3.2基因工程的基本操作程序 课件(共91张PPT2个视频)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3

(共91张PPT)
第3章
3.2基因工程的基本操作程序
本节聚焦
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些？
1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。你知道转基因抗虫棉抗虫的机制是什么吗？
从社会中来
培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
转基因抗虫棉(使棉铃虫死亡，左)与非转基因抗虫棉(右)
基因工程的基本操作程序
1、目的基因的筛选与获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。
定义：
在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状的或获得预期表达产物的基因。
目的基因
受体细胞
目的基因主要是指编码蛋白质的基因
抗逆性基因
生产药物基因
毒物降解基因
工业用酶基因
1.目的基因
一、目的基因的筛选与获取
筛选方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选
2.目的基因的筛选
①序列数据库，如美国国家生物信息中心GenBank
②序列对比工具（如BLAST)
一、目的基因的筛选与获取
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体。
实例：
Bt抗虫蛋白基因（Bt基因）的筛选过程
苏云金杆菌（Bt）制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
对Bt基因的表达产物-Bt抗虫蛋白有较为深入的了解：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关
掌握了Bt基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
Bt抗虫蛋白的抗虫原理：当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。
思考：Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取的方法
（1）人工合成
（2）利用PCR获取和扩增目的基因（常用）
（3）从基因文库中获取
（1）人工合成
在我国首批具有较高抗虫活性的转基因抗虫棉的培育过程中，科学家采用的是人工合成的方法。
DNA合成仪
转基因抗虫棉
在已知目的基因核苷酸序列且基因较小的情况下，利用DNA合成仪自动合成
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取
PCR的概念:
01
（2）利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取
PCR是聚合酶链式反应的缩写。它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
PCR扩增仪
DNA复制的基本条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
解旋酶 （体外用高温） 打开DNA双链
DNA母链 提供DNA复制的模板
4种游离的脱氧核苷酸 合成子链的原料
DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
一、目的基因的筛选与获取
一、目的基因的筛选与获取
PCR反应体系需要的条件
①稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）
③四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）
真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。
②DNA模板（需含有目的基因）
④耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
⑤能严格控制温度的温控设备
dATP
⑥引物
1、概念：
是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。
2、作用：
引物能使耐高温的DNA聚合酶从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
3、结合部位：
引物结合在模板链的_________。
3’端
拓展
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
子链延伸方向5’ 3’
⑥引物
拓展
4、PCR扩增时至少需要______种引物，原因是_________________________________________________________________________________
2
DNA的两条链是反向平行的，用2种引物才能保证DNA的两条链同时被扩增
5、PCR扩增的前提是：
根据一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物
6、设计引物时必须依据：
目的基因的核苷酸序列
7、设计引物的要求：
①同种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________
②2种引物之间不能发生碱基互补配对，原因是：______________________________。
防止引物自身折叠
防止引物之间配对，导致引物
不能与模板链结合
1．PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　）
①目的基因
②引物
③四种脱氧核苷酸
④mRNA
⑤DNA聚合酶等
⑥核糖体
A．①②③④ B．②③④⑤ C．①③④⑤ D．①②③⑤
D
当堂巩固
1）变性：
当温度上升到_______以上时， 断裂，双链DNA解聚为两条 。
氢键
单链DNA
待扩增的DNA片段
第一步：变性
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
变性
90℃
思考：变性的温度为何是90℃以上的一个温度范围，而不是95℃？
因为变性的温度与氢键的数量有关。当氢键数量越多时，所需温度就越高；反之，当氢键数量越少时，所需温度也就越低。
一、目的基因的筛选与获取
PCR反应的过程
2）复性：
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过 与两条单链DNA结合。
第二步：复性
引物1
引物2
DNA引物
3’
5’
3’
5’
碱基互补配对
5’
5’
思考：为什么需要引物？引物结合在模板链的什么位置？
①因为Taq酶不能从0开始添加核苷酸。
②引物结合在DNA模板链 3'端位置，引导子链从 5'端→3'端方向复制。
3’
3’
一、目的基因的筛选与获取
PCR反应的过程
3）延伸：
当温度上升到______左右时，溶液中的4种____________在耐高温的____________的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
第三步：延伸
引物1
引物2
Taq酶
Taq酶
3’
5’
3’
5’
脱氧核苷酸
5’
5’
DNA聚合酶
72℃
3’
3’
3’
3’
思考1：为什么温度要上升至72℃？
思考2：Taq酶结合在引物的3’还是5’端？
72℃是Taq酶的最适温度
Taq酶结合在引物的3’端
一、目的基因的筛选与获取
PCR反应的过程
第二轮循环的产物
第三轮的产物
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
第一轮循环的产物
3’
5’
3’
5’
【特别提示】PCR扩增过程中引物、原料需要源源不断的加入。
由于一个循环得到的产物又可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。
即成指数形式扩增（约为2n，其中n为扩增循环的次数）。
扩增次数 第1次 第2次 第3次 第n次
DNA分子数
含引物A(或B) 的DNA分子数
同时含引物A、B的DNA分子数
共消耗的 引物数量
2
2
0
4
6
8
14
2
6
2n
2n+1-2
2n-2
1
3
7
2n-1
PCR扩增DNA规律
5’
3’
5’
5’
第一次循环
第二次循环
3’
5’
第三次循环
3’
3’
思考： PCR技术获取目的基因时至少要经过几次循环才能从DNA分子中分离出目的基因？
PCR技术与DNA复制过程比较？
PCR技术 DNA复制
相同点 原则 原料 条件 不同点 解旋方式
场所
酶
结果
碱基互补配对
四种脱氧核苷酸
模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化
体外复制
细胞内（主要在细胞核内）
耐高温的DNA聚合酶
解旋酶、DNA聚合酶
DNA（基因）片段
完整的DNA分子
拓展：比较PCR反应与体内DNA复制所需的基本条件
在DNA复制中的作用 体内DNA复制条件 PCR反应条件
DNA母链
DNA母链
解旋酶
高温条件（90℃以上）
4种脱氧核苷酸
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
耐高温的DNA聚合酶
一小段RNA
一小段DNA
提供DNA复制的模板
断裂氢键，
打开DNA双链
合成子链DNA的原料
催化形成磷酸二酯键，进而合成DNA子链
使DNA聚合酶结合在引物的3’端，从而开始连接脱氧核苷酸（引物）
通常是20~30个核苷酸
用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。
1.逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；
2.核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；
3.以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA
01
（3）从基因文库中获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
基因文库的种类
基因组文库
部分基因文库
含有一种生物所有基因的文库
只含有一种生物部分基因的文库
（如：cDNA文库）
互补DNA
一、目的基因的筛选与获取
3.目的基因的获取
从基因文库中获取目的基因
DNA片段
基因1 基因2 基因3
放大
终止子
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
启动子
补充：基因的结构
转录
RNA聚合酶识别和结合位点
结束转录
mRNA
翻译
蛋白质
原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区
非编码区
编码区
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶结合位点
启动子
终止子
①不编码蛋白质。
：编码蛋白质 ,连续不间断
编码区
非编码区
原核细胞的基因结构
②调控遗传信息表达,上游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
编码区
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点
内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游
真核细胞的基因结构
编码区
非编码区
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子
非编码序列：
包括非编码区和内含子
对比 启动子 起始密码子 终止子 终止密码子
所在位置 DNA mRNA DNA mRNA
作用 RNA聚合酶的结合位点，转录的起始点。 翻译的起始点 AUG(甲硫氨酸） GUG（缬氨酸） 转录的终点 翻译的终点
（UAA、UGA、UAG)
概念辨析
琼脂糖凝胶电泳
思考：如何对PCR扩增的产物进行鉴定？
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
（1）利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环；
②PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理；
（2）DNA片段电泳鉴定的原理
①DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳
；
②PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定；
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小
和构象等有关（迁移速率与之呈负相关）
④凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.方法步骤
PCR反应体系的配方 10倍浓缩的扩增缓冲液 5 μL
20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液 1 μL
20 μmol/L的引物Ⅰ 2.5 μL
20 μmol/L的引物Ⅱ 2.5 μL
H2O 28～33 μL
1～5 U/μL的Taq DNA聚合酶 1～2 U
模板DNA 5～10 μL
总体积 50 μL
注：模板DNA的用量为1gp～1μg ①加液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
（1）DNA片段的扩增
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.方法步骤
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃，5min
30次 94℃，30s 55℃，30s 72℃，1min
最后1次 94℃，1min 55℃，30s 72℃，1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
3.方法步骤
（2）DNA片段的电泳鉴定
①配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
②制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
③加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物
④电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑤观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
3.方法步骤
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意:
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
③在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
④在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
⑤PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
4.结果分析与评价
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该片段大小约为750bp。
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是(　　)
A.PCR产物的分子大小在250至500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
B
【三点提醒】
①在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物既可以是DNA单链，也可以为RNA单链。细胞内的DNA进行
复制时，也需要引物，一般为RNA片段；PCR引物一般为DNA片段。
③真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。
因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋。
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
思考：能不能直接将目的基因导入受体细胞，为什么？如果不能，如何避免该结果的发生呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，且游离的DNA片段不能稳定遗传。
构建基因表达载体（核心工作）
1.构建基因表达载体的目的：
2.基因表达载体的组成
思考：要各个元件有什么作用？
（1）使目的基因在受体细胞中稳定存在，且可以遗传给下一代；
（2）使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
二、基因表达载体的构建——核心步骤
02
目的基因：能控制表达所需要的特殊性状
必须插到启动子和终止子之间
复制原点：
DNA复制的起始位点
终止子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的下游
功能：终止转录
四环素抗性基因、荧光蛋白基因等
二、基因表达载体的构建——核心步骤
启动子：
本质：有特殊序列结构的DNA片段
位置：基因的上游
功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA
标记基因：作用为鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来
载体≠表达载体：
1.二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。
2.表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
辨析
1个或2个
两个黏性末端
（平末端）
质粒（载体）
DNA分子（含目的基因）
获得目的基因，带有
两个切口两个黏性末端
（平末端）
DNA 连接酶
重组DNA分子（重组质粒）
同种 限制酶
（或产生相同末端的限制酶）
二、基因表达载体的构建——核心步骤
3.构建过程：
1、单酶切（同一种酶）：
（1）目的（结果）：
产生相同的黏性末端，以便进行连接
（2）DNA连接酶处理后会出现几种产物：
①目的基因——载体连接物
②载体——载体连接物
③目的基因——目的基因连接物
②③分别叫做载体的自身环化和目的基因的自身环化
拓展：限制酶的选择
1.只用一种限制酶切割的时候会出现什么现象？
反向链接
单酶切缺点:
质粒重新环化
目的基因自身环化
质粒与目的基因反向连接
思考讨论
双酶切
2.如何防止目的基因和载体的自身环化以及目的基因的反向连接？
-G
-CTTAA
-A
-TCTAG
使用两种限制酶的优点：①防止目的基因和载体的自身环化
②还可以防止目的基因与载体的反向连接
思考讨论
根据目的基因两端的限制酶切割位点、质粒上的限制酶切割位点以及是否破坏目的基因和标记基因等来确定限制酶的种类。
拓展：限制酶的选择方法
拓展：限制酶的选择方法
(1)应选择酶切位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择Pst Ⅰ；不能选择酶切位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
(2)为避免目的基因及质粒的自身环化、反向连接，也可使用不同的限制酶(非同尾酶)切割目的基因所在片段和质粒(双酶切)，如图甲可选择用Pst Ⅰ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)切割质粒的限制酶不能同时切开质粒上的所有标记基因，即至少要保留一个标记基因，以用于重组DNA的鉴定和筛选，如图乙中的质粒不能使用Sma Ⅰ切割。（同理保留启动子、终止子、复制原点）
（4）目的基因需要插入启动子和终止子之间
将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？
这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞
由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。
将目的基因与载体结合，构建好基因表达载体后，下面该进行什么操作？
基因工程第三步：将目的基因导入受体细胞
思考
常用方法
将目的基因导入
植物细胞
将目的基因导入
动物细胞
将目的基因导入
微生物细胞
农杆菌转化法
花粉管通道法
——显微注射法
——Ca2+处理法
我国科学家独创
三、将目的基因导入受体细胞
②在植物授粉后一定时间内，剪去
柱头，将DNA溶液滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中；
花粉管通道法导入外源DNA
适用生物：开花植物
（1）花粉管通道法（我国独创）
三、将目的基因导入受体细胞
1.目的基因导入植物细胞
转化：指目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，
实质都是基因重组。
（2）农杆菌转化法
三、将目的基因导入受体细胞
1.目的基因导入植物细胞
（2）农杆菌转化法
①农杆菌能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力。
（可转移的DNA）
②农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
三、将目的基因导入受体细胞
1.目的基因导入植物细胞
原理：
方法：
①将新鲜的从叶片上取下的圆形小片与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；
②可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液一段时间，然后培植植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等，
目的基因Ti质粒表达载体农杆菌植物细胞植物细胞染色体DNA新性状植株构建转入导入插入表达三、将目的基因导入受体细胞1.目的基因导入植物细胞过程：（2）农杆菌转化法 1.农杆菌转化法中，目的基因是否就是T-DNA，如果不是，T-DNA与目的基因是什么关系？
T-DNA不是目的基因，但它将来会被整合到宿主细胞染色体的DNA上，只要将目的基因插入T-DNA中，目的基因就可以随T-DNA进入宿主细胞并整合到宿主细胞的染色体上。
2.农杆菌转化法中，目的基因只能进入植物的一个体细胞中，但基因工程最终要的是一个转基因植株，如何实现这一目标？
得到含有目的基因的植物细胞后进行植物组织培养
三、将目的基因导入受体细胞
该过程经过____次拼接、____次导入
①第一次拼接：_______________________________
②第二次拼接：_______________________________
_______________________________
③第一次导入：__________________________________
④第二次导入：__________________________________
将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上
农杆菌将插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）
两
两
将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌
农杆菌含目的基因的T-DNA导入受体细胞
（非人工操作）
拓展—拼接&导入
03
（1）常用方法：
（2）受体细胞:
显微注射法
受精卵
①体积大，易操作。②易表现出全能性。
（3) 过程：
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
三、将目的基因导入受体细胞
2.目的基因导入动物细胞
原核细胞（常选择大肠杆菌）
（1）受体细胞：
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养。
（2）常用方法：
Ca2+处理
增加细胞壁的通透性，可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态（感受态细胞）。
Ca2+
感受态细胞
吸收
三、将目的基因导入受体细胞
3.目的基因导入微生物细胞
小结：将目的基因导入受体细胞的方法
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程 目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
当堂巩固
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）将加基因整合到Ti质粒上就是构建基因表达载体。（ ）
（2） 构建含有加基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。（ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有物基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
将基因表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？
即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
思考
不一定！
检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。
在抗虫棉的培育过程中，目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道
Bt基因
mRNA
Bt抗虫蛋白
抗虫棉
PCR等技术检测
抗原 — 抗体杂交技术
分子
水平
抗虫鉴定
（个体水平）
四、目的基因的检测与鉴定
概念
（1）借助载体上的标记基因可以检测目的基因是否在受体细胞中稳定地存在并遗传
（2）基因探针：
一段带放射性标记的、与目的基因互补的特异核苷酸序列。
可以是DNA，也可以是由之转录而来的RNA。
（3）核酸杂交：
可以用于检测目的基因：将待测DNA与目的基因探针混合，
如果发生了核酸杂交，则说明有目的基因。
互补的两条核酸单链通过复性形成双链的过程。
检测内容及方法:
（一）分子水平的检测
检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因
①检测目的基因是否导入
——通过PCR等技术检测
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
四、目的基因的检测与鉴定
DNA半保留复制
基本思路：
①制作基因探针，并用PCR扩增；
②提取受体细胞全部DNA并用PCR扩增，与基因探针置于同一培养液；
③高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
探针与受体中的DNA分子杂交
出现杂交带：
不出现杂交带：
已插入
未插入
提取棉花细胞DNA
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
对扩增产物进行检测
方法2：检测目的基因是否导入
——DNA分子交杂技术
变性
1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素标记，作为基因探针；
2、使探针与转基因生物基因组杂交，若出现杂交带，则导入成功。
原理：碱基互补配对原则
检测Bt基因是否翻译出mRNA
提取棉花细胞mRNA
逆转录
产生DNA
对扩增产物进行检测
用与Bt基因相关的
引物进行PCR扩增
②检测目的基因是否转录
——通过PCR等技术检测
（一）分子水平的检测
如：检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白
从棉花中
提取蛋白质
用相应抗体进行
抗原-抗体杂交检测
③检测目的基因是否翻译
——通过抗原-抗体杂交检测
四、目的基因的检测与鉴定
方法2：检测目的基因是否转录
——分子杂交技术
1、制作基因探针；
2、探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明转录出了mRNA。
变性
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
杂交分子
（可检测）
原理：碱基互补配对原则
③检测目的基因是否翻译
——通过抗原-抗体杂交检测
从转基因生物提取出来的蛋白质和相应的抗体进行杂交，如果出现杂交带，说明目的基因已经翻译。
苏云金芽孢杆菌
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
抗原
抗体
杂交
脱分化
检测目的基因是否表现出相应的性状
检测抗虫棉是否具有抗虫性状
采摘抗虫棉叶片
饲喂
棉铃虫
观察棉铃虫存活情况
（二）个体水平的检测
四、目的基因的检测与鉴定
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
获取目的基因产物的转基因生物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）接种实验
未染病
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
功能、活性正常
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
个体水平检测：抗性以及抗性程度
小结：基因工程
一、概念检测
练习与应用
1. 研究人员将一种海鱼的抗冻蛋白基因afp加整合到土壤农杆菌的Ti质粒上，然后用它侵染番茄细胞，获得了抗冻的番茄品种。判断下列相关表述是否正确。
（1）afp基因是培育抗冻番茄用到的目的基因 （ ）
（2） 构建含有afp基因的Ti质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶。 （ ）
（3） 只要检测出番茄细胞中含有afp基因，就代表抗冻番茄培育成功。 （ ）
×
×
√
2. 利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是 （ ）
A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶
B. 变性过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
C. 复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和 4种核糖核苷酸
一、概念检测
练习与应用
D
二、拓展应用
1. 研究人员在研究转基因烟草中外源卡那霉素抗性基因的遗传稳定性时，发现44株转基因烟草中有4株该基因的遗传不符合孟德尔遗传规律，在它们的自交后代中出现了较多的没有卡那霉素抗性的植株。请查找相关资料，尝试对这个问题作出解释。
外源基因插入基因组中可能为单位点插入，或者同一染色体多位点插入，或者不同染色体多位点插入。大多数情况下，插入的位点难以做到定点插入；插入的拷贝数也是随机的。因此，外源基因在转基因植物中的遗传是很复杂的。例如，科研人员在对转GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)的烟草进行基因表达分析时，发现部分转基因植株的染色体DNA中整合了多个拷贝的基因，从而导致GUS基因失活。除此之外，外源基因丢失、基因重排等也都可能影响外源基因的稳定性。
1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的
A、染色体DNA B、线粒体DNA
C、总mRNA D、tRNA
2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是
A、某生物的全套基因就是一个基因文库
B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库
C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库
D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库
A
C
当堂巩固
3．下列有关PCR的叙述，错误的是（ ）
A．PCR扩增过程中双链DNA的解开不需要解旋酶
B．用于PCR扩增的DNA聚合酶是一种耐高温的酶
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸
D．复性过程中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则
C
4.PCR技术可用于临床的病原菌检测。为检测病人是否感染了某种病原菌，医生进行了相关操作：
①分析PCR扩增结果；②从病人组织样本中提取DNA；
③利用PCR扩增DNA片段；④采集病人组织样本。回答下列问题：
（1）若要得到正确的检测结果，正确的操作顺序应该是_________（用数字序号表示）。（2）操作③中使用的酶是____________________________。PCR 反应中的每次循环可分为变性、复性、_____三步，其中复性的结果是________________________________。（3）PCR（多聚酶链式反应）技术是指___________________________________________________________________________________________________________________。该技术目前被广泛地应用于疾病诊断等方面。
一项根据DNA半保留复制的原理，在体外参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术
④②③①
Taq酶(耐高温的DNA聚合酶）
延伸
引物通过碱基互补配对与单链DNA结合
5、下列有关基因表达载体的叙述，错误的是（ ）
A．具有复制原点，使目的基因能在受体细胞内扩增
B．具有启动子，作为翻译多肽链的起始信号
C．具有标记基因，有利于目的基因的检测和筛选
D．具有目的基因，以获得特定的基因表达产物
B
6、下列过程中，不需要进行核酸分子杂交的是（ ）
A．利用基因芯片进行疾病诊断
B．检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因
C．检测目的基因是否发生了转录
D．检测目的基因是否翻译成蛋白质
D
7、下列技术依据碱基互补配对原理的是（ ）。
①检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因
②检测目的基因是否转录出了mRNA
③检测目的基因是否翻译成蛋白质
④通过观察害虫吃棉叶是否死亡判断棉花是否被赋予了抗虫特性
A．①②③④ B．①② C．①②④ D．①②③
B
8、下图为基因工程中基因表达载体的模式图，相关叙述错误的是（ ）
A．基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B．图中启动子位于目的基因的首端，是核糖体识别和结合的部位
C．复制原点是基因表达载体在受体细胞中独立复制和稳定存在所必需的
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
B
9、基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质，下列叙述错误的是（ ）
A．常用相同的限制酶处理目的基因和质粒（载体）
B．DNA连接酶和限制酶是构建重组质粒必需的工具酶
C．重组质粒的构建需在大肠杆菌体内完成
D．将重组质粒导入大肠杆菌细胞用的是感受态细胞法
C
10、在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（　　）
A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B．用选择培养基筛选导入目的基因的细胞
C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生质体融合
D．用Ca2+处理法获得含重组质粒的农杆菌
C
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