3.1重组DNA技术的基本工具 课件(48张2个视频)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3
文档属性
| 名称 | 3.1重组DNA技术的基本工具 课件(48张2个视频)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 49.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-01-01 00:00:00 | ||
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文档简介
1.基因是什么？
2.基因的功能是什么？
基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。
转录
DNA
mRNA
蛋白质
翻译
（RNA聚合酶）
——体现相关的生物性状
知识回顾——基因
基因是有遗传效应的DNA片段。
①DNA中文全称:
②组成元素:
③基本单位:
脱氧核糖核酸
C H O N P
脱氧核糖核苷酸
= 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
1′
4′
3′
2′
5′
A T G C
脱氧核苷酸
(4种)
知识回顾——DNA
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胞嘧啶脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
G
磷酸
脱氧
核糖
T
磷酸
T
磷酸
脱氧
核糖
C
磷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
氢键
磷酸二酯键
脱氧核苷酸如何链接成脱氧核苷酸链的呢？
知识回顾——DNA
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
①磷酸二酯键
②氢键
简图：
知识回顾——DNA
DNA的结构特点：
5’
3’
3’
5’
知识回顾——DNA
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
双螺旋结构
知识回顾——DNA
第3章 基因工程
重组DNA技术的基本工具
01
基因工程的基本操作程序
02
基因工程的应用
03
蛋白质工程的原理和应用
04
基因工程的别名
原理
操作环境
操作对象
操作水平
结果
优点
基因重组
生物体外
基因
DNA分子水平
定向改造生物的性状
重组DNA技术
产生新的生物类型和生物产品
发光 基因
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
问题探讨
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
讨论：科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
载体
——“分子运输车”
限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
DNA连接酶
——“分子缝合针”
3.1 重组DNA技术的基本工具
本节聚焦：
1.重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
2.基因工程载体需要具备什么条件？
磷酸二酯键
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
磷酸二酯键
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开
磷酸二酯键
原核生物
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（酶的专一性）
EcoRⅠ
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
②大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
①限制酶的名字的由来 P72
6
EcoRⅠ
BamHⅠ
TaqⅠ
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
③一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线反向对称重复排列。
EcoRⅠ：
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
A. 形成的黏性末端（从5’往3’读）为________
B. 一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端
C. 两个黏性末端有___个游离的磷酸基团，消耗 分子水
D. 同一种限制酶切割形成的黏性末端________
AATT
两
相同
2
黏性末端
切口带有几个伸出的核苷酸，
它们之间正好互补配对。
2
中轴线
平末端
Sma I：
专一识别CCCGGG的序列，并使G和C之间的磷酸二酯键断开。
切口，是平整的
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
4.切割结果：
EcoR Ⅰ
中轴线
黏性末端
平末端
Sam Ⅰ
产生黏性末端或平末端
重组DNA分子的模拟操作P73：
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：
1、找到两条片段上EcoRI限制酶识别的序列和切割位点，然后用剪刀进行“切割”
识别序列GAATTC
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考·讨论 构建重组DNA分子(EcoRⅠ切割)
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
1、在切割质粒时，只是打开了一个切口，产生两个黏性末端
2、在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割___次此DNA分子，产生____个末端,出现____个游离的磷酸基团
4.切割目的基因和载体时，需要用____限制酶,目的是_________________
2
4
4
同种
产生相同的黏性末端
从以上操作可推知
【P75拓展应用2】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
限制酶1：↓GATC
限制酶2：CCGC↓GG
限制酶3：G↓GATCC
【报》43期P3 9】下图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图，下列叙述错误的是（ ）
A.限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
B.限制酶1和3切割得到的黏性末端相同
C.能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
D.不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
【《报》43期P3 5】下列关于下图所示黏性末端的说法，错误的是（）
A.甲、乙、丙黏性末端是由各种不同的限制酶催化产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
“分子缝合针”——
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开磷酸二酯键
1.作用:
二
DNA连接酶
*不连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
“分子缝合针”——
2.分类：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开磷酸二酯键
1.作用:
类型
来源
作用
相同点
差别
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端(效率较低)
二
DNA连接酶
重组DNA
*不连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
DNA连接酶作用示意图：
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图：
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
作用实质
化学本质
不
同
点
模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA (水解)酶
解旋酶
归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较
DNA
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将双链DNA切成两个或多个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到
单链末端
将DNA片段水解为单个脱氧
核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA
DNA片段
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
DNA
1、写出对应的酶
断开 连接
断开 连接
限制酶
DNA连接酶
解旋酶
DNA聚合酶
画出DNA酶的作用图解。
重组DNA分子的模拟操作P73：
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：
2、待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
思考：在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有多少种，有几种连接方式？如目的片段翻转过来，可以连接吗？目的片段可以自身环化吗？
“分子缝合针”——
二
DNA连接酶
5’
5’
3’
3’
正接：TCGGTAT
AGCCATA
反接：ATACCGA
TATGGCT
阅读顺序改变，蛋白质无法表达
DNA的碱基序列决定蛋白质功能
DNA连接酶连接了几个键？
4个磷酸二酯键
5’
5’
3’
3’
质粒和目的基因自身会环化
以上的连接情况代表有些目的基因可能没有与运载体连接，或目的基因导入受体细胞后不能表达，需要后续的检测和鉴定。
为了避免质粒和目的基因会自身环化和随意连接，
可以使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
由两个DNA片段连接形成的产物有三种，连接方式有四种
质粒与质粒连接
目的基因与目的基因连接
目的基因与质粒连接
正接
反接
目的基因表达的正确连接方式
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子的模拟操作P73：
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1.作用：
将目的基因送入受体细胞 & 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.最常用的载体——
质粒
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点,不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。所以不能直接将目的基因导入受体细胞。
质粒有___个游离的磷酸基团
0
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
质粒
3.载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
?真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因（抗生素抗性基因/荧光蛋白基因）
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
DNA分子复制的起点
思考：
噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，
而不是家蚕
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}种类
用途
不同点
质粒
噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入细菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别
4.种类：
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
——鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的作用
导
含有目的基因的重组质粒
《金》P85 17
目的基因环化
普通质粒
绿色:氨苄青霉素抗性基因
紫色:复制原点
目的基因
四种大肠杆菌：未被转化，转化了三种不同的
1、原核生物中存在的限制酶有什么作用？
原核生物易受到自然界外源DNA的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
2、为什么限制酶不切割细菌本身DNA？
细菌自身的DNA没有限制酶识别的特定序列或者识别序列被修饰（甲基化），所以不会限制酶切割自身的DNA。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
【典例】图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因
抗生素的抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【例】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组
质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是
。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
练习与应用
如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
练习与应用
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
4.DNA的鉴定——
1.破碎细胞——
对照组：如何设置？
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
二苯胺
阴性对照：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min
三、方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
2mol/L的NaCl
1号试管
2号试管
加入2mol/L NaCl溶液
5mL
5mL
丝状物(DNA)
不加
加入
用玻璃棒搅拌
无
丝状物溶解
加入二苯胺试剂
4mL
4mL
沸水浴
5min
5min
观察现象
不变蓝
变蓝
DNA的粗提取与鉴定
实践·探究
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合.
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
谢谢观看
Thank you
2.基因的功能是什么？
基因通过控制蛋白质的合成，直接或间接控制生物的性状。
转录
DNA
mRNA
蛋白质
翻译
（RNA聚合酶）
——体现相关的生物性状
知识回顾——基因
基因是有遗传效应的DNA片段。
①DNA中文全称:
②组成元素:
③基本单位:
脱氧核糖核酸
C H O N P
脱氧核糖核苷酸
= 磷酸 + 脱氧核糖 + 含氮碱基
脱氧
核糖
含氮碱基
磷酸
1′
4′
3′
2′
5′
A T G C
脱氧核苷酸
(4种)
知识回顾——DNA
鸟嘌呤脱氧核苷酸
胞嘧啶脱氧核苷酸
胸腺嘧啶脱氧核苷酸
腺嘌呤脱氧核苷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
G
磷酸
脱氧
核糖
T
磷酸
T
磷酸
脱氧
核糖
C
磷酸
脱氧
核糖
A
磷酸
脱氧
核糖
氢键
磷酸二酯键
脱氧核苷酸如何链接成脱氧核苷酸链的呢？
知识回顾——DNA
…… ATGCCGTGGAATTCC ……
…… TACGGCACCTTAAGG ……
①
②
①磷酸二酯键
②氢键
简图：
知识回顾——DNA
DNA的结构特点：
5’
3’
3’
5’
知识回顾——DNA
② 和 交替连接，排列在外侧，构成 ； 排列在内侧。
③两条链上的碱基通过 连接成碱基对，且遵循 。
①DNA是由两条单链组成的，这两条链
按 方式盘旋成双螺旋结构。
反向平行
脱氧核糖
磷酸
碱基
基本骨架
氢键
碱基互补配对原则
双螺旋结构
知识回顾——DNA
第3章 基因工程
重组DNA技术的基本工具
01
基因工程的基本操作程序
02
基因工程的应用
03
蛋白质工程的原理和应用
04
基因工程的别名
原理
操作环境
操作对象
操作水平
结果
优点
基因重组
生物体外
基因
DNA分子水平
定向改造生物的性状
重组DNA技术
产生新的生物类型和生物产品
发光 基因
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
问题探讨
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
在培育转基因番木瓜时，既要在体外对含有所需基因的DNA分子“切割”、改造和“拼接”；又要将重组DNA分子导入番木瓜体内，并使其表达。
讨论：科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
载体
准确切割DNA分子
将DNA片段连接起来
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞
载体
——“分子运输车”
限制性内切核酸酶
——“分子手术刀”
DNA连接酶
——“分子缝合针”
3.1 重组DNA技术的基本工具
本节聚焦：
1.重组DNA技术所需的三种基本工具是什么？它们的作用分别是什么？
2.基因工程载体需要具备什么条件？
磷酸二酯键
1.来源：
2.功能：
3.作用的化学键：
磷酸二酯键
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
主要从 中分离纯化出来，目前分离出数千种。
识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开
磷酸二酯键
原核生物
注意：限制酶是一类酶，而不是一种酶。
（酶的专一性）
EcoRⅠ
几种常见的限制酶的识别序列及切割位点：
②大多数限制酶的识别序列由 个核苷酸组成，少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
①限制酶的名字的由来 P72
6
EcoRⅠ
BamHⅠ
TaqⅠ
Hind Ⅲ
EcoRⅠ
种加词头两个字母
菌株型号
数字表示分离出来的第几种限制酶
属名首字母
③一般都是回文序列：即正反读顺序相同，围绕一条轴线反向对称重复排列。
EcoRⅠ：
专一识别GAATTC的序列，并使G和A之间的磷酸二酯键断开。
A. 形成的黏性末端（从5’往3’读）为________
B. 一个限制酶切割一次断两个磷酸二酯键形成___个黏性末端
C. 两个黏性末端有___个游离的磷酸基团，消耗 分子水
D. 同一种限制酶切割形成的黏性末端________
AATT
两
相同
2
黏性末端
切口带有几个伸出的核苷酸，
它们之间正好互补配对。
2
中轴线
平末端
Sma I：
专一识别CCCGGG的序列，并使G和C之间的磷酸二酯键断开。
切口，是平整的
一
“分子手术刀”——
限制性内切核酸酶
（简称限制酶）
4.切割结果：
EcoR Ⅰ
中轴线
黏性末端
平末端
Sam Ⅰ
产生黏性末端或平末端
重组DNA分子的模拟操作P73：
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：
1、找到两条片段上EcoRI限制酶识别的序列和切割位点，然后用剪刀进行“切割”
识别序列GAATTC
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
思考·讨论 构建重组DNA分子(EcoRⅠ切割)
…TATCGTACGATAGGTACTTAA
…ATAGCATGCTATCCATG
AATTCGGCATAC…
GCCGTATG…
…TCCTAG
…AGGATCTTAA
GAGCCATACTTAA
AATTCTCGGTATG
AATTCCATAC…
GGTATG…
1、在切割质粒时，只是打开了一个切口，产生两个黏性末端
2、在切割含“目的片段”的DNA分子时，需用限制酶切割___次此DNA分子，产生____个末端,出现____个游离的磷酸基团
4.切割目的基因和载体时，需要用____限制酶,目的是_________________
2
4
4
同种
产生相同的黏性末端
从以上操作可推知
【P75拓展应用2】有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割，各限制酶的识别序列和切割位点如下：
哪种限制酶切割B片段产生的DNA 片段能与限制酶SpeⅠ切割的A片段产生的DNA片段相连接，为什么？
XbaⅠ
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端（可互补）
结论：不同的限制酶可能切割形成相同的黏性末端
限制酶1：↓GATC
限制酶2：CCGC↓GG
限制酶3：G↓GATCC
【报》43期P3 9】下图是3种限制性内切核酸酶对DNA分子的识别序列和剪切位点图，下列叙述错误的是（ ）
A.限制酶2和3识别的序列都包含6个碱基对
B.限制酶1和3切割得到的黏性末端相同
C.能够识别和切割RNA分子内一小段核苷酸序列的酶只有限制酶2
D.不同的限制酶有不同的识别序列和切割位点，体现了酶的专一性
【《报》43期P3 5】下列关于下图所示黏性末端的说法，错误的是（）
A.甲、乙、丙黏性末端是由各种不同的限制酶催化产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键
D.切割甲的限制酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子
“分子缝合针”——
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开磷酸二酯键
1.作用:
二
DNA连接酶
*不连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
“分子缝合针”——
2.分类：
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开磷酸二酯键
1.作用:
类型
来源
作用
相同点
差别
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
大肠杆菌
T4噬菌体
恢复
磷酸二酯键
只能连接黏性末端
既能连接黏性末端
又能连接平末端(效率较低)
二
DNA连接酶
重组DNA
*不连接氢键（氢键的形成不需要酶的催化）
DNA连接酶
DNA连接酶
A
T
A
G
T
C
C
G
A
A
T
T
连接两个DNA片段
DNA连接酶作用示意图：
C
A
A
T
T
G
A
G
T
A
T
C
DNA聚合酶
连接单个脱氧核苷酸形成单链
DNA聚合酶作用示意图：
DNA连接酶
DNA聚合酶
相同点
作用实质
化学本质
不
同
点
模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
名称
作用部位
作用底物
作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA (水解)酶
解旋酶
归纳总结——与DNA相关的五种酶的比较
DNA
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将双链DNA切成两个或多个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到
单链末端
将DNA片段水解为单个脱氧
核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA
DNA片段
脱氧核苷酸
磷酸二酯键
DNA
1、写出对应的酶
断开 连接
断开 连接
限制酶
DNA连接酶
解旋酶
DNA聚合酶
画出DNA酶的作用图解。
重组DNA分子的模拟操作P73：
请在两张纸上分别写上下列两段DNA序列：
2、待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。
思考：在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有多少种，有几种连接方式？如目的片段翻转过来，可以连接吗？目的片段可以自身环化吗？
“分子缝合针”——
二
DNA连接酶
5’
5’
3’
3’
正接：TCGGTAT
AGCCATA
反接：ATACCGA
TATGGCT
阅读顺序改变，蛋白质无法表达
DNA的碱基序列决定蛋白质功能
DNA连接酶连接了几个键？
4个磷酸二酯键
5’
5’
3’
3’
质粒和目的基因自身会环化
以上的连接情况代表有些目的基因可能没有与运载体连接，或目的基因导入受体细胞后不能表达，需要后续的检测和鉴定。
为了避免质粒和目的基因会自身环化和随意连接，
可以使用不同的限制酶切割目的基因和质粒。
由两个DNA片段连接形成的产物有三种，连接方式有四种
质粒与质粒连接
目的基因与目的基因连接
目的基因与质粒连接
正接
反接
目的基因表达的正确连接方式
1. 剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
2. 你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
3. 你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
重组DNA分子的模拟操作P73：
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
1.作用：
将目的基因送入受体细胞 & 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
2.最常用的载体——
质粒
质粒：一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
目的基因是一个DNA片段，不含有复制原点,不能自主复制，不能稳定存在并遗传给后代。所以不能直接将目的基因导入受体细胞。
质粒有___个游离的磷酸基团
0
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
★思考：质粒为什么适合作为载体？作为载体需要具备那些条件？
质粒
3.载体需具备的条件
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
?真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因（抗生素抗性基因/荧光蛋白基因）
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
DNA分子复制的起点
思考：
噬菌体或某些动植物病毒作为载体，其原理是 。
病毒对宿主细胞的侵染具有一定的 性。
利用病毒对宿主细胞的侵染性
物种（组织）特异
若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用 作为载体，其原因是 。
噬菌体
噬菌体的宿主细胞是细菌，
而不是家蚕
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
{5C22544A-7EE6-4342-B048-85BDC9FD1C3A}种类
用途
不同点
质粒
噬菌体
植物病毒
动物病毒
将外源基因导入细菌等受体细胞
将外源基因导入植物细胞
将外源基因导入动物细胞
来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小上也有很大差别
4.种类：
质粒(常用）、噬菌体、动植物病毒
——鉴别和筛选含有目的基因的受体细胞
标记基因的作用
导
含有目的基因的重组质粒
《金》P85 17
目的基因环化
普通质粒
绿色:氨苄青霉素抗性基因
紫色:复制原点
目的基因
四种大肠杆菌：未被转化，转化了三种不同的
1、原核生物中存在的限制酶有什么作用？
原核生物易受到自然界外源DNA的入侵。所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是细菌的一种防御性工具。当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。
2、为什么限制酶不切割细菌本身DNA？
细菌自身的DNA没有限制酶识别的特定序列或者识别序列被修饰（甲基化），所以不会限制酶切割自身的DNA。
（2）不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义?
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶（目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列）来获取目的基因。
用限制酶切割时需注意的事项
(1)获取目的基因和切割载体时, 通常使用同种限制酶,目的是 。但是使用该法缺点是容易发生 ，为了避免上述情况发生，可采取的措施是 。
(2)获取一个目的基因需限制酶切割 次,共产生 个游离的磷酸基团。
(3)选择限制酶切割位点的基本原则：
①切割目的基因时： 。
②切割质粒时： 。
为了产生相同的黏性末端，便于连接
两
4
分别使用两种限制酶去切割目的基因和运载体
目的基因、质粒的自身环化以及目的基因与质粒反向连接
能切下目的基因且不破坏目的基因
至少保留一个完整的标记基因，便于筛选
练习与应用
【典例】图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因
抗生素的抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
【例】①用图1中的质粒和图2中的外源DNA构建重组
质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是
。
②构建重组质粒时，最好选择限制酶BamHⅠ、HindⅢ处理质粒、外源DNA，这样做的目的是 。
SmaⅠ会破坏质粒中的抗性基因以及破坏目的基因
确保目的基因与质粒的定向连接
练习与应用
如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线
用图2中的人乳铁蛋白目的基因和图1所示的质粒构建重组质粒时，选用的限制酶是
（从“EcoRⅠ”、“BamHⅠ/HindⅢ”、“SmaⅠ/HindⅢ”中选择）．不能选择其他限制酶的理由分别是：
。
BamHⅠ/HindⅢ
若选EcoRⅠ会破坏质粒的复制原点；若选SmaⅠ/HindⅢ，则构建的重组质粒没有标记基因或复制原点
练习与应用
1.“分子手术刀”——
1）来源：
2）作用：
3）作用结果：
2.“分子缝合线”——
1）作用：
2）分类：
3.“分子运输车”——
1）作用：
2）种类：
3）应具备条件：
限制酶
产生黏性末端、平末端
DNA连接酶
将不同的DNA片段连接起来
磷酸二酯键
将外源基因送入受体细胞
质粒（最常用）、噬菌体、动植物病毒
E.Coli DNA连接酶、T4DNA连接酶（来源、区别？）
主要从原核生物中分离纯化出来。
载体
识别特定的核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开。
作用部位：
②能在细胞中进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
①有一个至多个限制酶切割位点
③具有标记基因
④对受体细胞无害
——便于重组DNA分子的筛选
——供外源DNA片段（目的基因）插入其中
小结：基因工程的基本工具
称取 ，切碎，放入研钵，倒入 ，充分研磨。
在漏斗中垫上纱布过滤研磨液，4℃冰箱中静置后取 ；或将研磨液倒入塑料离心管中离心，取 。
在上清液中加入体积相等的、 溶液, 静置2~3min，溶液中出现的 就是粗提取的DNA 。
将丝状物或沉淀物溶于 溶液中，加入
试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min
2.去除杂质——
3.DNA的析出——
4.DNA的鉴定——
1.破碎细胞——
对照组：如何设置？
洋葱
研磨液
上清液
上清液
预冷的酒精
白色丝状物
二苯胺
阴性对照：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min
三、方法步骤
思考：如何评价结果？
——看提取物颜色
——看与二苯胺反应颜色的深浅
DNA纯度
DNA的量
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物；
或将溶液倒入塑料离心管中离心，取沉淀物晾干。
2mol/L的NaCl
1号试管
2号试管
加入2mol/L NaCl溶液
5mL
5mL
丝状物(DNA)
不加
加入
用玻璃棒搅拌
无
丝状物溶解
加入二苯胺试剂
4mL
4mL
沸水浴
5min
5min
观察现象
不变蓝
变蓝
DNA的粗提取与鉴定
实践·探究
（1）选什么样的材料实验更易成功？用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
（2）猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
（3）如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合.
含DNA的生物材料都可以，选取DNA含量相对较高的生物组织，成功率更大。
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
思考与讨论：
如果是猪肝呢？
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
谢谢观看
Thank you