3.2基因工程的基本操作程序 课件(共62张PPT1个视频)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3
文档属性
| 名称 | 3.2基因工程的基本操作程序 课件(共62张PPT1个视频)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 127.0MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-11-06 22:34:07 | ||
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文档简介
(共62张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
讨论：
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
培育转基因抗虫棉的简要过程
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
一、基因工程的基本操作程序
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、重组载体的构建、重组载体的导入和筛选、目的基因的检测与鉴定。
1.目的基因的筛选与获取
4.目的基因的检测与鉴定
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
1.目的基因概念
在基因工程的设计和操作中，用于_______________或______________等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_______________。
2.实例
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质的基因
二、目的基因的筛选与获取
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
3.基因结构：
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
原核生物基因
终止子：终止转录
补充知识：基因的结构
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
加 工
转 录
mRNA前体
成熟mRNA
真核细胞的基因
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
补充知识：基因的结构
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
注意
1、非编码序列：
包括非编码区和内含子
2、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因
结构一样长吗？
思考
2.筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
二、目的基因的筛选与获取
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）
等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提
供了更多的机会和可能。
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
实例：
思考：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
二、目的基因的筛选与获取
3.目的基因获取的方法
(1)从生物组织中直接获取
将提取的 DNA进行“霰弹射击"，即用限制性内切核酸酶将完整的 DNA分子随机切割成适当长度的片段，然后把这些片段连接到合适的载体上，通过载体转人不同的受体细胞中，当外源DNA随载体的复制而复制后，目的基因就在受体细胞中完成了增殖。再采取合适的方法，对含有外源DNA片段的受体细胞进行检测，找出所需的目的基因。
(2)从基因文库中获取目的基因
基因组文库：基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。
3.目的基因获取的方法
(1)从生物组织中直接获取
二、目的基因的筛选与获取
基因组文库和cDNA文库区别
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间基因交流 可以 部分可以
二、目的基因的筛选与获取
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
3.目的基因获取的方法
（1）从生物组织中直接获取
一种是反转录法(它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。），另一种方法是化学合成法（即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推导出其碱基序列，然后直接合成目的基因）。
二、目的基因的筛选与获取
DNA合成仪
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
推测
推测
合成
（4）利用PCR技术扩增目的基因
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
3.目的基因获取的方法
（1）从生物组织中直接获取
二、目的基因的筛选与获取
PCR扩增仪
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
利用PCR获取和扩增目的基因
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
二、目的基因的筛选与获取
体内DNA复制要点回顾
条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
利用PCR获取和扩增目的基因
二、目的基因的筛选与获取
二、目的基因的筛选与获取
利用PCR技术扩增目的基因
（1）DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（在体外用高温代替） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的原料
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸
（2）扩增所需的条件
模板（目的基因）、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
过程：
目的基因DNA________后_______，____与单链相应________结合；然后以_______为模板在________作用下进行_____，即将4种_________加到__________，如此___________。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
受热变性
解为单链
引物
延伸
互补序列
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
重复循环多次
变性
复性
延伸
二、目的基因的筛选与获取
二、目的基因的筛选与获取
（3）扩增的过程
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物和DNA聚合酶
过程：变性→复性→延伸
（3）扩增的过程——演示图
二、目的基因的筛选与获取
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5.结果
呈___________（ n次扩增循环后，DNA数量约为___）
*为什么呈指数形式扩增？
___________________________________________
___________________________________________
指数形式扩增
2n
一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍
思考：
1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？
2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？
3.延伸过程是否需要ATP供能？
4.PCR为什么需要引物？
氢键
不需要酶，需要90℃以上的高温
短单链核酸
3’端
不需要
由dNTP水解供能
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
旁栏思考题
1. 用PCR技术可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA链，形成双链DNA分子(图3-1)。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
1、目的：
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代。
三、基因表达载体的构建——基因工程的核心
①启动子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
终止子
抗生素抗性基因
复制原点
启动子
插入基因
基因表达载体模式图
三、基因表达载体的构建
思考1：表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
③标记基因：
一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，鉴别受体细胞中是否导入目的基因。
标记基因的作用：
用于对重组质粒（DNA）的鉴定和筛选
②终止子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。
终止子
抗生素抗性基因
复制原点
启动子
插入基因
基因表达载体模式图
三、基因表达载体的构建
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
注意：
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、基因表达载体的构建
一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接。
基因表达载体的构建过程
两个切口
获得目的基因
质粒
DNA分子
限制酶处理
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
GGATCCAAGCTTGGG
CCTAGGTTCGAACCC
CCCAAGCTT
GGGTTCGAA
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Xba Ⅰ
Sma Ⅰ
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
Bt基因
多
克
隆
位
点
动
子
启
终
子
止
标
R
记
基
因
Kan
复制
原点
问题：选用哪种限制酶同时切割Bt基因和pBI121？
5′
5′
3′
3′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Hind Ⅲ单酶切
DNA连接酶
5′
5′
5′
5′
Bt
Bt
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
G
CCTAG
Bt基因
双酶切优点：
利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化
大肠杆菌自身修复，比例很少
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
DNA连接酶
Bt基因
Bt基因
Bt
基因
5′
5′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1. 将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。（用于双子叶植物）
四、将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化步骤：
四、将目的基因导入受体细胞
2.花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
3.将目的基因导入动物细胞
方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
4.将目的基因导入微生物细胞
（1）微生物作受体细胞原因：
（2）常用法：
Ca2+处理
常用菌：
大肠杆菌
（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）
（3）过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
Ca2+
感受态细胞
吸收
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
课堂总结
显微注射法法
按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
如何判断？
1.分子检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
4
目的基因的检测与鉴定
在抗虫棉的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
DNA分子杂交技术
15N
DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增和分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
分子杂交技术
分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
原理：抗原抗体的特异性结合
目的基因的检测与鉴定
转Bt基因
非转基因
2.个体水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
目的基因的检测与鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
自主探究
1、实验原理
2、实验器材
3、实验步骤
4、实验结果
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
实验器材
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
实验步骤（PCR）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验步骤（电泳鉴定）
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
实验步骤（电泳鉴定）
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析
电泳实验
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
课堂练习
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。 （ ）
（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
普通大米（左）和“黄金大米”（右）
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN 12424的作用是______ 。
【答案】ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
【答案】不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
【提示】维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。
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第2节 基因工程的基本操作程序
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
讨论：
你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫，将该细菌的“杀虫基因”转到棉花里，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。
培育转基因抗虫棉的简要过程
提取
棉花细胞(含抗虫基因)
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
与运载体DNA拼接
导入
普通棉花(无抗虫特性)
棉花植株(有抗虫特性)
一、基因工程的基本操作程序
基因工程的一般操作程序主要包括四个步骤：目的基因的获取、重组载体的构建、重组载体的导入和筛选、目的基因的检测与鉴定。
1.目的基因的筛选与获取
4.目的基因的检测与鉴定
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
基因工程的基本操作程序
1.目的基因概念
在基因工程的设计和操作中，用于_______________或______________等的基因就是目的基因，根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指_______________。
2.实例
改变受体细胞性状
获得预期表达产物
编码蛋白质的基因
二、目的基因的筛选与获取
与生物抗逆性相关的基因（Bt抗虫基因）
与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因（胰岛素、干扰素基因）
与毒物降解相关的基因
与工业用酶相关的基因等
3.基因结构：
原核细胞的基因结构
真核细胞的基因结构
非编码区
非编码区
启动子：RNA聚合酶的识别和结合位点 开始转录
编码区
原核生物基因
终止子：终止转录
补充知识：基因的结构
非编码区
组成：编码区上游与编码区下游
功能：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
启动子：RNA聚合酶结合位点 转录起始的信号
终止子：终止RNA的合成
编码区：编码蛋白质的合成
加 工
转 录
mRNA前体
成熟mRNA
真核细胞的基因
非编码区
非编码区
编码区
与RNA聚合酶结合位点
外显子
内含子
1
2
3
4
5
启动子
终止子
补充知识：基因的结构
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
注意
1、非编码序列：
包括非编码区和内含子
2、编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因
结构一样长吗？
思考
2.筛选目的基因最有效的方法之一是从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
二、目的基因的筛选与获取
随着测序技术的发展，以及序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）
等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提
供了更多的机会和可能。
苏云金杆菌的杀虫作用于Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解
苏云金杆菌制剂可防治棉花虫害
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
实例：
思考：
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
二、目的基因的筛选与获取
3.目的基因获取的方法
(1)从生物组织中直接获取
将提取的 DNA进行“霰弹射击"，即用限制性内切核酸酶将完整的 DNA分子随机切割成适当长度的片段，然后把这些片段连接到合适的载体上，通过载体转人不同的受体细胞中，当外源DNA随载体的复制而复制后，目的基因就在受体细胞中完成了增殖。再采取合适的方法，对含有外源DNA片段的受体细胞进行检测，找出所需的目的基因。
(2)从基因文库中获取目的基因
基因组文库：基因文库就像一座图书馆，每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包含了一种生物所有的基因，那么，我们就可以说这个基因文库很大，就像国家图书馆，这种基因文库叫做基因组文库。
3.目的基因获取的方法
(1)从生物组织中直接获取
二、目的基因的筛选与获取
基因组文库和cDNA文库区别
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小 小 大
基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因
物种间基因交流 可以 部分可以
二、目的基因的筛选与获取
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
3.目的基因获取的方法
（1）从生物组织中直接获取
一种是反转录法(它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA。），另一种方法是化学合成法（即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推导出其碱基序列，然后直接合成目的基因）。
二、目的基因的筛选与获取
DNA合成仪
蛋白质的氨基酸顺序
mRAN
核苷酸序列
基因DNA的核苷酸序列
目的
基因
推测
推测
合成
（4）利用PCR技术扩增目的基因
（3）化学方法直接人工合成
（2）从基因文库中获取目的基因
3.目的基因获取的方法
（1）从生物组织中直接获取
二、目的基因的筛选与获取
PCR扩增仪
提取
苏云金芽孢杆菌
抗虫基因
？
快速获得大量抗虫基因
利用PCR获取和扩增目的基因
结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？
PCR——聚合酶链式反应
PCR是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
二、目的基因的筛选与获取
体内DNA复制要点回顾
条件
原料：游离的脱氧核苷酸（A、T、G、C）
模板：DNA的两条链
酶：DNA解旋酶、DNA聚合酶等
能量：ATP
复制原则
碱基互补配对原则（保证复制的准确进行）
利用PCR获取和扩增目的基因
二、目的基因的筛选与获取
二、目的基因的筛选与获取
利用PCR技术扩增目的基因
（1）DNA复制所需的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶（在体外用高温代替） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的原料
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3`端开始连接脱氧核苷酸
（2）扩增所需的条件
模板（目的基因）、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶
过程：
目的基因DNA________后_______，____与单链相应________结合；然后以_______为模板在________作用下进行_____，即将4种_________加到__________，如此___________。
每次循环一般可以分为_____、_____、_____三步。
受热变性
解为单链
引物
延伸
互补序列
单链DNA
DNA聚合酶
引物的3’端
脱氧核苷酸
重复循环多次
变性
复性
延伸
二、目的基因的筛选与获取
二、目的基因的筛选与获取
（3）扩增的过程
5’ 3’
3’ 5’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
目的基因
条件：DNA模板、4种脱氧核苷酸、引物和DNA聚合酶
过程：变性→复性→延伸
（3）扩增的过程——演示图
二、目的基因的筛选与获取
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5’ 3’
3’ 5’
引物2
5’ 3’
引物1
3’ 5’
引物2
5.结果
呈___________（ n次扩增循环后，DNA数量约为___）
*为什么呈指数形式扩增？
___________________________________________
___________________________________________
指数形式扩增
2n
一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍
思考：
1.变性过程破坏的是哪种化学键？是否需要酶？
2.引物是什么？在复性过程中引物结合到模板链的哪一端？
3.延伸过程是否需要ATP供能？
4.PCR为什么需要引物？
氢键
不需要酶，需要90℃以上的高温
短单链核酸
3’端
不需要
由dNTP水解供能
DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链
（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）
旁栏思考题
1. 用PCR技术可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另DNA链，形成双链DNA分子(图3-1)。
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞核内
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
1、目的：
（2）使目的基因能够表达和发挥作用。
2、组成：
a、目的基因
b、启动子
c、终止子
d、标记基因
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代。
三、基因表达载体的构建——基因工程的核心
①启动子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
终止子
抗生素抗性基因
复制原点
启动子
插入基因
基因表达载体模式图
三、基因表达载体的构建
思考1：表达载体为什么一定要有启动子？
（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能有利于基因的表达；
（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体细胞无法转录。
③标记基因：
一般为抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，鉴别受体细胞中是否导入目的基因。
标记基因的作用：
用于对重组质粒（DNA）的鉴定和筛选
②终止子：一段特殊的DNA片段，位于目的基因的尾端，使转录终止。
终止子
抗生素抗性基因
复制原点
启动子
插入基因
基因表达载体模式图
三、基因表达载体的构建
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
注意：
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。
三、基因表达载体的构建
一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶把两者连接。
基因表达载体的构建过程
两个切口
获得目的基因
质粒
DNA分子
限制酶处理
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同一种
一个切口
两个黏性末端
GGATCCAAGCTTGGG
CCTAGGTTCGAACCC
CCCAAGCTT
GGGTTCGAA
BamH Ⅰ
Hind Ⅲ
Xba Ⅰ
Sma Ⅰ
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
BamH Ⅰ
Bt基因
多
克
隆
位
点
动
子
启
终
子
止
标
R
记
基
因
Kan
复制
原点
问题：选用哪种限制酶同时切割Bt基因和pBI121？
5′
5′
3′
3′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
GGATCCA
CCTAGGTTCGA
Bt
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Bt基因
Hind Ⅲ单酶切
DNA连接酶
5′
5′
5′
5′
Bt
Bt
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
AGCTT
A
G
CCTAG
Bt基因
双酶切优点：
利于载体与目的基因正确结合，避免反向连接和自身环化
大肠杆菌自身修复，比例很少
Hind Ⅲ与BamH Ⅰ双酶切
DNA连接酶
Bt基因
Bt基因
Bt
基因
5′
5′
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
1. 将目的基因导入植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。（用于双子叶植物）
四、将目的基因导入受体细胞
（2）农杆菌转化步骤：
四、将目的基因导入受体细胞
2.花粉管通道法
在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。
3.将目的基因导入动物细胞
方法：显微注射法
提纯含目的基因表达载体
受精卵
显微注射
移植到输卵管或子宫
受精卵发育
新性状动物
（2）操作:
显微注射技术
4.将目的基因导入微生物细胞
（1）微生物作受体细胞原因：
（2）常用法：
Ca2+处理
常用菌：
大肠杆菌
（增加细胞壁的透性，与细胞膜无关）
（3）过程：
Ca2+处理大肠杆菌
感受态细胞
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA
繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少。
Ca2+
感受态细胞
吸收
将目的基因导入受体细胞的方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——Ca2+转化法
课堂总结
显微注射法法
按前面三个步骤进行了操作，是否可以确定目的基因进入了受体细胞并能维持稳定？是否可以确定目的基因一定能够进行表达？是否可以确定得到了新的性状？
不一定！
如何判断？
1.分子检测
2.个体水平鉴定
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
②检测目的基因是否转录出了mRNA
①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因
4
目的基因的检测与鉴定
在抗虫棉的培育过程中，可以从哪些层次对目的基因进行检测与鉴定？
1.检测转基因生物染色体DNA上是否插入了目的基因
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
DNA分子杂交技术
15N
DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
方法：PCR扩增和分子杂交技术
目的基因的检测与鉴定
基本思路：
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
分子杂交技术
分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法：抗原-抗体杂交技术
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
原理：抗原抗体的特异性结合
目的基因的检测与鉴定
转Bt基因
非转基因
2.个体水平的检测
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
没有抗虫基因的棉植株
有抗虫基因的棉植株
接种
棉铃虫
虫没有死
虫被杀死
没有表达
目的基因表达
目的基因的检测与鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
自主探究
1、实验原理
2、实验器材
3、实验步骤
4、实验结果
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
PCR 的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
实验原理
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
实验器材
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 940C，5min
30 次 940C, 30s 550C, 30s 720C，1min
最后一次 940C，1min 550C, 30s 720C，1min
移液
离心
扩增
实验步骤（PCR）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验步骤（电泳鉴定）
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
实验步骤（电泳鉴定）
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
结果分析
电泳实验
例1：用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是( )
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
课堂练习
练习与应用
一、概念检测
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。 （ ）
（2）构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3）只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。（ ）
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
√
×
×
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
普通大米（左）和“黄金大米”（右）
【这项研究成果发表在《自然 生物技术》（Nature Biotechnology ）杂志上】
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______ ，标记基因是_____ ，质粒pSYN 12424的作用是______ 。
【答案】ctrl 基因和psy基因 Pmi基因 将目的基因送入水稻细胞。
（2）在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？
【答案】不能。如果目的基因序列中含有用到的限制酶的识别序列，限制酶可能将它切断。
（3）请查找相关资料，了解科学家为什么 要培育“黄金大米”以及当前关于“是否要推广 '黄金大米’”的各种争论。你还可以提出自己的看法，并与同学交流讨论。
【提示】维生素A在人体内具有非常重要的生理功能，对视力、骨骼生长、免疫功能等都有调节作用。但是，人体不能合成维生素A，需要从食物中摄取。维生素A缺乏症是南亚地区常见的由营养不良导致的疾病，该地区的居民一般以籼稻作为主食。β-胡萝ト素是维生素A的前体，在人体内它可以转化为维生素A。因此，科学家将两个参与β-胡萝ト素合成的酶的基因转入了籼稻中，使其胚乳中富含β-胡萝ト素，期望让人们通过日常食用主食就能补充足够量的维生素A，从而降低维生素A缺乏症的患病率。关于“是否要推广“黄金大米””的争论主要围绕其安全性、有效性等方面展开。在学生交流讨论的过程中，教师要注意引导他们理性地表明观点和参与讨论。
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