3.2基因工程的基本操作程序 课件(共46张PPT4个视频)--2025-2026学年高二上学期《生物》（人教版）选必修3
文档属性
| 名称 | 3.2基因工程的基本操作程序 课件(共46张PPT4个视频)--2025-2026学年高二上学期《生物》（人教版）选必修3 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 67.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-11-11 17:23:15 | ||
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文档简介
(共46张PPT)
一条小虫引发的科技大战
—中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实
普通棉花
转基因抗虫棉
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程
目录 /CONTENTS
01
02
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
03
将目的基因导入受体细胞
04
目的基因的检测与鉴定
01目的基因的筛选和获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因。1、目的基因：如何筛选目的基因？01目的基因的筛选和获取用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白在起作用。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关2、目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。01目的基因的筛选和获取2、目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪明确了目的基因后，该怎么获得它 序列数据库（如GenBank）核苷酸序列比对氨基酸序列比对序列比对工具（如BLAST）课本P96基于网络数据分析基因和蛋白质的序列信息01目的基因的筛选和获取（1）人工合成3、目的基因的获取在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪转基因抗虫棉01目的基因的筛选和获取苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。提取（2）利用PCR获取和扩增目的基因3、目的基因的获取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。01目的基因的筛选和获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）01目的基因的筛选和获取思考：1.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备01目的基因的筛选和获取耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。01目的基因的筛选和获取思考：2.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’01目的基因的筛选和获取琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考：3、如何对产物进行鉴定？02基因表达载体的构建目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？思考：各个元件有什么作用？（核心工作）
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
知识补充
基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
转录
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
蛋白质
翻译
02基因表达载体的构建（核心工作）目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。02基因表达载体的构建（核心工作）如何构建抗虫棉的基因表达载体？①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
问题探讨
03将目的基因导入受体细胞方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创常用03将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物1.目的基因导入植物细胞03将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法1.目的基因导入植物细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。（可转移的DNA）03将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达1.目的基因导入植物细胞032.目的基因导入动物细胞将目的基因导入受体细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（2）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。3.目的基因导入微生物细胞03将目的基因导入受体细胞Ca2+感受态细胞吸收04目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？04目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原—抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）04目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
总结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
DNA分子电泳
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）仪器
（2）材料
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
3、材料用具
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、材料用具
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步（PCR）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
移液
离心
扩增
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步骤（电泳鉴定）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
4、实验步骤（电泳鉴定）
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究.实践
原理
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
一、概念检测
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
一、概念检测
练习与应用
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用是______________________ 。
ctrl 基因和psy基因
Pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
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202X/01/01
一条小虫引发的科技大战
—中国农科院棉花研究所开发抗虫棉纪实
普通棉花
转基因抗虫棉
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤
第3章 基因工程
第2节 基因工程的基本操作程序
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
（有抗虫特性）
导入
抗虫基因
重组DNA分子
培育转基因抗虫棉的简要过程
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
3.将目的基因导入受体细胞
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程
目录 /CONTENTS
01
02
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
03
将目的基因导入受体细胞
04
目的基因的检测与鉴定
01目的基因的筛选和获取在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。如：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。主要指的是编码蛋白质的基因。1、目的基因：如何筛选目的基因？01目的基因的筛选和获取用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂，广泛用于防治棉花虫害已有多年历史。掌握了Bt基因的序列信息Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因Bt基因的表达产物--Bt抗虫蛋白在起作用。苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关2、目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。01目的基因的筛选和获取2、目的基因的筛选：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选。DNA测序仪明确了目的基因后，该怎么获得它 序列数据库（如GenBank）核苷酸序列比对氨基酸序列比对序列比对工具（如BLAST）课本P96基于网络数据分析基因和蛋白质的序列信息01目的基因的筛选和获取（1）人工合成3、目的基因的获取在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。前提：方法：基因比较小、核苷酸序列已知通过DNA合成仪用化学方法直接合成DNA合成仪转基因抗虫棉01目的基因的筛选和获取苏云金杆菌Bt基因？快速获得大量Bt基因PCR——聚合酶链式反应原理：DNA半保留复制，即在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。提取（2）利用PCR获取和扩增目的基因3、目的基因的获取PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。01目的基因的筛选和获取体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）01目的基因的筛选和获取思考：1.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？体内DNA复制参与的组分在DNA复制中的作用PCR中参与的组分打开DNA双链提供DNA复制的模板合成子链的原料催化合成DNA子链使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（通常为小的单链RNA）无需解旋酶，用高温代替DNA（目的基因）模板4种脱氧核苷酸(dNTP)耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）引物（通常为小的单链DNA）反应还需要其它条件，如缓冲液（一般添加Mg2+）、和控温设备01目的基因的筛选和获取耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）4种脱氧核苷酸（DNTP）引物待扩增的DNA片段（模板）5’5’变性复性延伸温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。01目的基因的筛选和获取思考：2.PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？5’3’5’5’第一次循环第二次循环3’5’第三次循环3’3’01目的基因的筛选和获取琼脂糖凝胶电泳DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就叫电泳。思考：3、如何对产物进行鉴定？02基因表达载体的构建目的：确保基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。获得了足量的Bt基因后，是否能直接将Bt基因导入棉花细胞呢？思考：各个元件有什么作用？（核心工作）
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
原核基因
知识补充
基因的结构
编码区：编码蛋白质的合成
非编码区：不能编码蛋白质，调控遗传信息的表达
转录
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
蛋白质
翻译
02基因表达载体的构建（核心工作）目的基因：能控制表达所需要的特殊性状启动子：位置：基因的上游功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。复制原点：DNA复制的起始位点终止子：位置：基因的下游功能：终止转录标记基因：便于重组DNA分子的筛选和鉴定。02基因表达载体的构建（核心工作）如何构建抗虫棉的基因表达载体？①用一定的限制酶切割载体，使其出现一个切口。②用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段。③将切下的Bt基因片段拼接到载体的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子。载体基因表达载体使用一种DNA限制酶进行切割，共有几种连接情况？
问题探讨
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接？
双酶切
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
问题探讨
03将目的基因导入受体细胞方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法花粉管通道法——显微注射法——Ca2+处理法我国科学家独创常用03将目的基因导入受体细胞（1）花粉管通道法（我国科学家独创）②在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中目的基因目的基因适用生物：开花植物1.目的基因导入植物细胞03将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法1.目的基因导入植物细胞转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。实质是基因重组。转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。（可转移的DNA）03将目的基因导入受体细胞（2）农杆菌转化法目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达1.目的基因导入植物细胞032.目的基因导入动物细胞将目的基因导入受体细胞（1）常用方法：（2）受体细胞:显微注射法受精卵①体积大，易操作。②易表现出全能性。（3)过程：构建基因表达载体并提纯利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中早期胚胎培养胚胎移植获得具有新性状的动物（1）常用方法：Ca2+处理原核细胞（常选择大肠杆菌）目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。（2）受体细胞：优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。3.目的基因导入微生物细胞03将目的基因导入受体细胞Ca2+感受态细胞吸收04目的基因的检测与鉴定将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？04目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？Bt基因mRNABt抗虫蛋白抗虫棉PCR等技术检测抗原—抗体杂交技术分子水平抗虫鉴定（个体水平）04目的基因的检测与鉴定思考：结合基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？类型检测内容方法分子水平的检测个体生物学水平的鉴定受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因目的基因是否转录出了mRNAPCR等技术目的基因是否翻译成蛋白质抗原-抗体杂交技术个体是否具有相应性状抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
总结
1.目的基因的筛选和获取-前提
利用PCR获取和扩增
化学方法人工合成
2.构建基因表达载体-核心
目的基因、启动子、终止子、标记基因
3.将目的基因导入受体细胞-关键
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、
感受态细胞转化法(微生物);
4.目的基因的检测与鉴定-保证
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
PCR仪
DNA分子电泳
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA体外扩增的原理
PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构像等有关。
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）仪器
（2）材料
PCR 仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）
4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA 聚合酶、模板 DNA 、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
PCR仪
微量离心管
微量移液器
电泳装置
3、材料用具
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
3、材料用具
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5ul
20mmol/l 的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1ul
20umol/l 的引物I 2.5ul
20umol/l 的引物II 2.5ul
H2O 28-33ul
1-5U/ul 的Taq DNA聚合酶 1-2U
模板DNA 5-10ul
总体积 50ul
注：模板DNA的用量为1pg-1ug
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步（PCR）
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
移液
离心
扩增
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
4、实验步骤（电泳鉴定）
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
配制琼脂糖溶液
制备凝胶
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。
加样
电泳、观察
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
4、实验步骤（电泳鉴定）
探究.实践
DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意：
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究.实践
原理
DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
2.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
M：marker；1-阳性质粒；2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
一、概念检测
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
一、概念检测
练习与应用
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
2. 八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示） 和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtl表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtl基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为 “黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。
（1）科学家在培育“黄金大米”时，将ctrl 和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN 12424。该项研究的目的基因是______________ ，标记基因是_____________ ，质粒pSYN 12424的作用是______________________ 。
ctrl 基因和psy基因
Pmi基因
将目的基因送入水稻细胞
感谢您的观看
202X/01/01