第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
知识点1 将目的基因导入受体细胞
1．转化
指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内__________和______的过程。
2．将目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入______中。
b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入______。
②农杆菌转化法
a．农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染________植物和______植物；农杆菌的Ti质粒上的________(可转移的DNA)能够整合到所侵染细胞的___________上。
b．转化方法：将目的基因插入农杆菌________________中，让农杆菌侵染植物细胞。
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：__________法。
②常用受体细胞：________。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用_______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核生物(应用最广泛的是大肠杆菌)。
基于将目的基因导入受体细胞的认识，判断下列表述是否正确。
1．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。 ( )
2．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 ( )
3．Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。 ( )
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图。
1．重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
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2．在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上的原因是什么？
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3．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
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1．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2．将目的基因导入不同细胞的方法
项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法 农杆菌 转化法 显微注射法 Ca2+处理法
受体 细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
1．下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是( )
A．可利用花粉管通道法培育转基因植物
B．用Ca2+处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
2．植物基因工程可以改造农作物性状，使农作物变得更加高产。如图是培育良种水稻的有关原理和步骤，下列叙述错误的是( )
A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去作用
B．图中②过程需要在无菌环境下用Ca2+处理农杆菌
C．需要用除草剂检测转基因植株是否具有抗除草剂性状
D．该过程需要用到固体和液体培养基
知识点2 目的基因的检测与鉴定
1．目的基因的检测与鉴定(第四步)
(1)分子水平的检测
①通过_____等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行____________杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
(2)个体生物学水平的鉴定：如饲喂法。
1．确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度，要从个体生物学水平进行鉴定，具体怎样操作？
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2．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是什么？
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2．基因工程的基本操作程序
基于对目的基因的检测与鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 ( )
2．用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则。 ( )
3．检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )
抗虫棉中的“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因。Bt基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。下图为抗虫棉的接种实验(转基因抗虫棉使虫体发育不正常)。
1．图中抗虫棉的接种实验属于哪种水平的鉴定？
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2．用什么方法检测目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上？
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3．用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
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4．如果目的基因是耐盐基因，怎样进行个体水平的鉴定？
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1．目的基因的检测与鉴定
2．常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
1．下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达( )
A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
2．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是( )
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
知识点3 DNA片段的扩增及电泳鉴定
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了_____________原理，通过调节______来控制DNA双链的____________。
(2)琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有________的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上________或________。
②迁移动力与方向：在______的作用下，带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的______、DNA分子的______和______等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的______灯下被检测出来。
2．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)琼脂糖凝胶电泳
基于对DNA片段的扩增及电泳鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子大小有关，与DNA的构象无关。 ( )
2．PCR实验中使用的微量离心管、枪头在使用前要进行干热灭菌。 ( )
3．缓冲液和酶在使用时从冰箱拿出，加热融化。 ( )
4．在向微量离心管中添加反应组分时，移液器上的枪头连续使用后更换。 ( )
1．为什么PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理？
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2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与哪些因素有关？在引物长度相同的情况下，G—C含量高时，设定的复性温度要高一些，原因是什么？
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3．影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移速率的因素有哪些？
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4．假如进行电泳鉴定的结果不止一条带，请分析产生这个结果的可能原因。
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1．操作提示
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
2．琼脂糖凝胶电泳出现的问题分析
问题 原因
未出现扩增条带 ①Taq DNA聚合酶失活 ②引物出现质量问题 ③Mg2+浓度过低 ④变性时的温度低，变性时间短
出现非特异 性扩增条带 ①模板DNA出现污染 ②引物特异性不强或形成引物二聚体 ③Mg2+浓度过高 ④复性时的温度过低等
1．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
2．关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是( )
A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用
C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
3．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有两条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
1．核心概念
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．结论语句
(1)在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌的应用最为广泛。一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
(2)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。
1．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( )
A．培育转基因水稻可用花粉管通道法导入目的基因
B．显微注射法是转基因动物中采用最多的方法
C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2+处理法
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
2．转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( )
A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法
B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术
C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交
D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
3．使用PCR仪的正确实验操作顺序应为( )
①设置好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管的底部
A．②⑤③④① B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
4．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
5．下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：
(1)过程①选用限制酶的最佳方案是________。
A．EcoR Ⅴ和EcoRⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ
C．EcoR Ⅴ和BamHⅠ D．只有BamHⅠ
(2)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是_______________________________________________________________
__________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)过程②需要先将大肠杆菌用________处理，目的是使大肠杆菌处于一种____________________________的生理状态。
(4)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入________和________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。
(5)目的基因导入受体细胞后，常用__________________________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。
第2课时 将目的基因导入受体细胞和
目的基因的检测与鉴定
知识点1
自主梳理
1．维持稳定 表达 2.(1)子房 花粉管通道 胚囊 双子叶 裸子 T-DNA 染色体DNA Ti质粒的T-DNA (2)显微注射 受精卵 (3)Ca2+
基础诊断
1．× 提示：也可以以体细胞为受体细胞。
2．√
3．√
合作探究
1．提示：限制酶、DNA连接酶。
2．提示：原因是农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
3．提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。
对点练习
1．D [可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2+处理大肠杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法，D错误。]
2．A [T-DNA可将T-DNA之间的DNA序列转移并整合至受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够稳定遗传，故T-DNA插入外源基因后不会失去作用，A错误；用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于农杆菌吸收目的基因完成转化过程，故图中②过程(将载体导入农杆菌)需要在无菌环境下用Ca2+处理农杆菌，B正确；为从个体生物学水平上检测图中植株是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测植株，C正确；筛选含重组质粒的农杆菌时用的是固体培养基，扩大培养时应该用液体培养基，故该过程需要用到固体和液体培养基，D正确。]
知识点2
自主梳理
1．(1)PCR 抗原—抗体 2.目的基因 限制酶 DNA连接酶 基因表达载体 表达载体 检测和鉴定
微思考
1．提示：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫的生活情况。
2．提示：仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因。
基础诊断
1．× 提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
2．√
3．√
合作探究
1．提示：属于个体生物学水平的鉴定。
2．提示：PCR技术。
3．提示：用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
4．提示：如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌，观察植物的抗盐情况。
对点练习
1．A [检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，A符合题意。]
2．C [目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。]
知识点3
自主梳理
1．(1)DNA的热变性 温度 解聚与结合 (2)可解离 正电荷 负电荷 电场 相反 浓度 大小 构象 紫外
2．(1)微量移液器 微量离心管 离心机 反应液 (2)琼脂糖 核酸染料 加样孔 电泳缓冲液 加样孔 指示分子大小的标准参照物 指示剂 紫外灯
基础诊断
1．× 提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
2．× 提示：应进行高压灭菌，属于湿热灭菌，枪头是塑料的，干热灭菌会损坏。
3．× 提示：应放在冰块上缓慢融化。
4．× 提示：每吸取一种试剂后都要更换。
合作探究
1．提示：避免外源DNA等因素的污染。
2．提示：引物的长度、引物的碱基组成。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
3．提示：(1)DNA分子的大小。(2)凝胶的浓度。(3)DNA分子的构象。(4)电场强度。(5)碱基组成与温度。(6)电泳缓冲液的组成等。
4．提示：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶不耐高温等。
对点练习
1．C [将所需试剂从冰箱中拿出，应放在冰块上缓慢融化。]
2．A [PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。]
3．D [增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异条带，B、C错误；非特异条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异条带的产生，D正确。]
课堂检测素养测评
1．A [水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]
2．A [将抗虫基因导入受体细胞可以采用农杆菌转化法，但检测目的基因是否导入受体细胞一般采用PCR等技术，A错误。]
3．C [PCR反应的操作步骤一般为准备(包括配制试剂及将各试剂放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种能自动调控温度的仪器，设置好循环程序就可以进行反应。]
4．C [由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。]
5．解析：(1)构建基因表达载体最佳方法是使用双酶切法处理目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端，进而通过DNA连接酶构建基因表达载体，选择限制酶的要求是不能破坏目的基因，故不能选择EcoR Ⅴ，综合分析，可以选择BamHⅠ和EcoRⅠ处理目的基因和质粒。故选B。(2)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间，其中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。(3)将目的基因导入大肠杆菌需要用Ca2+进行处理，目的是使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(4)转基因成功的大肠杆菌内含有青霉素抗性基因且lacZ基因被破坏，因此可在培养基中加入青霉素和X-gal；无lacZ基因，则菌落呈白色，有青霉素抗性基因，则在含青霉素的培养基中能存活，因此若出现白色菌落，则说明基因表达载体成功转入大肠杆菌。(5)抗原与抗体的结合具有特异性，且基因表达的产物通常是蛋白质，故目的基因导入受体细胞后，常用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。
答案：(1)B (2)RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA (3)Ca2+ 能吸收周围环境中DNA分子 (4)青霉素 X-gal 白色 (5)抗原—抗体杂交
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第2课时 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。
课标要求
对应学生用书第82页
1．转化
指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内__________和______的过程。
知识点1 将目的基因导入受体细胞
维持稳定
表达
2．将目的基因导入受体细胞的方法
(1)目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
a．用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入______中。
b．在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助____________进入______。
子房
花粉管通道
胚囊
②农杆菌转化法
a．农杆菌的特点：农杆菌能在自然条件下侵染________植物和______植物；农杆菌的Ti质粒上的________(可转移的DNA)能够整合到所侵染细胞的___________上。
b．转化方法：将目的基因插入农杆菌________________中，让农杆菌侵染植物细胞。
双子叶
裸子
T-DNA
染色体DNA
Ti质粒的T-DNA
(2)目的基因导入动物细胞
①常用方法：__________法。
②常用受体细胞：________。
(3)目的基因导入微生物细胞
①方法：用_______处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
②常用受体细胞：原核生物(应用最广泛的是大肠杆菌)。
显微注射
受精卵
Ca2+
基于将目的基因导入受体细胞的认识，判断下列表述是否正确。
1．为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体细胞。 ( )
提示：也可以以体细胞为受体细胞。
2．将重组表达载体导入动物受精卵常用显微注射法。 ( )
3．Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内，并且与其染色体DNA整合在一起。 ( )
×
√
√
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图。
1．重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？
提示：限制酶、DNA连接酶。
2．在用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上的原因是什么？
提示：原因是农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)可转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
3．将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2+处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。
深化归纳
1．农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)是指被插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体DNA上。
(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
2．将目的基因导入不同细胞的方法
项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法 农杆菌 转化法 显微注射法 Ca2+处理法
受体 细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
对点练习
1．下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是( )
A．可利用花粉管通道法培育转基因植物
B．用Ca2+处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C．对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D．将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
√
D [可利用花粉管通道法培育转基因植物，A正确；用Ca2+处理大肠杆菌，使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2+处理法，D错误。]
2．植物基因工程可以改造农作物性状，使农作物变得更加高产。如图是培育良种水稻的有关原理和步骤，下列叙述错误的是( )
A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去作用
B．图中②过程需要在无菌环境下用Ca2+处理农杆菌
C．需要用除草剂检测转基因植株是否具有抗除草剂性状
D．该过程需要用到固体和液体培养基
√
A [T-DNA可将T-DNA之间的DNA序列转移并整合至受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够稳定遗传，故T-DNA插入外源基因后不会失去作用，A错误；用Ca2+处理农杆菌，使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于农杆菌吸收目的基因完成转化过程，故图中②过程(将载体导入农杆菌)需要在无菌环境下用Ca2+处理农杆菌，B正确；为从个体生物学水平上检测图中植株是否具有抗除草剂性状，可采用的方法是用相应除草剂喷洒待测植株，C正确；筛选含重组质粒的农杆菌时用的是固体培养基，扩大培养时应该用液体培养基，故该过程需要用到固体和液体培养基，D正确。]
1．目的基因的检测与鉴定(第四步)
(1)分子水平的检测
①通过_____等技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA。
②从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行____________杂交，检测目的基因是否翻译成蛋白质等。
(2)个体生物学水平的鉴定：如饲喂法。
知识点2 目的基因的检测与鉴定
PCR
抗原—抗体
1．确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度，要从个体生物学水平进行鉴定，具体怎样操作？
提示：通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫，观察棉铃虫的生活情况。
2．如果将某种抗性基因导入受体细胞后，仅一条染色体含抗性基因，该基因的传递遵循孟德尔分离定律。判断依据是什么？
提示：仅一条染色体含有抗性基因，另一条没有其等位基因。
2．基因工程的基本操作程序
基于对目的基因的检测与鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。 ( )
提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
2．用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA，利用了碱基互补配对原则。 ( )
3．检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交技术。 ( )
×
√
√
抗虫棉中的“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因。Bt基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。下图为抗虫棉的接种实验(转基因抗虫棉使虫体发育不正常)。
1．图中抗虫棉的接种实验属于哪种水平的鉴定？
提示：属于个体生物学水平的鉴定。
2．用什么方法检测目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA上？
提示：PCR技术。
3．用什么方法检测目的基因是否发挥作用？
提示：用PCR技术检测目的基因是否转录出mRNA；用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出相应蛋白质。
4．如果目的基因是耐盐基因，怎样进行个体水平的鉴定？
提示：如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌，观察植物的抗盐情况。
深化归纳
1．目的基因的检测与鉴定
2．常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
转基因生物 检测方法 观察目标
抗虫植物 饲喂害虫 害虫死亡
抗病毒(菌)植物 病毒(菌)感染 未侵染上病斑
抗盐植物 盐水浇灌 正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 正常生长
对点练习
1．下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达
( )
A．在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B．通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C．提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D．抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
√
A [检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有抗性及抗性程度。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，A符合题意。]
2．目的基因导入受体细胞后，需要检测目的基因是否可以维持稳定和表达其遗传特性。下列关于目的基因的检测和鉴定的叙述，正确的是( )
A．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA
B．可采用PCR检测目的基因是否转录和翻译
C．可从转基因生物中提取蛋白质来检测目的基因是否翻译成相应蛋白质
D．抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于分子水平的检测
√
C [目的基因导入受体细胞后，首先要检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键，A错误；PCR可用于检测目的基因是否转录，检测目的基因是否翻译用抗原—抗体杂交技术，B错误；抗虫、抗病检验用于确定转基因生物是否具备相关性状属于个体生物学水平的鉴定，D错误。]
1．实验原理
(1)DNA片段的扩增
PCR利用了_____________原理，通过调节______来控制DNA双链的____________。
知识点3 DNA片段的扩增及电泳鉴定
DNA的热变性
温度
解聚与结合
(2)琼脂糖凝胶电泳
①带电粒子：DNA分子具有________的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上________或________。
②迁移动力与方向：在______的作用下，带电分子会向着与它所带电荷______的电极移动，这个过程就是电泳。
③迁移速率：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的______、DNA分子的______和______等有关。
④检测：凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的______灯下被检测出来。
可解离
正电荷
负电荷
电场
相反
浓度
大小
构象
紫外
2．实验步骤
(1)DNA片段的扩增
(2)琼脂糖凝胶电泳
基于对DNA片段的扩增及电泳鉴定的认识，判断下列表述是否正确。
1．在凝胶中DNA分子的迁移速率与DNA分子大小有关，与DNA的构象无关。 ( )
提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。
×
2．PCR实验中使用的微量离心管、枪头在使用前要进行干热灭菌。
( )
提示：应进行高压灭菌，属于湿热灭菌，枪头是塑料的，干热灭菌会损坏。
3．缓冲液和酶在使用时从冰箱拿出，加热融化。 ( )
提示：应放在冰块上缓慢融化。
4．在向微量离心管中添加反应组分时，移液器上的枪头连续使用后更换。 ( )
提示：每吸取一种试剂后都要更换。
×
×
×
1．为什么PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理？
提示：避免外源DNA等因素的污染。
2．PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与哪些因素有关？在引物长度相同的情况下，G—C含量高时，设定的复性温度要高一些，原因是什么？
提示：引物的长度、引物的碱基组成。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
3．影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移速率的因素有哪些？
提示：(1)DNA分子的大小。(2)凝胶的浓度。(3)DNA分子的构象。(4)电场强度。(5)碱基组成与温度。(6)电泳缓冲液的组成等。
4．假如进行电泳鉴定的结果不止一条带，请分析产生这个结果的可能原因。
提示：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易聚合形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶不耐高温等。
深化归纳
1．操作提示
(1)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
(2)缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
(3)在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
(4)在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
2．琼脂糖凝胶电泳出现的问题分析
问题 原因
未出现扩增 条带 ①Taq DNA聚合酶失活
②引物出现质量问题
③Mg2+浓度过低
④变性时的温度低，变性时间短
出现非特异 性扩增条带 ①模板DNA出现污染
②引物特异性不强或形成引物二聚体
③Mg2+浓度过高
④复性时的温度过低等
对点练习
1．下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C．将PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出，需放在高温环境中迅速融化
D．在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
C [将所需试剂从冰箱中拿出，应放在冰块上缓慢融化。]
√
2．关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是( )
A．PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用
C．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D．电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
√
A [PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。]
3．某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有两条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是
( )
A．增加模板DNA的量 B．延长热变性的时间
C．延长延伸的时间 D．提高复性的温度
√
D [增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性、延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异条带，B、C错误；非特异条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异条带的产生，D正确。]
1．核心概念
转化是指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2．结论语句
(1)在基因工程操作中，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌的应用最为广泛。一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。
(2)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用PCR等技术，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用抗原—抗体杂交技术。
1．下列关于目的基因导入受体细胞的描述，不正确的是( )
A．培育转基因水稻可用花粉管通道法导入目的基因
B．显微注射法是转基因动物中采用最多的方法
C．目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是Ca2+处理法
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
课堂检测 素养测评
2
4
3
题号
1
5
√
A [水稻的花很小，不适合用花粉管通道法导入目的基因，A错误；将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，B正确；将目的基因导入大肠杆菌最常用的方法是用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确；将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法，此外还有基因枪法和花粉管通道法，D正确。]
2
4
3
题号
1
5
2．转基因抗虫棉培育过程中，下列有关目的基因检测与鉴定方法的叙述，错误的是( )
A．检测抗虫基因是否导入——农杆菌转化法
B．检测抗虫基因是否转录——PCR技术
C．检测抗虫基因是否翻译——抗原—抗体杂交
D．检测抗虫蛋白生物功能——抗虫接种实验
√
2
4
3
题号
1
5
A [将抗虫基因导入受体细胞可以采用农杆菌转化法，但检测目的基因是否导入受体细胞一般采用PCR等技术，A错误。]
3．使用PCR仪的正确实验操作顺序应为( )
①设置好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管的底部
A．②⑤③④① B．①⑤③②④
C．②③⑤①④ D．④②⑤③①
√
2
4
3
题号
1
5
C [PCR反应的操作步骤一般为准备(包括配制试剂及将各试剂放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种能自动调控温度的仪器，设置好循环程序就可以进行反应。]
4．下列有关电泳的叙述，不正确的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C．进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D．PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
2
4
3
题号
1
5
√
C [由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。]
5．下图为“乙肝基因工程疫苗”生产过程图解，质粒上箭头所指部位为相应的限制酶的切割位点。质粒中lacZ基因编码产生的酶可以分解培养基中的X-gal，产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。请回答下列问题：
2
4
3
题号
1
5
(1)过程①选用限制酶的最佳方案是________。
A．EcoR Ⅴ和EcoRⅠ B．BamHⅠ和EcoRⅠ
C．EcoR Ⅴ和BamHⅠ D．只有BamHⅠ
(2)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间。启动子的作用是______________________________________ ______________________。
2
4
3
题号
1
5
B
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动
基因转录出mRNA
(3)过程②需要先将大肠杆菌用________处理，目的是使大肠杆菌处于一种____________________________的生理状态。
(4)为了筛选含目的基因表达载体的大肠杆菌，可在培养大肠杆菌的通用培养基中额外加入________和________，培养一段时间后挑选出________(填“蓝色”或“白色”)的菌落进一步培养，从而获得大量目的菌。
(5)目的基因导入受体细胞后，常用__________________技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。
2
4
3
题号
1
5
Ca2+
能吸收周围环境中DNA分子
青霉素
X-gal
白色
抗原—抗体杂交
[解析] (1)构建基因表达载体最佳方法是使用双酶切法处理目的基因和载体，使其产生相同的黏性末端，进而通过DNA连接酶构建基因表达载体，选择限制酶的要求是不能破坏目的基因，故不能选择EcoR Ⅴ，综合分析，可以选择BamHⅠ和EcoRⅠ处理目的基因和质粒。故选B。(2)构建基因表达载体时，一般将目的基因插在启动子和终止子之间，其中启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。(3)将目的基因导入大肠杆菌需要用Ca2+进行处理，目的是使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
2
4
3
题号
1
5
(4)转基因成功的大肠杆菌内含有青霉素抗性基因且lacZ基因被破坏，因此可在培养基中加入青霉素和X-gal；无lacZ基因，则菌落呈白色，有青霉素抗性基因，则在含青霉素的培养基中能存活，因此若出现白色菌落，则说明基因表达载体成功转入大肠杆菌。(5)抗原与抗体的结合具有特异性，且基因表达的产物通常是蛋白质，故目的基因导入受体细胞后，常用抗原—抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出乙肝病毒外壳。
2
4
3
题号
1
5
课时分层作业(14)
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将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
（WORD版）
巩固课堂所学 · 激发学习思维
夯实基础知识 · 熟悉命题方式
自我检测提能 · 及时矫正不足
本节课掌握了哪些考点？
本节课还有什么疑问点？
课后训练
学习反思
课时小结
THANKS课时分层作业(14) 将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定
题组一 将目的基因导入受体细胞
1．受体细胞不同，将目的基因导入受体细胞的方法也不相同，下列受体细胞与导入方法匹配错误的是( )
选项 受体细胞 导入方法
A 棉花细胞 花粉管通道法
B 大肠杆菌 农杆菌转化法
C 羊受精卵 显微注射法
D 水稻细胞 农杆菌转化法
2．我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是( )
A．不必构建表达载体就可以直接导入
B．此方法可用于转基因动物
C．受体细胞只能是植物的卵细胞
D．有时可以取代农杆菌转化法
3．农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是( )
A．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA
B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D．T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上
4．基因工程中，受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题。
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入________细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌________质粒的T-DNA中，然后用该农杆菌侵染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易侵染________植物。农杆菌侵染植物，能够将目的基因插入植物细胞的______________上。
(2)将重组质粒导入动物细胞，常采用________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用________处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以利于表达载体的进入。
(3)将目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的________(填变异类型)。
5．下列用于判断目的基因是否转移成功的方法，不属于分子水平的检测的是( )
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
C．检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA
D．从转基因生物中提取蛋白质利用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成功
6．为增加玉米抗旱性，研究者构建含有某微生物抗旱基因E的重组质粒，采用农杆菌转化法转入玉米幼胚组织细胞中，用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交检测后，进一步筛选出抗旱的转基因玉米。下列相关叙述错误的是( )
A．提取该微生物的mRNA逆转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因
B．重组Ti质粒进入受体细胞后表达出抗旱性状不可遗传，后代需再次导入重组Ti质粒
C．用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞后，可经组织培养获得转基因植株
D．用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状
题组三 DNA片段的扩增及电泳鉴定
7．下列关于DNA片段的扩增及电泳鉴定步骤的说法，错误的是( )
A．PCR过程中，需要加入两种引物
B．所有组分加入微量离心管后，需要放入离心机离心约10 s
C．将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1 mm为宜
D．电泳出现位置不等的几条条带，说明鉴定的PCR产物比较纯净
8．下列关于DNA片段的扩增(PCR技术)及电泳鉴定步骤的说法，错误的是( )
A．凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，用于分离后DNA片段的检测
B．PCR既可以获取目的基因也可以扩增目的基因
C．双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中的移动速率就越大
D．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理
9．如图为转基因抗虫烟草的培育流程，下列叙述正确的是( )
A．培育过程①需要使用纤维素酶和果胶酶
B．培育过程②将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要使用CaCO3处理农杆菌
C．培育过程③④仅通过调节植物激素可诱导愈伤组织再生出新植株
D．可通过观察害虫吞食转基因烟草后的存活情况进行个体生物学水平检测
10．农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA上。研究者将图示中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法不正确的是( )
注：子链从引物的3′端开始延伸。
A．PCR扩增利用的是DNA热变性的原理
B．进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置
11．在基因工程操作中，科研人员利用两种限制酶(R1和R2)处理基因载体，进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图所示。下列相关叙述不正确的是( )
A．电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的
B．该载体最可能为环状DNA分子
C．限制酶R1与R2的切点最长相距约600 bp
D．两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
12．如图为利用基因工程培育抗虫植物的示意图。以下相关叙述，不正确的是( )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与
B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒上的T-DNA整合到④的染色体DNA上
C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
13．OsGLOl、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如下图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述正确的是( )
A．图中表达载体中的T-DNA插入外源基因后将失去作用
B．DNA的两条单链都可作为转录的模板链
C．应选用含卡那霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D．四种基因都在水稻叶绿体内进行转录、翻译
14．肿瘤坏死因子(TNF)在体内、体外均能杀死某些肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞的增殖作用。科研人员利用乳腺生物反应器大量生产肿瘤坏死因子。已知限制酶BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ、BglⅡ的识别序列及切点分别是。回答下列问题：
(1)在构建基因表达载体时，能否选用PstⅠ切割质粒和含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，其原因是________________；若用HindⅢ和BglⅡ切割含肿瘤坏死因子基因的DNA片段，除选用HindⅢ和BglⅡ组合外还可以选用________________组合切割质粒。
(2)利用PCR技术扩增TNF基因时，扩增过程可以在________中自动完成。已知DNA复制时，只能从子链的5′端向3′端开始延伸，据此可知应选择下图甲、乙、丙、丁四种引物中的________作为引物，若扩增4次，共需要引物________个。
(3)科学家需将TNF基因与________________________________________重组在一起，通过______________等方法，导入哺乳动物的________中，由其发育成的转基因动物进入泌乳期后，可以在其分泌的乳汁中获取所需要的TNF。
课时分层作业(14)
1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13
B D D A B D C D C D C B
4．(1)植物 Ti 单子叶 染色体DNA (2)显微注射 Ca2+ (3)基因重组
14．(1)不能，因为用PstⅠ切割质粒会破坏四环素抗性基因 Hind Ⅲ和BamHⅠ (2)PCR仪 乙、丙 30
(3)乳腺细胞中特异表达的基因的启动子等调控元件 显微注射 受精卵
1．B [花粉管通道法是一种十分简便、经济的方法，我国的转基因抗虫棉培育过程用到此种方法，A正确；将目的基因导入微生物细胞常用Ca2+处理法，这种方法能使大肠杆菌细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B错误；显微注射法是将目的基因导入动物细胞(如羊受精卵)的最常用、最有效的方法，C正确；可用农杆菌转化法将目的基因导入水稻细胞，D正确。]
2．D [要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建表达载体才能实现，A错误；花粉管通道法只适用于转基因植物的培育，B错误；采用花粉管通道法时，植物受体细胞一般是植物体细胞或受精卵，通常不选卵细胞，C错误。]
3．D [在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入T-DNA片段中，A错误；农杆菌转化法中应直接利用农杆菌感染植物细胞，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌拟核DNA之外的DNA，C错误；T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上，D正确。]
4．(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞，具体操作时，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，然后用该农杆菌侵染植物细胞。农杆菌在自然条件下，不容易侵染单子叶植物。农杆菌侵染植物后，能够将Ti质粒上的T-DNA携带的目的基因插入植物细胞的染色体DNA上。(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以，用表达载体转化大肠杆菌时，常先用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，以利于表达载体的进入。(3)将目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变，属于可遗传变异中的基因重组。
5．A [通过观察害虫吃棉叶是否死亡，属于个体生物学水平的鉴定，A正确；通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因，属于分子水平的检测，B错误；检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA，属于分子水平的检测，C错误；采用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质，属于分子水平的检测，D错误。]
6．B [可以提取该微生物的mRNA逆转录为cDNA，通过PCR可获得大量目的基因，A正确；重组Ti质粒进入玉米幼胚组织细胞后整合到染色体DNA上，并通过细胞增殖遗传给后代，不需再次导入，B错误；用农杆菌转化法将E基因转入玉米幼胚组织细胞后，可经过脱分化和再分化即植物组织培养获得转基因植株，C正确；用E蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交，可在分子水平检测转基因玉米的抗旱性状，D正确。]
7．D [电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯净，D错误。]
8．C [双链DNA分子片段长度越大，在琼脂糖中移动的速率就越小。]
9．D [过程①表示基因表达载体的构建过程，即形成重组Ti质粒的过程，需要使用限制酶和DNA连接酶，不需要纤维素酶和果胶酶，A错误；过程②是将目的基因导入受体细胞的过程，在将重组Ti质粒导入烟草细胞前需要先使用CaCl2处理农杆菌，B错误；过程③④为再分化形成植株的过程，该过程中需要通过调节营养物质和植物激素的配比，从而实现由愈伤组织诱导出芽和根的顶端分生组织的目的，并由此再生出新植株，C错误；可通过进行个体生物学水平的检测判断转基因抗虫烟草是否培育成功，即让害虫吞食转基因烟草，观察害虫的存活情况进行判断，D正确。]
10．C [PCR是体外扩增DNA的一种方式，扩增利用的是DNA热变性的原理，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3′端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置，D正确。]
11．D [根据图示可知，200 bp的DNA分子量小，800 bp的DNA分子量较大，200 bp的DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸的移动方向是从负极到正极的，A正确；当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生一种长度的DNA片段，因此该载体最有可能为环状DNA分子，B正确；两种限制酶同时切割时产生600 bp和200 bp两种长度的DNA片段，所以两种限制酶的切点最长相距约600 bp，C正确；当仅用一种限制酶切割载体时，两种限制酶切割产生的DNA片段等长，而两种限制酶同时切割时则产生两种不同长度的DNA片段，所以两种限制酶在载体上各有一个酶切位点，二者识别的序列不相同，D错误。]
12．C [构建基因表达载体需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确；含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，B正确；染色体上含有目的基因，但目的基因也可能不能转录或者不能翻译，或者表达的蛋白质不具有生物活性，C错误；若植株表现出抗虫性状，说明目的基因成功导入受体细胞并成功表达，该过程中发生了基因重组，为可遗传变异，D正确。]
13．B [T-DNA可将T-DNA之间的DNA序列转移并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够稳定遗传，故T-DNA插入外源基因后不会失去作用，A错误；由题图可知，在同一个T-DNA中OsGLOl启动子启动转录的方向与其他三个基因的不同，四个基因转录时不都以DNA的同一条单链为模板，因此DNA的两条单链都可作为转录的模板链，不同的基因转录的模板链可能不同，B正确；卡那霉素抗性基因不在T-DNA中，而潮霉素抗性基因在T-DNA中，应选用含潮霉素的培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C错误；由题意可知，利用农杆菌转化法转化水稻，可使目的基因插入水稻细胞中的染色体DNA上，所以与叶绿体转运肽基因连接的四个基因，在水稻细胞核内进行转录，在核糖体中进行翻译，D错误。]
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