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第2课时 基因表达载体的构建
任务 基因表达载体的构建
基因表达载体的构建——转基因的核心工作
1.构建目的:使目的基因在____________________，并且遗传给下一
代，同时使目的基因能够________________。
2.基因表达载体的组成:________、目的基因、________、_________
__等。
受体细胞中稳定存在
表达和发挥作用
启动子
终止子
标记基因
3.构建过程
用一定的________切割载体，使它出现一个切口
用____________或________________的限制酶切割含有目的基因的
片段
利用____________将目的基因片段拼接到载体的切口处
限制酶
同种限制酶
能产生相同末端
连接酶
任务 基因表达载体的构建
【情境】 如图为一个基因表达载体的示意图。
(1)图中 表示的片段是________,位于基因的
上游，是______________________的部位，
驱动基因_____________。
启动子
聚合酶识别和结合
转录出
(2)终止子使______在需要的地方停下来，位
于基因的下游。启动子、终止子本质上是一
段__________________________片段。
转录
有特殊序列结构的片段
(3)标记基因的作用是____________________
______________________________________
________。
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(4)复制原点是 复制的起始位点。该片段
中______碱基对较多，氢键数量相对较少，
不稳定， 容易解旋。
(5)目的基因要添加在________________之间才能被转录。
启动子和终止子
【资料】 阅读教材第80页“基因表达载体构建模式图”。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为____________________。
(2)切割目的基因和质粒的限制酶________(填“一定”或“不一定”)相同，
但要确保切割后产生的末端______(填“相同”或“不相同”)。
限制酶和连接酶
不一定
相同
(3)一般来说，构建基因表达载体时，常用两种不同的限制酶对质粒
和含目的基因的 进行切割，原因是如果用同种限制酶切割，会
导致________________________________________________等问题。
目的基因或质粒的自身环化、目的基因不能定向连接
例1 基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤，是成功的关键，
下列相关说法不正确的是( )
A.构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存
在且遗传给下一代
B.基因工程中使用的标记基因有许多种，有的标记基因是质粒上固
有的
C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和
终止密码子等结构
D.基因表达载体中的复制原点是质粒 的复制的起点
√
[解析] 构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存
在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作
用，A正确；质粒上的标记基因有的是其本身固有的，有的是人为加
上去的，B正确；一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、
启动子和终止子等结构，C错误；基因表达载体中的复制原点是质粒
复制的起点，没有复制原点，质粒 就不能复制，D正确。
［题后归纳］启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 作用 启动转录 终止转录 翻译的起点 翻译的终点
例2 [2024·山东菏泽一中月考] 图甲为某种质粒简图，图乙表示某外
源上的目的基因，小箭头所指分别为限制性内切核酸酶 Ⅰ、
Ⅰ、Ⅲ、 Ⅰ的酶切位点。下列有关叙述错误的是( )
A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源 的切割，
则可选 Ⅰ
B.如果将一个外源分子和一个质粒分别用 Ⅰ酶切后，再用
连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组，此重组
中 Ⅰ酶切位点有1个
C.为了防止目的基因自身环化，酶切时可使用Ⅰ和 Ⅲ两种
限制酶同时处理
D.一个如图甲所示的质粒分子经 Ⅰ切割后，含有2个游离的磷酸
基团
√
[解析] 目的基因两侧都有限制酶 Ⅰ的酶切位点，且质粒也含有限
制酶 Ⅰ的酶切位点，所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对
图示质粒和外源的切割，可选 Ⅰ，A正确；如果将一个外源
分子和一个质粒分别用Ⅰ酶切后，再用 连接酶连接，形
成一个含有目的基因的重组，此重组中 Ⅰ酶切位点有2
个，B错误；为了防止目的基因自身环化，酶切时可使用 Ⅰ和
Ⅲ两种限制酶同时处理，C正确；一个如图甲所示的质粒分子
经 Ⅰ切割后，产生两个黏性末端，含有2个游离的磷酸基团，D
正确。
1.正误辨析
(1)基因表达载体能协助目的基因在受体细胞中复制。( )
√
(2)基因表达载体的构建至少需要两种工具酶。( )
√
(3)终止子相当于一盏红色信号灯，使翻译在所需要的地方停下来。
( )
×
[解析] 终止子相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停下来。
(4)载体上常有特殊的标记基因，便于重组 分子的筛选。( )
√
(5)目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。
( )
×
[解析] 启动子、终止子与目的基因转录的起始和终止有关，而与其
复制无关。
(6)启动子位于基因的上游，是 聚合酶识别和结合的部位，驱动
基因转录出 。( )
×
[解析] 启动子位于基因的上游，是 聚合酶识别和结合的部位,能
驱动基因转录出 。
2.[2024·北京海淀区期中]基因工程中，需使用特定的限制酶切割目
的基因和质粒，以便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点
是 ；限制酶Ⅱ的识别序列和切点是 。据图判断，
下列操作正确的是( )
A.质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
√
[解析] 限制酶Ⅰ的识别序列和切点是 ，限制酶Ⅱ的识别序列
和切点是 ，可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列；
目的基因的右端是限制酶Ⅱ的识别序列和切点，目的基因左端是限制
酶Ⅰ的识别序列和切点，故只有用限制酶Ⅱ才能将目的基因切割下来。
质粒有Ⅰ和 Ⅱ两种标记基因，分别有限制酶Ⅱ的识别序列和
限制酶Ⅰ的识别序列。如果用限制酶Ⅱ切割，则Ⅰ和 Ⅱ都被破
坏，造成重组质粒无标记基因。用限制酶Ⅰ切割，则会破坏 Ⅱ，
保留完整 Ⅰ，其黏性末端和切割目的基因产生的黏性末端相同，
可以连接形成重组 ，A正确。
3.[2024·福建厦门期末]下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相
应的切割位置(箭头所指)，下列叙述正确的是( )
限制酶种类 序列及切点
_________________________________________________
_________________________________________________
限制酶种类 序列及切点
_____________________________________________
___________________________________________________
（续表）
A.①②③④均可催化磷酸二酯键和氢键断裂，形成黏性末端
B.①切出的片段，只有用 E. 连接酶才能连接起来
C.②③切出的末端连接后形成的片段，不能再被②或③识别切割
D.构建基因表达载体时，用②③进行双酶切，可防止目的基因与载
体的反向连接
√
[解析] ①②③④均为限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂，不能催化
氢键的断裂，且均形成黏性末端，A错误；①切出的 片段带有黏
性末端，用 连接酶和 连接酶均能连接起来，B错
误；②③切出的黏性末端相同，用 连接酶连接后形成的片段的
碱基序列为 ，因而不能再被②或③识别切割，C正确；构
建基因表达载体时，用②③进行双酶切，不能防止目的基因与载体
的反向连接，因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的，D错误。
4.[2024·云南保山期末]下图分别表示某种质粒和含目的基因的 片
段，利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。下
列为几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点。
Ⅰ： ； Ⅰ： ；
Ⅰ： ； Ⅰ： ；
Ⅰ： 。
注：表示四环素抗性基因； 表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述，错误的
是( )
A.若单独使用 Ⅰ，则目的基因表达的产物可能不相同
B.若单独使用 Ⅰ，则含有目的基因的受体菌不能在含氨苄青霉素
的培养基中生长
C.若选择使用Ⅰ和 Ⅰ，能在含四环素的培养基中生长的受体
菌一定含有目的基因
D.若用Ⅰ和Ⅰ切割质粒，则需用Ⅰ和 Ⅰ切割含目的基
因的
√
[解析] 用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的 片段后，目的
基因可能会反向连接到质粒上，因此目的基因表达的产物可能不相
同，A正确；若单独使用Ⅰ切割质粒和含目的基因的 片段，
会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因，使含有目的基因的受体菌不
能在含氨苄青霉素的培养基中生长，B正确；若选择使用 Ⅰ和
Ⅰ切割质粒和含目的基因的 片段，重组质粒上含有正常的四
环素抗性基因，能在含四环素的培养基中生长的受体菌有可能获得
了重组质粒，也有可能获得了普通质粒，C错误；
含目的基因的片段上没有Ⅰ的识别序列，不能使用 Ⅰ切割含
目的基因的片段，但Ⅰ切割后产生的黏性末端与 Ⅰ
的相同，故若用Ⅰ和Ⅰ切割质粒，则需用Ⅰ和 Ⅰ切割
含目的基因的 片段，D正确。
1.研究人员用质粒pBR322和目的基因构建基因表达载体，质粒pBR322
和目的基因的结构与相关限制酶的识别位点如图所示。下列叙述错误
的是( )
A．应选用酶B和酶C切割
pBR322和目的基因
B．氨苄青霉素抗性基因的
作用是便于重组DNA的筛选
C．图中pBR322中终止子的位置应位于②部位
D．导入重组质粒的受体菌应接种于含四环素的培养基中培养
√
[解析] 据图可知，目的基因的两侧有酶A、酶B和酶C识别序列，质
粒上也含有这三种酶识别序列，但酶A能把质粒上2个标记基因都破
坏，因此不能用酶A，应选用酶B和酶C切割质粒pBR322和目的基因，
A正确；用酶B和酶C切割pBR322和目的基因后，只有氨苄青霉素抗
性基因保留下来，其作用是便于重组DNA的筛选，导入重组质粒的
受体菌应接种于含氨苄青霉素的培养基中培养，B正确，D错误；目
的基因插在四环素抗性基因中，根据质粒pBR322上箭头方向可知，
终止子的位置应位于②部位，C正确。
2.科研人员想利用发绿色荧光的大肠杆菌来快捷检测出水中的毒物，
将毒物诱导型启动子S插入图示质粒的P区，构建基因表达载体前需要
利用PCR技术扩增启动子S。据图分析，下列叙述错误的是( )
A．扩增启动子S时，所用引物I上最好有限制酶Xho I的识别序列
B．若该重组质粒能随大肠杆菌稳定遗传，则图示质粒还应有复制原点
C．为了便于筛选，所选用大肠杆菌原本不能具有抗氨苄青霉素的特性
D．启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，两者的结合不受外因影响
√
[解析] PCR扩增启动子S时，图中引物I、Ⅱ应分别加入Xho I、BamH I
的识别序列，A正确；质粒在大肠杆菌内稳定遗传，必须能自我复制，
而复制原点是质粒自我复制必须具备的片段，B正确；氨苄青霉素抗
性基因是标记基因，可使用添加氨苄青霉素的培养基筛选转入重组质
粒的菌株，但所选用的大肠杆菌原本不能具有抗氨苄青霉素的特性，
C正确；启动子S是毒物诱导型启动子，说明RNA聚合酶与启动子的
结合受外界因素的影响，D错误。
3.某生物的W基因可编码
一种营养价值极高的W物
质。为了大批量获得W物
质，某研究小组构建了W
基因的表达载体，并利用
工程菌生产W物质。质粒、
含W基因的DNA片段及有
关限制酶识别序列和切割
位点如图所示。回答下列问题：
限制酶 BamH I EcoR I Mfe I Kpn I Hind Ⅲ
识别序列和切割位点（5'→3'） G↓GATTC G↓AATTC C↓AATTG GGTAC↓C A↓AGCTT
(1)质粒作为常用的运载体，其特点有
（答出2点）。
具有一个至多个限制酶切割位
点、有标记基因、能在受体细胞内复制
[解析] 质粒作为常用的运载体，其特点有具有一个至多个限制酶切割
位点、具有标记基因、能在受体细胞内复制。
(2)若图中W基因的转录方向是从左向右，结合图甲和图乙分析，应使
用限制酶 切割图中质粒，使用限制酶
切割图中含W基因的DNA片段。不能选择BamH I切割质粒和含W基
因的DNA片段的理由是
。
Mfe I、Hind Ⅲ
EcoR I、Hind Ⅲ
BamH I会切割质粒的启动子，导致重组DNA
分子（W基因）无法转录
[解析] 结合图甲和图乙分析，BamH I会切割质粒的启动子，导致重
组DNA分子（W基因）无法转录；EcoR I会在2个位点切割质粒，从
而影响重组DNA分子的构建；Mfe I会切割W基因，使用Kpn I可能会
使W基因和质粒反向连接，故应使用限制酶Mfe I、Hind Ⅲ切割图中
质粒，使用限制酶EcoR I、Hind Ⅲ切割图中含W基因的DNA片段。
(3)若图中W基因的转录方向是从左向右，则W基因转录的模板链是
（填“甲链”或“乙链”）。利用PCR技术对W基因进行扩增的原理
是 。
乙链
DNA半保留复制
[解析] 若W基因的转录方向是从左向右，则mRNA链的合成方向为从
左向右5'→3'，与乙链从左向右3'→5'互补，故W基因转录的模板链是
乙链。利用PCR技术扩增目的基因的原理是DNA的半保留复制。
(4)研究人员利用W基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA，已知其
mRNA的序列为5'—UGAACGCUA…（中间序列）…GUCGACUCG—
3'。为了便于将扩增后的基因和载体连接构建重组质粒，用于PCR扩
增的引物应为 。
A．5'—GAATTCTGAACG—3' B．5'—AAGCTTCGAGTC—3'
C．5'—GAATTCCGAGTC—3' D．5'—AAGCTTTGAACG—3'
AB
[解析] 已知W基因的mRNA的序列为5'—UGAACGCUA…（中间序
列）…GUCGACUCG—3'，其经逆转录得到的cDNA的序列为5’—CG
AGTCGAC…（中间序列）…TAGCGTTCA—3'，利用PCR技术对
cDNA进行扩增，PCR过程需要两种引物，它们能分别与目的基因
两条链的3'端通过碱基互补配对结合，并具有EcoR I、Hind Ⅲ识别
序列，故PCR扩增时所需引物的碱基序列为5'—GAATTCTGAACG—
3'，5'—AAGCTTCGAGTC—3'，A、B正确。
练习册
1.下列关于基因表达载体构建的叙述,不正确的是( )
A.需要限制酶和 连接酶
B.必须在细胞内进行
C.抗生素抗性基因可作为标记基因
D.启动子位于目的基因的上游
√
[解析] 构建基因表达载体时需要用限制酶对含目的基因的 片段
和载体进行切割,然后用 连接酶进行连接,A正确;构建基因表达载
体是在细胞外进行的,B错误;抗生素抗性基因可以作为标记基因,C正
确;启动子是一段有特殊序列结构的 片段,位于目的基因的上游,是
聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出 ，D正确。
2.[2024·北京四中期中]基因工程的核心是构建表达载体，下列不属
于载体作用的是( )
A.防止目的基因被受体细胞中的限制酶“切割”
B.能协助目的基因在受体细胞中复制
C.含有启动子和终止子协助目的基因表达
D.具有标记基因，便于筛选含重组 的受体细胞
√
[解析] 载体不能防止目的基因被受体细胞中的限制酶“切割”，A错
误；基因表达载体中有复制原点，目的基因会随着载体的复制而复
制，B正确；基因的表达过程包括转录和翻译，基因表达载体中的启
动子是 聚合酶的识别和结合位点，能控制转录的开始，而终止
子控制着转录的结束，C正确；载体具有标记基因，便于重组 分
子的鉴定和筛选，D正确。
3.基因工程中要使目的基因在受体细胞中稳定存在并能够表达和发挥
作用，需要构建基因表达载体, 下列关于基因表达载体的说法不正确
的是( )
A.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
B.启动子是 聚合酶识别和结合的部位
C.终止子位于目的基因的尾端，能够终止翻译
D.基因表达载体包含复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记
基因等
√
[解析] 不同的目的基因可能在不同的细胞中特异性表达,所以不同的
目的基因所需的启动子不一定相同，A正确；启动子是 上一段特
殊的序列，是 聚合酶识别和结合的部位，B正确;终止子位于目
的基因的尾端，能够终止转录，C错误；基因表达载体包含复制原点、
启动子、目的基因、终止子、标记基因等，其中启动子和终止子与
基因的表达直接相关，标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的
基因，D正确。
4.[2024·山东滨州联考]构建基因表达载体过程中，为保证目的基因
与质粒正确连接一般选用两种限制酶，下列说法错误的是( )
A.选择的原则之一是酶切后目的基因两端的黏性末端不同，质粒两
端的黏性末端也不同
B.两种限制酶的识别序列不同也可能出现目的基因和质粒的反向连接
C.每个正确连接的基因表达载体的构建伴随两个磷酸二酯键的形成
D.为避免破坏目的基因等关键组件的结构，可能会用到三种或四种
限制酶
√
[解析] 目的基因两端的黏性末端不同，被切开的质粒两端的黏性末
端也不同，可以避免目的基因与载体反向连接，还能避免目的基因
和载体的自身环化，A正确；两种限制酶的识别序列不同，若是切割
后产生相同的黏性末端，也可能出现目的基因和质粒的反向连接，B
正确；每个正确连接的基因表达载体的构建伴随四个磷酸二酯键的
形成，C错误；构建基因表达载体时，要保证目的基因、启动子、终
止子等关键组件结构的完整性，故获取目的基因和载体时可能需要
用到三种或者四种限制酶，D正确。
5.[2024·湖南邵阳三模]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、
连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切
割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切
割位点如图所示。下列分析合理的是( )
A.质粒和目的基因都用酶4切割，用 连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C.可选择酶2切割质粒、酶4切割目的基因，再用E. 连接酶连
接，连接后的片段仍能被酶2和酶4切割
D.为了让重组表达载体的构建合理高效，可用酶1和酶2切割质粒和
目的基因，再用 连接酶连接
√
[解析] 用酶4切割会破坏抗生素抗性基因，且用单一酶切割会出现质
粒和目的基因自身环化、目的基因反向连接，A错误；质粒和目的基
因需要用相同的酶切割或者用不同的酶切割但是产生的黏性末端相
同，而酶1和酶3切割产生的末端不同，B错误；酶2和酶4切割后得到
的 片段，连接后不能被酶2和酶4识别，C错误；质粒用酶3切割
后得到平末端，不利于连接，用酶4切割质粒和目的基因，会破坏质
粒上的抗生素抗性基因，不便于筛选，所以质粒和目的基因都用酶1
和酶2切割后得到黏性末端，用 连接酶连接，能保证目的基
因在质粒上的连接方向正确，此重组表达载体的构建方案最合理且
高效，D正确。
6.[2024·福建南平期末]基因是一种抗虫基因。图甲是含有 基因
的片段，将基因与图乙中的质粒构建基因表达载体A，
Ⅰ、Ⅰ和 Ⅲ产生的黏性末端不同。下列相关叙述正确的是
( )
A.用Ⅰ切割基因表
达载体A可产生2个 片段
B.用 Ⅰ切割图乙中的质粒产生4个游离的磷酸基团
C.启动子是 聚合酶识别的部位并编码起始氨基酸
D.可同时用Ⅰ和Ⅲ切割图甲中的 片段和图乙质粒
√
[解析] 基因表达载体A上有一个Ⅰ的酶切位点，因此，用 Ⅰ
切割基因表达载体A(重组质粒)可产生1个 片段，A错误；用
Ⅰ切割图乙中的质粒只能形成一个线性 分子，会产生2个游
离的磷酸基团，B错误；启动子是 聚合酶识别和结合的部位并起
到驱动转录的作用，而起始氨基酸由 上的起始密码子决定，C
错误；同时用Ⅰ和Ⅲ切割图甲中的 片段和图乙质粒，
而后用 连接酶处理，可以使目的基因和质粒发生定向连接，D正确。
7.科研人员将目的基因 与质粒构
建基因表达载体，该质粒的部分
结构如图所示，下列叙述错误的
是( )
注：、、、 表示引物。
A.除图中标出的结构外，质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、
限制酶切割位点等
B.与图中启动子结合的酶是 聚合酶
C.用检测基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是和
D.通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是 链
√
[解析] 图中有启动子和终止子，因此质粒
还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记
基因、复制原点等，A正确；启动子是 聚合酶识别和结合的部位，
能驱动基因转录出，B正确；进行 检测时，若仅用一对引物，
在该对引物的引导下，合成的片段应包括基因序列，且为了确定 基因
连接到质粒中的方向正确，应选择图甲中的引物和或与 ，C正
确；根据图中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的
模板链方向应该是端端，因此 链为转录的模板，D错误。
8.[2024·山东昌乐一中月考]经研究发现， 基因位于某种环
状分子中。将 基因导入马铃薯,使之表达即可获得抗
病毒的马铃薯。下图表示构建基因表达载体的过程，相关酶切位
点如表所示。下列说法错误的是( )
______________________ _______________________ _______________________ ____________________
A.推测酶的功能与 聚合酶类似
B.由步骤③获取的目的基因有1个黏性末端
C.步骤④应选用的限制酶是Ⅰ和 Ⅰ
D. Ⅱ基因可能是用于筛选的标记基因
√
[解析] 由图可知，步骤②中用 酶处理后，黏性末端变成平末
端，说明酶可以将单链补全成双链，推测 酶的功
能与 聚合酶类似，A正确；据图示可知，由步骤③获取的目的基
因一端为平末端，一端为黏性末端，B正确；由于目的基因只有一个
黏性末端，质粒是顺时针转录，且步骤③是用 Ⅰ酶处理获取的
目的基因，使用Ⅰ和 Ⅰ切割会导致目的基因反向插入质粒中，
无法转录,而 Ⅱ与 Ⅰ切出的黏性末端相同，故步骤④中选用
的限制酶应是Ⅱ和 Ⅰ，C错误；基因表达载体中除含有目的基
因、启动子和终止子等组件外,还应有标记基因，据图推测， Ⅱ
基因可能是用于筛选的标记基因，D正确。
9.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组
(见图丙)，限制性内切核酸酶的酶切位点分别是 Ⅱ
，Ⅰ和 Ⅰ
。下列分析合理的是( )
乙
丙
A.用 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用Ⅱ和 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用Ⅱ和 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用Ⅰ和 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体
√
[解析] 用 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生相同的黏性末
端，用连接酶连接时可能会发生反向连接，A错误；用 Ⅱ和
Ⅰ切割目的基因会产生两种 片段，一种含有目的基因，一种
不含目的基因，且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连
接，B错误；用Ⅱ和 Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体，会产
生相同的黏性末端，可能会发生反向连接，C错误；只有用 Ⅰ和
Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体，产生不同的黏性末端，防止
发生反向连接，且这样目的基因插入载体后， 聚合酶的移动方
向与图丙实线方向相同，D正确。
10.[2024·福建南安侨光中学月考]
在构建基因表达载体时，传统方
法常受限于限制酶识别序列。科
研人员研发了新的 重组方法:
技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末
端相同的序列 (即同源序列)，然后用 酶处理，使同源序
列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组
序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A.推测 酶的作用是识
别同源序列、形成黏性末端、连
接磷酸二酯键
B.载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及
自身环化
C.形成重组质粒时，如果温度远高于 ，黏性末端的碱基不容
易互补配对
D.该技术无须识别特定切割位点，需识别目的基因与线性质粒同源
序列
√
[解析] 用 酶处理，使同源序
列形成黏性末端，最终形成的重组质粒
会在受体细胞内形成完整的重组序列，
推测 酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，不具有连接
磷酸二酯键的作用，A错误；载体A端和B端的序列不同，可防止目的基
因与质粒反向连接及自身环化，B正确；重组质粒形成时如果温度远高
于 ，氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C正确；
结合题图可知，该技术无须识别特定切割位点，用 酶处理，
使同源序列形成黏性末端，故需识别目的基因与线性质粒同源序列，D
正确。
11.拟南芥受干旱诱导会表达抗旱基因, 基因过量表达的转
基因拟南芥在脱落酸的处理下，气孔开度减小，气孔关闭速度加快。
科研人员将 基因导入小麦细胞中，以期获得抗旱能力强的转基
因小麦,回答下列问题:
(1)如图表示利用技术扩增 基因的过程,A、B、C、D表示引
物,扩增 基因时应选用的引物是______，理由是_____________
_________________________。
B和C
聚合酶只能从引物的端延伸链
[解析] 聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的 端，即从引物的
端延伸链，因此引物应与目的基因的模板链的 端结合，然后
沿着端 端的方向来合成子链，所以要选择引物B和C。
(2)构建抗旱转基因小麦的关键是____________________。要保证重
组质粒能在受体细胞中稳定存在并发挥作用， 基因的首端要有
________，其功能：_________________________________________
___，除此之外,为了便于重组质粒的筛选和鉴定,重组质粒上还应有
__________。
基因表达载体的构建
启动子
是聚合酶识别并结合的部位，启动转录过程
标记基因
[解析] 构建抗旱转基因小麦的关键是基因表达载体的构建。在重组
质粒中，目的基因首端要有启动子，以便于结合 聚合酶，启动
转录过程。重组质粒上还应该具有标记基因，其作用是筛选成功导
入重组质粒的受体细胞。第2课时 基因表达载体的构建
【预习梳理】
1.受体细胞中稳定存在 表达和发挥作用
2.启动子 终止子 标记基因
3.限制酶 同种限制酶 能产生相同末端 DNA连接酶
【任务活动】
任务
[情境]
(1)启动子 RNA聚合酶识别和结合 转录出mRNA
(2)转录 有特殊序列结构的DNA片段
(3)鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来
(4)A—T (5)启动子和终止子
[资料]
(1)限制酶和DNA连接酶 (2)不一定 相同
(3)目的基因或质粒的自身环化、目的基因不能定向连接
反馈评价
例1 C [解析] 构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用,A正确;质粒上的标记基因有的是其本身固有的,有的是人为加上去的,B正确;一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、启动子和终止子等结构,C错误;基因表达载体中的复制原点是质粒DNA复制的起点,没有复制原点,质粒DNA就不能复制,D正确。
例2 B [解析] 目的基因两侧都有限制酶EcoRⅠ的酶切位点,且质粒也含有限制酶EcoRⅠ的酶切位点,所以在基因工程中若只用一种限制酶完成对图示质粒和外源DNA的切割,可选EcoRⅠ,A正确;如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcoRⅠ酶切位点有2个,B错误;为了防止目的基因自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和Hind Ⅲ两种限制酶同时处理,C正确;一个如图甲所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后,产生两个黏性末端,含有2个游离的磷酸基团,D正确。
【当堂自测】
1.(1)√ (2)√ (3)× (4)√ (5)× (6)×
[解析] (3)终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停下来。
(5)启动子、终止子与目的基因转录的起始和终止有关,而与其复制无关。
(6)启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA。
2.A [解析] 限制酶Ⅰ的识别序列和切点是↓ —GGATCC—,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是↓ —GATC—,可知限制酶Ⅱ能够识别和切割限制酶Ⅰ的识别序列;目的基因的右端是限制酶Ⅱ的识别序列和切点,目的基因左端是限制酶Ⅰ的识别序列和切点,故只有用限制酶Ⅱ才能将目的基因切割下来。质粒有GeneⅠ和GeneⅡ两种标记基因,分别有限制酶Ⅱ的识别序列和限制酶Ⅰ的识别序列。如果用限制酶Ⅱ切割,则GeneⅠ和GeneⅡ都被破坏,造成重组质粒无标记基因。用限制酶Ⅰ切割,则会破坏GeneⅡ,保留完整GeneⅠ,其黏性末端和切割目的基因产生的黏性末端相同,可以连接形成重组DNA,A正确。
3.C [解析] ①②③④均为限制酶,可催化磷酸二酯键的断裂,不能催化氢键的断裂,且均形成黏性末端,A错误;①切出的 DNA 片段带有黏性末端,用 E.coliDNA连接酶和T4 DNA连接酶均能连接起来,B错误;②③切出的黏性末端相同,用DNA连接酶连接后形成的片段的碱基序列为—GGATCT——CCTAGA—,因而不能再被②或③识别切割,C正确;构建基因表达载体时,用②③进行双酶切,不能防止目的基因与载体的反向连接,因为这两种限制酶切出的黏性末端是相同的,D错误。
4.C [解析] 用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA片段后,目的基因可能会反向连接到质粒上,因此目的基因表达的产物可能不相同,A正确;若单独使用SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段,会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因,使含有目的基因的受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长,B正确;若选择使用BamHⅠ和SmaⅠ切割质粒和含目的基因的DNA片段,重组质粒上含有正常的四环素抗性基因,能在含四环素的培养基中生长的受体菌有可能获得了重组质粒,也有可能获得了普通质粒,C错误;含目的基因的DNA片段上没有BclⅠ的识别序列,不能使用BclⅠ切割含目的基因的DNA片段,但Sau3AⅠ切割DNA后产生的黏性末端与BclⅠ的相同,故若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒,则需用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA片段,D正确。第2课时 基因表达载体的构建
基因表达载体的构建——转基因的核心工作
1.构建目的:使目的基因在
,并且遗传给下一代,同时使目的基因能够 。
2.基因表达载体的组成: 、目的基因、 、 等。
3.构建过程
用一定的 切割载体,使它出现一个切口
↓
用 或 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段
↓
利用 将目的基因片段拼接到载体的切口处
任务基因表达载体的构建
【情境】如图为一个基因表达载体的示意图。
(1)图中X表示的片段是 ,位于基因的上游,是 的部位,驱动基因 。
(2)终止子使 在需要的地方停下来,位于基因的下游。启动子、终止子本质上是一段 片段。
(3)标记基因的作用是 。
(4)复制原点是DNA复制的起始位点。该片段中 碱基对较多,氢键数量相对较少,不稳定,DNA容易解旋。
(5)目的基因要添加在 之间才能被转录。
【资料】阅读教材第80页“基因表达载体构建模式图”。
(1)构建基因表达载体时需要使用的工具酶为 。
(2)切割目的基因和质粒的限制酶 (填“一定”或“不一定”)相同,但要确保切割后产生的末端 (填“相同”或“不相同”)。
(3)一般来说,构建基因表达载体时,常用两种不同的限制酶对质粒和含目的基因的DNA进行切割,原因是如果用同种限制酶切割,会导致 等问题。
例1基因表达载体的构建是基因工程的核心步骤,是成功的关键,下列相关说法不正确的是()
A.构建基因表达载体的目的包括使目的基因在受体细胞中能稳定存在且遗传给下一代
B.基因工程中使用的标记基因有许多种,有的标记基因是质粒上固有的
C.一个基因表达载体一般包括目的基因、标记基因、起始密码子和终止密码子等结构
D.基因表达载体中的复制原点是质粒DNA的复制的起点
[题后归纳]启动子、终止子、起始密码子、终止密码子的比较
启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 位于DNA分子上 位于mRNA上
作用 启动转录 终止转录 翻译的起点 翻译的终点
例2[2024·山东菏泽一中月考]图甲为某种质粒简图,图乙表示某外源DNA上的目的基因,小箭头所指分别为限制性内切核酸酶EcoRⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ的酶切位点。下列有关叙述错误的是()
A.在基因工程中若只用一种限制酶完成对质粒和外源DNA的切割,则可选EcoRⅠ
B.如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后,再用DNA连接酶连接,形成一个含有目的基因的重组DNA,此重组DNA中EcoRⅠ酶切位点有1个
C.为了防止目的基因自身环化,酶切时可使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理
D.一个如图甲所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后,含有2个游离的磷酸基团
1.正误辨析
(1)基因表达载体能协助目的基因在受体细胞中复制。()
(2)基因表达载体的构建至少需要两种工具酶。()
(3)终止子相当于一盏红色信号灯,使翻译在所需要的地方停下来。()
(4)载体上常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。()
(5)目的基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。()
(6)启动子位于基因的上游,是DNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。()
2.[2024·北京海淀区期中]基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,以便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是↓—GGATCC—;限制酶Ⅱ的识别序列和切点是↓—GATC—。据图判断,下列操作正确的是()
A.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
B.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
C.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
3.[2024·福建厦门期末]下表为四种限制酶所识别的核苷酸序列及相应的切割位置(箭头所指),下列叙述正确的是()
限制酶种类 序列及切点
①EcoRⅠ ↓5'—GAATTC—3' 3'—CTTAAG—5'↑
②BamHⅠ ↓5'—GGATCC—3' 3'—CCTAGG—5'↑
③BglⅡ ↓5'—AGATCT—3' 3'—TCTAGA—5'↑
④NotⅠ ↓5'—GCGGCCGC—3' 3'—CGCCGGCG—5'↑
A.①②③④均可催化磷酸二酯键和氢键断裂,形成黏性末端
B.①切出的DNA片段,只有用E.coliDNA连接酶才能连接起来
C.②③切出的末端连接后形成的片段,不能再被②或③识别切割
D.构建基因表达载体时,用②③进行双酶切,可防止目的基因与载体的反向连接
4.[2024·云南保山期末]下图分别表示某种质粒和含目的基因的DNA片段,利用相关工具酶将二者构建成基因表达载体并导入受体菌。下列为几种可供使用的限制酶识别序列及其切割位点。
EcoRⅠ:↓—GAATTC—;BamHⅠ:↓—GGATCC—;
BclⅠ:↓—TGATCA—;Sau3AⅠ:↓—GATC—;
SmaⅠ:↓—CCCGGG—。
注:Tetr表示四环素抗性基因;AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
下列关于构建基因表达载体时限制酶的选择及其相关叙述,错误的是()
A.若单独使用SmaⅠ,则目的基因表达的产物可能不相同
B.若单独使用SmaⅠ,则含有目的基因的受体菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长
C.若选择使用BamHⅠ和SmaⅠ,能在含四环素的培养基中生长的受体菌一定含有目的基因
D.若用EcoRⅠ和BclⅠ切割质粒,则需用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割含目的基因的DNA第2课时 基因表达载体的构建
1.B [解析] 构建基因表达载体时需要用限制酶对含目的基因的DNA片段和载体进行切割,然后用DNA连接酶进行连接,A正确;构建基因表达载体是在细胞外进行的,B错误;抗生素抗性基因可以作为标记基因,C正确;启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于目的基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA,D正确。
2.A [解析] 载体不能防止目的基因被受体细胞中的限制酶“切割”,A错误;基因表达载体中有复制原点,目的基因会随着载体的复制而复制,B正确;基因的表达过程包括转录和翻译,基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶的识别和结合位点,能控制转录的开始,而终止子控制着转录的结束,C正确;载体具有标记基因,便于重组DNA分子的鉴定和筛选,D正确。
3.C [解析] 不同的目的基因可能在不同的细胞中特异性表达,所以不同的目的基因所需的启动子不一定相同,A正确;启动子是DNA上一段特殊的序列,是RNA聚合酶识别和结合的部位,B正确;终止子位于目的基因的尾端,能够终止转录,C错误;基因表达载体包含复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因等,其中启动子和终止子与基因的表达直接相关,标记基因用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因,D正确。
4.C [解析] 目的基因两端的黏性末端不同,被切开的质粒两端的黏性末端也不同,可以避免目的基因与载体反向连接,还能避免目的基因和载体的自身环化,A正确;两种限制酶的识别序列不同,若是切割后产生相同的黏性末端,也可能出现目的基因和质粒的反向连接,B正确;每个正确连接的基因表达载体的构建伴随四个磷酸二酯键的形成,C错误;构建基因表达载体时,要保证目的基因、启动子、终止子等关键组件结构的完整性,故获取目的基因和载体时可能需要用到三种或者四种限制酶,D正确。
5.D [解析] 用酶4切割会破坏抗生素抗性基因,且用单一酶切割会出现质粒和目的基因自身环化、目的基因反向连接,A错误;质粒和目的基因需要用相同的酶切割或者用不同的酶切割但是产生的黏性末端相同,而酶1和酶3切割产生的末端不同,B错误;酶2和酶4切割后得到的DNA片段,连接后不能被酶2和酶4识别,C错误;质粒用酶3切割后得到平末端,不利于连接,用酶4切割质粒和目的基因,会破坏质粒上的抗生素抗性基因,不便于筛选,所以质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端,用T4 DNA连接酶连接,能保证目的基因在质粒上的连接方向正确,此重组表达载体的构建方案最合理且高效,D正确。
6.D [解析] 基因表达载体A上有一个EcoRⅠ的酶切位点,因此,用EcoRⅠ切割基因表达载体A(重组质粒)可产生1个DNA片段,A错误;用BamHⅠ切割图乙中的质粒只能形成一个线性DNA分子,会产生2个游离的磷酸基团,B错误;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位并起到驱动转录的作用,而起始氨基酸由mRNA上的起始密码子决定,C错误;同时用BamHⅠ和HindⅢ切割图甲中的DNA片段和图乙质粒,而后用DNA连接酶处理,可以使目的基因和质粒发生定向连接,D正确。
7.D [解析] 图中有启动子和终止子,因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、复制原点等,A正确;启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,B正确;进行PCR检测时,若仅用一对引物,在该对引物的引导下,合成的片段应包括J基因序列,且为了确定J基因连接到质粒中的方向正确,应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2,C正确;根据图中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3'端→5'端,因此a链为转录的模板,D错误。
8.C [解析] 由图可知,步骤②中用Klenow酶处理后,黏性末端变成平末端,说明Klenow酶可以将DNA单链补全成双链,推测Klenow酶的功能与DNA聚合酶类似,A正确;据图示可知,由步骤③获取的目的基因一端为平末端,一端为黏性末端,B正确;由于目的基因只有一个黏性末端,质粒是顺时针转录,且步骤③是用BamHⅠ酶处理获取的目的基因,使用BamHⅠ和SmaⅠ切割会导致目的基因反向插入质粒中,无法转录,而Bgl Ⅱ与BamHⅠ切出的黏性末端相同,故步骤④中选用的限制酶应是BglⅡ和SmaⅠ,C错误;基因表达载体中除含有目的基因、启动子和终止子等组件外,还应有标记基因,据图推测,NPTⅡ基因可能是用于筛选的标记基因,D正确。
9.D [解析] 用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,产生相同的黏性末端,用DNA连接酶连接时可能会发生反向连接,A错误;用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因会产生两种DNA片段,一种含有目的基因,一种不含目的基因,且有目的基因的片段与载体结合时容易发生反向连接,B错误;用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,会产生相同的黏性末端,可能会发生反向连接,C错误;只有用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体,产生不同的黏性末端,防止发生反向连接,且这样目的基因插入载体后,RNA聚合酶的移动方向与图丙实线方向相同,D正确。
10.A [解析] 用In-Fusion酶处理,使同源序列形成黏性末端,最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列,推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端,不具有连接磷酸二酯键的作用,A错误;载体A端和B端的序列不同,可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化,B正确;重组质粒形成时如果温度远高于50 ℃,氢键不容易形成,黏性末端的碱基不容易互补配对,C正确;结合题图可知,该技术无须识别特定切割位点,用In-Fusion酶处理,使同源序列形成黏性末端,故需识别目的基因与线性质粒同源序列,D正确。
11.(1)B和C DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
(2)基因表达载体的构建 启动子 是RNA聚合酶识别并结合的部位,启动转录过程 标记基因
[解析] (1)DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加到引物的3'端,即从引物的3'端延伸DNA链,因此引物应与目的基因的模板链的3'端结合,然后沿着5'端→3'端的方向来合成子链,所以要选择引物B和C。(2)构建抗旱转基因小麦的关键是基因表达载体的构建。在重组质粒中,目的基因首端要有启动子,以便于结合RNA聚合酶,启动转录过程。重组质粒上还应该具有标记基因,其作用是筛选成功导入重组质粒的受体细胞。第2课时 基因表达载体的构建
1.下列关于基因表达载体构建的叙述,不正确的是()
A.需要限制酶和DNA连接酶
B.必须在细胞内进行
C.抗生素抗性基因可作为标记基因
D.启动子位于目的基因的上游
2.[2024·北京四中期中]基因工程的核心是构建表达载体,下列不属于载体作用的是()
A.防止目的基因被受体细胞中的限制酶“切割”
B.能协助目的基因在受体细胞中复制
C.含有启动子和终止子协助目的基因表达
D.具有标记基因,便于筛选含重组DNA的受体细胞
3.基因工程中要使目的基因在受体细胞中稳定存在并能够表达和发挥作用,需要构建基因表达载体,下列关于基因表达载体的说法不正确的是()
A.不同的目的基因所需的启动子不一定相同
B.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
C.终止子位于目的基因的尾端,能够终止翻译
D.基因表达载体包含复制原点、启动子、目的基因、终止子、标记基因等
4.[2024·山东滨州联考]构建基因表达载体过程中,为保证目的基因与质粒正确连接一般选用两种限制酶,下列说法错误的是()
A.选择的原则之一是酶切后目的基因两端的黏性末端不同,质粒两端的黏性末端也不同
B.两种限制酶的识别序列不同也可能出现目的基因和质粒的反向连接
C.每个正确连接的基因表达载体的构建伴随两个磷酸二酯键的形成
D.为避免破坏目的基因等关键组件的结构,可能会用到三种或四种限制酶
5.[2024·湖南邵阳三模]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。下列分析合理的是()
A.质粒和目的基因都用酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接
C.可选择酶2切割质粒、酶4切割目的基因,再用E.coliDNA连接酶连接,连接后的片段仍能被酶2和酶4切割
D.为了让重组表达载体的构建合理高效,可用酶1和酶2切割质粒和目的基因,再用T4DNA连接酶连接
6.[2024·福建南平期末]vip基因是一种抗虫基因。图甲是含有vip基因的DNA片段,将vip基因与图乙中的质粒构建基因表达载体A,EcoRⅠ、BamHⅠ和HindⅢ产生的黏性末端不同。下列相关叙述正确的是()
A.用EcoRⅠ切割基因表达载体A可产生2个DNA片段
B.用BamHⅠ切割图乙中的质粒产生4个游离的磷酸基团
C.启动子是RNA聚合酶识别的部位并编码起始氨基酸
D.可同时用BamHⅠ和HindⅢ切割图甲中的DNA片段和图乙质粒
7.科研人员将目的基因J与质粒构建基因表达载体,该质粒的部分结构如图所示,下列叙述错误的是()
注:F1、F2、R1、R2表示引物。
A.除图中标出的结构外,质粒还需具备的结构有复制原点、标记基因、限制酶切割位点等
B.与图中启动子结合的酶是RNA聚合酶
C.用PCR检测J基因连接到质粒中且方向正确可选用的一对引物是F1和R2
D.通过启动子的位置和引物的方向可判断该融合基因转录的模板是b链
8.[2024·山东昌乐一中月考]经研究发现,PVY-CP基因位于某种环状DNA分子中。将PVY-CP基因导入马铃薯,使之表达即可获得抗PVY病毒的马铃薯。下图表示构建基因表达载体的过程,相关酶切位点如表所示。下列说法错误的是()
BamHⅠ HindⅢ BglⅡ SmaⅠ
↓GGATCC CCTAGG↑ ↓AAGCTT TTCGAA↑ ↓AGATCT TCTAGA↑ ↓CCCGGG GGGCCC↑
A.推测Klenow酶的功能与DNA聚合酶类似
B.由步骤③获取的目的基因有1个黏性末端
C.步骤④应选用的限制酶是BamHⅠ和SmaⅠ
D.NPTⅡ基因可能是用于筛选的标记基因
9.若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙),限制性内切核酸酶的酶切位点分别是BglⅡ(↓—AGATCT—),EcoRⅠ(↓—GAATTC—)和Sau3AⅠ(↓—GATC—)。下列分析合理的是()
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
10.[2024·福建南安侨光中学月考]在构建基因表达载体时,传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法:In-Fusion技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列),然后用In-Fusion酶处理,使同源序列形成黏性末端,最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如图所示。下列叙述错误的是()
A.推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B.载体A端和B端的序列不同,可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C.形成重组质粒时,如果温度远高于50℃,黏性末端的碱基不容易互补配对
D.该技术无须识别特定切割位点,需识别目的基因与线性质粒同源序列
11.拟南芥受干旱诱导会表达AtMY抗旱基因,AtMY基因过量表达的转基因拟南芥在脱落酸的处理下,气孔开度减小,气孔关闭速度加快。科研人员将AtMY基因导入小麦细胞中,以期获得抗旱能力强的转基因小麦,回答下列问题:
(1)如图表示利用PCR技术扩增AtMY基因的过程,A、B、C、D表示引物,扩增AtMY基因时应选用的引物是 ,理由是 。
(2)构建抗旱转基因小麦的关键是 。要保证重组质粒能在受体细胞中稳定存在并发挥作用,AtMY基因的首端要有 ,其功能: ,除此之外,为了便于重组质粒的筛选和鉴定,重组质粒上还应有 。
