3.2.2《基因工程的基本操作程序-GFP基因表达载体的构建》教学课件(共22张PPT1个视频)-人教版高中生物（2019）选择性必修三
文档属性
| 名称 | 3.2.2《基因工程的基本操作程序-GFP基因表达载体的构建》教学课件(共22张PPT1个视频)-人教版高中生物（2019）选择性必修三 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 20.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-10-16 10:51:49 | ||
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文档简介
(共22张PPT)
“荧光大肠杆菌”的诞生日记
生物 高三年级上学期
单元主题：基因工程
“荧光大肠杆菌”的诞生日记
主线任务：GFP基因表达载体的构建
“荧光大肠杆菌” 的诞生日记
GFP基因表达载体的构建
1.作用：
将外源基因“送入” 受体细胞, 并对目的基因进行大量复制。
2.种类：
质粒
噬菌体、
动植物病毒等
(最常用)、
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的 。
自我复制
环状双链DNA分子
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
工具一：基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
GFP基因表达载体的构建
工具一：基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
启动子：
复制原点：
终止子：
标记基因：
基因的上游
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ
基因的下游
终止转录
便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
DNA复制的起始位点。
多克隆位点
Xho Ⅰ
BamH Ⅰ
Bgl Ⅰ
位置：
功能：
位置：
功能：
GFP基因表达载体的构建
3. 作用特点：
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,
并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化出来的
2. 种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
简称限制酶
识别的专一性
切割的专一性
一般为6个核苷酸；少数为4个、8个或其他数量。
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
赫伯特·韦恩·伯耶
1968年，美国科学家伯耶和研究小组成员在一位年轻生物化学家古德曼（HowardGoodman）的帮助下，从大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一种限制酶，根据命名原则称为EcoRⅠ。
资料卡
限制酶EcoRⅠ的由来
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoRⅠ 的识别序列
C
G
A
A
3
5
T
G
5
C
T
T
3
A
A
T
简图：
识别序列的特点:
两条单链从5 —3 的碱基排列顺序是一样的，即回文序列。
切割位点
切割位点
G
CTTAA
5
3
3
5
AATTC
G
粘性末端
粘性末端
粘性末端
粘性末端
GFP基因表达载体的构建
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Bgl Ⅰ
SmaⅠ
GGATCC
CCTAGG
5
3
3
5
AAGCTT
TTCGAA
5
3
3
5
AGATCT
TCTAGA
5
3
3
5
CCCGGG
GGGCCC
5
3
3
5
思考：1、不同限制酶的切割位点有什么特点？切出的末端类型分别是什么？
②在中轴线上
①在中轴线两侧
2、不同的限制酶切出的粘性末端一定是不同的吗？
：粘性末端
：平末端
有可能相同，如BamH Ⅰ和Bgl Ⅰ，二者互为同尾酶
3、不同的限制酶切出的粘性末端可以通过碱基互补配对相连接吗？
同尾酶可以。只要是粘性末端相同，就可以碱基互补配对相连接！
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
复制原点
卡那霉素抗性基因
终止子
启动子
选择启动子和终止子之间多克隆位点上（MCS）的限制酶，且在载体的其他位点无该酶的识别序列。
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
pET-28a(+)
载体
ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA
TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT
3
5
GFP基因
5
3
引物1
引物2
EcoRⅠ
EcoRⅠ
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
GPSSS
GFP基因
EcoRⅠ酶切
ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA
TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT
3
5
GFP基因
5
3
GAATTC
GAATTC
CCTAAG
CCTAAG
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
GFP基因
重组DNA分子
GFP基因表达载体的构建
工具三：DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
1、作用：
2、种类：
类型 E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
功能 缝合_________和_______ 黏性末端
平末端
（效率低）
DNA连接酶
缓冲液
GFP基因表达载体的构建
活动要求：用剪刀模拟限制酶EcoRⅠ ，分别对GFP基因和载体分别进行切割,然后用胶带模拟DNA连接酶对酶切后的DNA片段进行连接。在该连接反应体系中，若只考虑两两连接的情况下，可能有哪些连接方式？
模拟实验
连接反应体系
载体
DNA连接酶
限制酶EcoR Ⅰ
GFP基因
GFP基因表达载体的构建
正向连接：
反向连接：
解决办法：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
问题：如何防止质粒和目的基因的自身环化和反向连接？
使用一种限制酶进行切割（单酶切）可能出现的连接类型
自连
两两连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
（自身环化）
√
×
×
×
×
×
DNA连接酶
缓冲液
连接反应体系
GFP基因表达载体的构建
GFP基因表达载体的构建
②不能破坏要插入的目的基因
①选择启动子和终止子之间多克隆位点上（MCS）的限制酶，且在载体的其他位点无该酶的识别序列。
③尽量选择两种不同的限制酶同时对载体和目的基因进行双酶切
限制酶的选择原则
任务进阶
卡那霉素抗性基因
复制原点
终止子
启动子
EcoR Ⅰ
Bgl Ⅰ
Xbal Ⅰ
Hind Ⅲ
Spe Ⅰ
BamH Ⅰ
Spe Ⅰ
EcoR Ⅰ
Bgl Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Xbal Ⅰ
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Bgl Ⅰ Xbal Ⅰ Spe Ⅰ
识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
目的基因
请选择最合适的限制酶对载体和目的基因进行酶切，构建基因表达载体。并说明你的理由。
转录方向
HAPPY ENDING!
“荧光大肠杆菌”的诞生日记
生物 高三年级上学期
单元主题：基因工程
“荧光大肠杆菌”的诞生日记
主线任务：GFP基因表达载体的构建
“荧光大肠杆菌” 的诞生日记
GFP基因表达载体的构建
1.作用：
将外源基因“送入” 受体细胞, 并对目的基因进行大量复制。
2.种类：
质粒
噬菌体、
动植物病毒等
(最常用)、
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有 能力的 。
自我复制
环状双链DNA分子
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
工具一：基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
GFP基因表达载体的构建
工具一：基因导入受体细胞的载体——“分子运输车”
启动子：
复制原点：
终止子：
标记基因：
基因的上游
RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。
EcoR Ⅰ
Hind Ⅲ
基因的下游
终止转录
便于重组DNA分子的筛选和鉴定。
DNA复制的起始位点。
多克隆位点
Xho Ⅰ
BamH Ⅰ
Bgl Ⅰ
位置：
功能：
位置：
功能：
GFP基因表达载体的构建
3. 作用特点：
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,
并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
1. 来源：
主要从原核生物中分离纯化出来的
2. 种类：
数千种
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
简称限制酶
识别的专一性
切割的专一性
一般为6个核苷酸；少数为4个、8个或其他数量。
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
赫伯特·韦恩·伯耶
1968年，美国科学家伯耶和研究小组成员在一位年轻生物化学家古德曼（HowardGoodman）的帮助下，从大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一种限制酶，根据命名原则称为EcoRⅠ。
资料卡
限制酶EcoRⅠ的由来
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
EcoRⅠ 的识别序列
C
G
A
A
3
5
T
G
5
C
T
T
3
A
A
T
简图：
识别序列的特点:
两条单链从5 —3 的碱基排列顺序是一样的，即回文序列。
切割位点
切割位点
G
CTTAA
5
3
3
5
AATTC
G
粘性末端
粘性末端
粘性末端
粘性末端
GFP基因表达载体的构建
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Bgl Ⅰ
SmaⅠ
GGATCC
CCTAGG
5
3
3
5
AAGCTT
TTCGAA
5
3
3
5
AGATCT
TCTAGA
5
3
3
5
CCCGGG
GGGCCC
5
3
3
5
思考：1、不同限制酶的切割位点有什么特点？切出的末端类型分别是什么？
②在中轴线上
①在中轴线两侧
2、不同的限制酶切出的粘性末端一定是不同的吗？
：粘性末端
：平末端
有可能相同，如BamH Ⅰ和Bgl Ⅰ，二者互为同尾酶
3、不同的限制酶切出的粘性末端可以通过碱基互补配对相连接吗？
同尾酶可以。只要是粘性末端相同，就可以碱基互补配对相连接！
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
复制原点
卡那霉素抗性基因
终止子
启动子
选择启动子和终止子之间多克隆位点上（MCS）的限制酶，且在载体的其他位点无该酶的识别序列。
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
pET-28a(+)
载体
ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA
TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT
3
5
GFP基因
5
3
引物1
引物2
EcoRⅠ
EcoRⅠ
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
GPSSS
GFP基因
EcoRⅠ酶切
ATG…....GATCCATATGTTACGTTATA …......TAA
TAC…….CTAGGTATACAATGCAATAT….......ATT
3
5
GFP基因
5
3
GAATTC
GAATTC
CCTAAG
CCTAAG
GFP基因表达载体的构建
工具二：限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
GFP基因
重组DNA分子
GFP基因表达载体的构建
工具三：DNA连接酶——“分子缝合针”
将双链 DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 。
1、作用：
2、种类：
类型 E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源 大肠杆菌
T4噬菌体
功能 缝合_________和_______ 黏性末端
平末端
（效率低）
DNA连接酶
缓冲液
GFP基因表达载体的构建
活动要求：用剪刀模拟限制酶EcoRⅠ ，分别对GFP基因和载体分别进行切割,然后用胶带模拟DNA连接酶对酶切后的DNA片段进行连接。在该连接反应体系中，若只考虑两两连接的情况下，可能有哪些连接方式？
模拟实验
连接反应体系
载体
DNA连接酶
限制酶EcoR Ⅰ
GFP基因
GFP基因表达载体的构建
正向连接：
反向连接：
解决办法：选择两种不同的限制酶同时对目的基因和质粒切割
问题：如何防止质粒和目的基因的自身环化和反向连接？
使用一种限制酶进行切割（单酶切）可能出现的连接类型
自连
两两连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
（自身环化）
√
×
×
×
×
×
DNA连接酶
缓冲液
连接反应体系
GFP基因表达载体的构建
GFP基因表达载体的构建
②不能破坏要插入的目的基因
①选择启动子和终止子之间多克隆位点上（MCS）的限制酶，且在载体的其他位点无该酶的识别序列。
③尽量选择两种不同的限制酶同时对载体和目的基因进行双酶切
限制酶的选择原则
任务进阶
卡那霉素抗性基因
复制原点
终止子
启动子
EcoR Ⅰ
Bgl Ⅰ
Xbal Ⅰ
Hind Ⅲ
Spe Ⅰ
BamH Ⅰ
Spe Ⅰ
EcoR Ⅰ
Bgl Ⅰ
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Xbal Ⅰ
限制酶 EcoR Ⅰ BamH Ⅰ Hind Ⅲ Bgl Ⅰ Xbal Ⅰ Spe Ⅰ
识别序列及切割位点
注：箭头表示切割位点
目的基因
请选择最合适的限制酶对载体和目的基因进行酶切，构建基因表达载体。并说明你的理由。
转录方向
HAPPY ENDING!