分子 DNA片段或目的基因
相同点 ①模板：均需要DNA的两条单链作为模板 ②原料：均为4种脱氧核苷酸 ③酶：均需DNA聚合酶
对点练习
1．下列有关获取目的基因的叙述，错误的是( )
A．目的基因就是编码蛋白质的基因
B．获取目的基因是基因工程的第一步
C．来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D．序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
√
A [目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子，A错误。]
2．如图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列有关叙述错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3′端
B．在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C．引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D．从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
√
D [由题图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。]
1．基因表达载体的构建目的
(1)使基因在__________中稳定存在，并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够______和发挥作用。
知识点2 基因表达载体的构建
受体细胞
表达
(选择性必修3 P80“小思考”)获取Bt基因后不能直接将它导入受体细胞，是因为游离的DNA进入受体细胞，一般会__________，即使可以转录、翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着__________而进行复制，导致子代细胞中________________。因此，获取Bt基因后，还需要__________________________，才能使棉花植株获得抗虫特性。
直接分解
细胞分裂
不含有目的基因
借助载体将其导入棉花细胞
2．基因表达载体的组成
启动子和起始密码子有什么不同？
提示：启动子位于DNA分子上，启动的是转录过程，起始密码子位于mRNA分子上，是翻译过程的起始位置。
3．基因表达载体的构建过程
(1)首先用一定的________切割载体。
(2)然后用______限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。
(3)再利用___________将目的基因片
段拼接到载体的切口处(如图所示)。
限制酶
同种
DNA连接酶
基于对基因表达载体的构建的认识，判断下列说法是否正确。
1．构建基因表达载体是基因工程操作程序的核心工作。 ( )
2．基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。 ( )
提示：基因表达载体中含有启动子和终止子。
3．基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。 ( )
提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
4．标记基因不一定是抗生素抗性基因。 ( )
√
×
×
√
1．下图是某质粒上的几种限制酶的酶切位点。
(1)在构建基因表达载体时，可用于切割质粒插入目的基因的位点有哪些？原因是什么？
提示：NdeⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ三个位点都可用于切割质粒插入目的基因。因为这三个位点都位于启动子和终止子之间。
(2)其他位点不宜插入目的基因的原因是什么？
提示：HindⅢ：该位点插入目的基因会破坏启动子。
EcoRⅠ：该位点插入目的基因会破坏终止子。
KpnⅠ：该位点插入目的基因会破坏复制原点，造成目的基因不能在受体细胞中复制。
PstⅠ：该位点插入目的基因会破坏标记基因，造成无法筛选出含目的基因的受体细胞。
XhoⅠ：该位点插入目的基因不在启动子和终止子之间，基因不能表达。
2．下图1、2分别表示载体和目的基因及其上的限制酶的切割位点。
与只使用EcoRⅠ相比，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒和含目的基因的DNA的优点是什么？
提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
深化归纳
1．区分启动子和终止子与起始密码子和终止密码子
启动子和终止子位于DNA上，是基因表达载体必需的部分，而起始密码子和终止密码子位于mRNA上，决定翻译的开始和结束。
2．图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不能选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不能选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶切割质粒，如图中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
知识拓展 原、真核细胞基因的结构和表达
(1)基因的结构
(2)基因表达遗传信息
①原核生物基因
②真核生物基因
对点练习
1．下列关于基因表达载体的构建的叙述，错误的是( )
A．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B．基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C．人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D．由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
√
B [启动子位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的位点，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达，C正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，且目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。]
2．图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo 表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
√
D [切割外源DNA分子上的目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和HindⅢ进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上可保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需要保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上的氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。]
结论语句
(1)PCR是聚合酶链式反应的缩写，该技术的原理是DNA半保留复制。
(2)PCR反应进行的条件有缓冲溶液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、温度条件等。
(3)PCR扩增的过程：变性→复性→延伸。
(4)在构建基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶连接形成重组DNA分子。
1．基因工程主要操作步骤的顺序是( )
①基因表达载体的构建 ②将目的基因导入受体细胞 ③目的基因的检测与鉴定 ④目的基因的获取
A．③②④① B．②④①③
C．④①②③ D．③④①②
课堂检测 素养测评
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√
C [基因工程的主要操作步骤顺序：目的基因的获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。]
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5
2．PCR是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，与人体细胞内DNA分子复制相比，下列有关叙述错误的是( )
A．都遵循碱基互补配对原则
B．DNA聚合酶作用的最适温度不同
C．都是边解旋边复制的过程
D．复制方式都是半保留复制
√
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1
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C [DNA分子的体外复制和体内复制都遵循碱基互补配对原则，A正确；PCR是在较高温度条件下进行的，因此PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，B正确；PCR是在较高温度条件下打开双链后进行扩增的，不是边解旋边复制的，C错误；DNA复制方式都是半保留复制，D正确。]
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1
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3．如图是基因工程中基因表达载体的模式图，若结构X是表达载体所必需的，则X最可能是( )
A．目的基因插入位点
B．启动子
C．标记基因
D．DNA聚合酶识别位点
√
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1
5
B [基因表达载体由启动子、终止子、标记基因、复制原点和目的基因等组成。题图中有终止子、标记基因(抗生素抗性基因)、目的基因、复制原点等，还缺少启动子。启动子位于基因的上游，所以X最可能是启动子，B正确。]
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5
4．以下关于基因表达载体的构建的说法正确的是( )
A．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
B．表达载体中只有启动子才能驱动目的基因转录出mRNA
C．基因表达载体的组成应包括启动子、终止密码子、目的基因、标记基因等
D．表达载体通常采用抗生素合成基因作为标记基因
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5
√
B [基因表达载体的构建是在生物体外完成的，A错误；基因表达载体的组成应包括启动子、终止子、目的基因、标记基因等，终止密码子位于mRNA上，C错误；表达载体通常采用抗生素抗性基因作为标记基因，D错误。]
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1
5
5．PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。请回答下列问题：
(1)若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是__________ (用数字序号表示)。
(2)操作③中使用的酶是____________________，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性、______三步，其中复性的结果是____________________________________。
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1
5
④②③①
耐高温的DNA聚合酶
延伸
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
(3)为了作出正确的诊断，PCR反应所用的引物应该能与____________特异性结合。
(4)PCR(聚合酶链式反应)技术是指________________________ _______________________。
该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
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题号
1
5
病原菌DNA
在生物体外大量快速扩增
特定DNA片段的技术
[解析] (1)为了检测病人是否感染了某种病原菌，首先应采集病人组织样本，然后从病人组织样本中提取DNA，利用PCR扩增DNA片段后，再分析PCR扩增结果，所以正确的操作顺序是④②③①。(2)PCR技术中用到的酶是耐高温的DNA聚合酶，PCR反应中的每次循环可分为变性、复性和延伸三步。复性是温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)PCR反应所用引物要根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计，要检测是否感染病原菌，应根据该病原菌的DNA碱基序列合成引物，这样PCR反应所用的引物会与该种病原菌的DNA特异性结合。(4)PCR技术是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，通过这一技术，可以在短时间内大量扩增目的基因。
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课时分层作业(13)
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目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
（WORD版）
巩固课堂所学 · 激发学习思维
夯实基础知识 · 熟悉命题方式
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本节课掌握了哪些考点？
本节课还有什么疑问点？
课后训练
学习反思
课时小结
THANKS课时分层作业(13) 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
题组一 目的基因的筛选与获取
1．下列有关PCR的叙述，错误的是( )
A．PCR利用的是DNA的热变性原理
B．变性过程中破坏的是磷酸二酯键
C．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
D．延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等
2．下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是( )
A．耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B．引物使耐高温的DNA聚合酶能从引物的5′端延伸DNA链
C．目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板
D．四种脱氧核苷酸为PCR提供原料
3．下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是( )
A．二者子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端
B．二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C．体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D．二者遵循的碱基互补配对原则相同
4．PCR扩增时需考虑高质量的基因组DNA模板以及反应体系中各种组分的优化组合，下列相关叙述错误的是( )
A．反应体系中模板DNA的量和纯度影响PCR的成功与否
B．设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量
C．DNA聚合酶的浓度过低会引起非特异性扩增产物的增多
D．目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置
5．基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。请回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时，解开DNA双链的酶是________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时，使反应体系中的模板DNA解聚为单链的条件是____________________________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的________。
(2)目前在PCR反应中不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是_____________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
题组二 基因表达载体的构建
6．在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是( )
①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子 ②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA ③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止 ④所有基因表达载体的构建是完全相同的 ⑤必须在细胞外进行
A．②③⑤ B．①④
C．①②⑤ D．③④
7．基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是( )
A．载体能防止目的基因被受体细胞限制酶切割
B．载体能协助目的基因在受体细胞中复制
C．载体含有启动子和终止子协助目的基因表达
D．载体具有标记基因，便于筛选含重组DNA分子的受体细胞
8．如图所示为某质粒限制酶酶切图谱。某基因不含图中限制酶识别序列，为使PCR扩增的该基因与该质粒构建重组质粒，则扩增的该基因两端需分别引入哪两种限制酶的识别序列( )
注：图中不同限制酶的识别序列及切割形成的黏性末端均不相同。
A．NdeⅠ和BamHⅠ B．NdeⅠ和XbaⅠ
C．XbaⅠ和BamHⅠ D．EcoRⅠ和KpnⅠ
9．图1中的三个DNA片段上依次标出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点；图2为某种基因表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
(1)三种限制性内切核酸酶切割产生的DNA片段末端均为________末端，判断依据是________________________________________________________________
_____________________________________________________________________。
(2)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与图2载体被________酶切后的产物连接，理由是_______________________________________________________
____________________________________________________________________。
(3)图2中启动子的作用是________________________________，抗生素抗性基因的作用是__________________________________。
(4)图3是根据图2制成的三个基因表达载体。甲、乙、丙三个重组DNA分子中，可以在宿主细胞中正常表达目的基因产物的是________， 理由是________________________________。
10．PCR引物的3′端为结合模板DNA的关键碱基，5′端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列。下列叙述正确的是( )
A．该图表示PCR循环中的变性环节
B．引物的长度、引物中碱基的比例以及反应体系中引物的浓度都与扩增产物的特异性相关
C．脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到5′端
D．用图中引物扩增两个循环后可获得目的产物
11．(2023·全国新课标卷)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是( )
A．质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B．质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C．质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D．质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
12．某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A．其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′
B．步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C．用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了两个片段
D．酶切片段和载体连接时，可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶
13．下面是利用基因工程技术培育转基因植物，进而生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法不正确的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．基因表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．卡那霉素抗性基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，基因表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
14．RT-PCR是将RNA的逆转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。下列说法不正确的是( )
A. 该技术中遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA
B．该技术中需要逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶
C．该技术的前提是要以RNA全部碱基序列为模板设计并合成引物
D．该技术可用来检测组织细胞中基因的表达水平或RNA病毒的含量
15．图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因(TetR)和氨苄青霉素抗性基因(AmpR)。请回答下列问题。
(1)EcoRⅤ酶切位点为，EcoRⅤ酶切出来的线性载体P1为________末端。
(2)用耐高温的 DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在________酶作用下，形成重组质粒P3。
(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表(“＋”代表生长，“－”代表不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落类型是________(填表中字母)，另外两类菌落质粒导入情况分别是______________、__________________。
菌落类型 平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是____________________。
课时分层作业(13)
1 2 3 4 6 7 8 10 11 12 13 14
B B B C A A A B C B B C
5．(1)解旋酶 加热至超过90 ℃ 氢键 (2)大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
9．(1)黏性 三种限制性内切核酸酶均在识别序列中心线的两侧进行切割 (2)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端 (3)RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA 筛选含重组DNA分子的受体细胞 (4)乙 乙的目的基因位于启动子和终止子之间
15．(1)平 (2)胸腺嘧啶(T) DNA连接 (3)B A菌落含有P0 C菌落未转入质粒 (4)乙、丙 目的基因反向连接
1．B [PCR利用的是DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，A正确；变性过程中目的基因DNA受热变性后解为单链，破坏的是氢键，B错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C正确；延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸等，D正确。]
2．B [通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化DNA子链的合成，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA的半保留复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；DNA合成的原料是四种脱氧核苷酸，D正确。]
3．B [体内DNA复制与利用PCR技术扩增DNA比较，子链的延伸方向相同，均为5′端→3′端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下使氢键断裂，B错误；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。]
4．C [PCR体外扩增需要DNA作为模板，所以反应体系中模板DNA的量和纯度会影响PCR的成功与否，A正确；设计引物时需考虑引物的长度、碱基序列和G—C含量，以保证引物能与目的基因的特定序列识别，且不能出现引物内部或引物之间的碱基互补配对，B正确；复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，非特异性产物增多，C错误；由于PCR扩增需要在引物的下游延伸子链，所以DNA聚合酶只能特异性地催化复制处于两个引物之间的DNA序列，即目标DNA的获得取决于引物在模板DNA上的结合位置，D正确。]
5．(1)生物体细胞内DNA复制开始时是利用解旋酶进行解旋的，而在体外利用PCR技术扩增目的基因时，则是通过加热至超过90 ℃进行解旋的，二者都破坏了碱基对之间的氢键。(2)在PCR过程中，要加热至90 ℃以上，所以使用热稳定性高的DNA聚合酶，而不使用在高温下会失活的大肠杆菌DNA聚合酶。
6．A [一个基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等，①错误；有了启动子才能驱动基因转录出mRNA，②正确；终止子的作用是使转录在所需要的地方停止，③正确；不同基因表达载体的构建过程是不完全相同的，④错误；基因表达载体的构建过程必须在细胞外进行，⑤正确。]
7．A [载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶切割，A符合题意；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且具有自我复制能力，使目的基因数量扩大，B不符合题意；启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，能启动转录过程，终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因表达，C不符合题意；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有重组DNA分子的受体细胞，D不符合题意。]
8．A [构建重组质粒时，要将目的基因插入启动子和终止子之间，而且不能破坏启动子、终止子、复制原点、抗生素抗性基因等部位，故只能选用NdeⅠ和BamHⅠ切割质粒，因此在PCR扩增的该基因两端需分别引入NdeⅠ和BamHⅠ两种限制酶的识别序列。]
10．B [该图表示PCR循环中的复性环节，A错误；引物的长度、引物中碱基的比例以及反应体系中引物的浓度都与扩增产物的特异性相关，B正确；脱氧核苷酸作为扩增的原料会依次连接到3′端，C错误；用图中引物扩增至少三个循环后可获得目的产物，D错误。]
11．C [酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A错误；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B错误；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接后，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C正确；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D错误。]
12．B [由于引物只能引导子链从5′端到3′端，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5′-TGCGCAGT-3′，A正确；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，至少获得了两个片段，C正确；图中形成的是黏性末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端，D正确。]
13．B [图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程的核心步骤，A正确；基因表达载体的构建过程中，需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ，B错误；卡那霉素抗性基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞，C正确；基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构，D正确。]
14．C [由题分析可知，该技术包括从mRNA到cDNA的逆转录过程和从cDNA到DNA的扩增过程，故遗传信息的流动途径是RNA→DNA→DNA，A正确；该过程需要用到逆转录酶和耐高温的DNA聚合酶，B正确；该技术中PCR扩增的DNA为cDNA，利用PCR技术扩增目的基因片段的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，不需要全部碱基序列，C错误；RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因的表达水平或RNA病毒的含量，D正确。]
15．(1)根据题意分析，EcoRⅤ识别的序列是，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)依题意并据图分析可知，目的基因两侧为黏性末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷酸，以便形成具有黏性末端的载体P2；再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。(3)限制酶(EcoRⅤ)切割后破坏了四环素抗性基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B菌落；根据表格分析可知，A菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。(4)据图分析可知，根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙；根据题意和题图分析可知，某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。
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