(共42张PPT)
第二章 第2节 动物细胞工程
第2课时:动物细胞融合技术与单克隆抗体
从社会中来
视频:免疫攻防战
1.你从视频中了解到单克隆抗体具有哪些特点
2.请你尝试利用“拆词法分析“单克隆抗体”一词中“单”和“克隆”的含义。
单克隆抗体是由单一细胞产生的只能识别一种抗原表位的特异性抗体。
单克隆抗体具有能准确识别抗原的特点。
从社会中来
1.什么细胞能产生抗体
2.能产生抗体的细胞能否大量增殖
3.什么细胞具有无限增殖的能力
4.能否创造一种能分泌抗体且增殖能力强的细胞
浆细胞
肿瘤细胞具有无限增殖的能力,但不能分泌抗体。
浆细胞能分泌抗体,但不能大量增殖。
通过动物细胞融合技术可以将浆细胞和肿瘤细胞的特性集中于一种细胞。
从社会中来
肿瘤细胞
浆细胞
1
动物细胞融合技术
2
单克隆抗体的制备
目 录
二、动物细胞融合技术与单克隆抗体
3
单克隆抗体的应用
动物细胞融合技术
一
一、动物细胞融合技术
【自主学习】阅读教材第48页,回答以下问题。
1.动物细胞融合技术的概念、结果、原理分别是什么?
2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些?
3.动物细胞融合技术有何意义?在现实生活中的应用有哪些?
《任务一》
1.概念:
使两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。
2.结果:
形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞的遗传信息。
3.原理:
细胞膜具有一定的流动性
4.诱导融合的常用方法:
PEG融合法
电融合法
灭活病毒诱导法
动物细胞融合
细胞膜的流动性
细胞增殖
一、动物细胞融合技术
动物细胞培养
5.意义:
突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能
6.应用:
(1)细胞融合技术已经成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。
(2)利用动物细胞融合技术发展起来的杂交瘤技术,为制造单克隆抗体开辟了新途径。
一、动物细胞融合技术
仙台病毒
紫外线
灭活
丧失感染活性(不感染细胞)
保留融合活性(诱导细胞融合)
1.什么是病毒的灭活?
灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力,但是并不破坏病毒的抗原结构。
诱导融合的常用方法:
相关信息
病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用,使细胞互相凝聚,细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细胞发生融合。
2.灭活病毒诱导细胞融合的原理
诱导融合的常用方法:
相关信息
植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理
细胞融合前的处理方法
诱导细胞融合的方法
细胞融合成功的标志
主要用途
意义
细胞膜具有一定的流动性、植物细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性
用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁
用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞
电融合法、离心法;聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2+-高pH融合法
PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法
再生出细胞壁
细胞核的融合
获得完整的杂种植株
主要用于制造单克隆抗体
打破生殖隔离,实现远缘杂交育种,培育植物新品种
突破了有性杂交的局限,使远缘杂交成为可能
动物细胞融合技术与植物体细胞杂交的比较
1975年,英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒,利用经抗原免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生的细胞制备出了单克隆抗体。他们因为这一贡献,于1984年获得了诺贝尔生理学或医学奖。
过渡
单克隆抗体是如何制备的?
单克隆抗体的制备
二
早期获得抗体的方法
向动物体内反复注射某种抗原,使动物产生抗体,然后从动物血清中分离所需抗体。
资料1:
为解决这一难题,科学家进行了多年的研究和探索。
产量低、纯度低、特异性差
抗原
人们发现,在动物发生免疫反应的过程中,体内的浆细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体,但是每个浆细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体,必须用克隆单个B淋巴细胞形成细胞群。
每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
单一B淋巴细胞
细胞群
选择
克隆
产生
大量纯度高特异性强的抗体
B淋巴细胞不可能无限增殖
如何获得大量、单一的抗体?
遗憾的是体外培养时,一个B淋巴细胞不能无限增殖如何解决这一问题?
B淋巴细胞不能无限增值
资料2:
动物细胞融合
杂交瘤细胞
动物细胞培养
单克隆抗体
杂交瘤细胞
既能迅速大量增殖,又能产生专一抗体
骨髓瘤细胞(癌细胞)能无限增殖
一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体
1975年,英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒在前人工作的基础上,充分发挥想象力,设计了一个极富创造性的实验方案:
一个极富创造力的方案
资料3:
1.为什么给小鼠注射特定的抗原蛋白?
2.会有几种细胞融合方式(只考虑两个细胞融合)?
3.杂交瘤细胞是如何筛选出来的?
4.是否所有的杂交瘤细胞都能产生专一性抗体?
5.有几次筛选过程?目的是什么?
6.如何大规模进行培养得到大量的单克隆抗体?
二、单克隆抗体的制备
结合图2-16: 米尔斯坦和科勒制备单克隆抗体过程的示意图,尝试构建制备单克隆抗体带流程,并思考以下问题:
《任务二》
【小组讨论】
从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞的培养
多种已免疫B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
诱导融合
小鼠的脾脏中获取
1.单克隆抗体的制备过程
注射特定的抗原,小鼠脾产生特定抗体的淋巴B细胞
022杂交瘤细胞(多种)13置于选择性培养基上培养第一次筛选融合的细胞BBBB瘤瘤瘤瘤1.单克隆抗体的制备过程B瘤B瘤第一次筛选:用特定的选择培养基在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长
①细胞合成DNA有D和S两条途径,其中D途径能被氨基喋呤阻断。
②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径,但不能分裂增殖。
③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径,没有S途径,但能不断分裂增殖。
筛选出杂交瘤细胞方法?
培养基中加入氨基嘌呤
B淋巴细胞及同型融合细胞
不能无限增殖,死亡
骨髓瘤细胞及同型融合细胞
不能无限增殖,死亡
杂交瘤细胞
能无限增殖,生长
【第一次筛选】获得杂交瘤细胞
知识拓展
资料1
02
克隆化培养
抗体检测
第二次筛选
(抗原-抗体杂交技术)
能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
杂交瘤细胞(多种)
1.单克隆抗体的制备过程
抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞(分泌的抗体能和特定的抗原结合)
02体外培养单克隆抗体体内或体外培养能分泌所需抗体的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔1.单克隆抗体的制备过程
AB1、AB2、AB3 ……
专一抗体检验阳性:有限稀释法、抗原-抗体杂交法
将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板,如果稀释度足够高,多孔板的一个孔里就可能只有1个杂交瘤细胞,培养之后(即克隆化培养),用标记的抗原检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体(抗原抗体能结合即为阳性孔)。这样经过多次克隆化培养以及有限稀释法的筛选,就能选出需要的那种杂交瘤细胞。
多孔细胞培养板
抗体检测板
阳性孔
【第二次筛选】能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
知识拓展
资料2
多孔细胞培养板
阳性孔
在单克隆抗体制备过程中,两次筛选的目的和方法是不相同的
将杂交瘤细胞群稀释,约每孔1个细胞进行培养 (克隆化培养)
一段时间后,检测各孔上清液中细胞分泌的抗体
上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔
抗体检测板
分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞
【第二次筛选】能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
知识拓展
抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法
动物细胞融合
动物细胞培养
给小鼠注射特定的抗原蛋白
B淋巴细胞(免疫)
骨髓瘤细胞
杂交细胞
杂交瘤细胞
单克隆抗体
能分泌所需抗体
的杂交瘤细胞
第一次筛选
第二次筛选
诱导融合
选择培养基
克隆化培养,专一抗体检验
体外培养或小鼠腹腔内增殖
特异性强
灵敏度高
可大量制备
既能大量繁殖又能产生专一抗体
2.单克隆抗体的制备过程总结
单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体的应用
三
三、单克隆抗体的应用
阅读教材“思考 讨论单克隆抗体的应用” 中的资料,思考、讨论前3题。
《任务三》
【小组讨论】
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用?
2. 除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势?
单克隆抗体的应用
思考 讨论
1. ADC的抗体和药物各具有什么作用?
抗体主要发挥靶向运输作用,即通过特异性结合靶细胞表面的抗原,将连接的药物输送到靶细胞;
药物发挥治疗效应,如杀伤靶细胞。
提示:
单克隆抗体的应用
思考 讨论
2. 除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物?
① 可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗;
② 一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长,理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗
提示:
单克隆抗体的应用
思考 讨论
3. 单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势?
① 单克隆抗体诊断试剂盒中的单克隆抗体只与特定的抗原反应,因此检测的特异性和灵敏度大大提高;生产单克隆抗体的杂交瘤细胞可以传代培养、冷冻保存和复苏利用,有利于控制产品的质量和标准化生产诊断试剂盒;
② ADC能够协同发挥抗体特异性识别的靶向作用和细胞毒素对肿瘤细胞的杀伤作用,因此它在临床上具有靶点清楚、毒副作用小等优点。
提示:
单克隆抗体的应用
思考 讨论
4. 单克隆抗体在临床上还有哪些应用?你可以课后搜集资料,然后以“单克隆抗体在临床上的应用”为主题,出一期黑板报或制作电子板报宣传相关知识。
单克隆抗体在临床上的应用涉及治疗、诊断等方面。单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗,如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤;曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。在临床诊断方面,单克隆抗体被广泛用于-些感染性疾病的检测、肿瘤的诊断、激素和细胞因子的测定等。以单克隆抗体在诊断肿瘤方面的应用为例,用放射性同位素或荧光标记抗肿瘤表面抗原的单克隆抗体,可以用这些抗体来对体内的肿瘤进行定位,辅助诊断并确定肿瘤的复发与转移等。
提示:
单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合,并且可以大量制备
1.单克隆抗体的优点
抗原-抗体杂交法
抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体
在妊娠第8天就可以作出诊断,比原来诊断方法提前了10d左右,准确率在90﹪以上。
具有准确、高效、简易、快速特点
诊断优点:
(1)诊断试剂——最广泛应用
2.单克隆抗体的应用
(2)运载药物
优点:位置准确、疗效高、副作用小
单克隆抗体+接头+药物(如细胞毒素)=ADC(抗体-药物偶联物)
单克隆抗体+药物 =“生物导弹”
2.单克隆抗体的应用
单克隆抗体+同位素(荧光标记)
在特定组织中成像的技术,可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。
2.单克隆抗体的应用
(2)运载药物
结合荧光标记的单克隆抗体药物
结合同位素的单克隆抗体药物
灭活病毒
本节小结
动物细胞融合技术与单克隆抗体
原理:
方法:
动物细胞融合技术
细胞膜具有流动性
物理法、化学法、生物法
单克隆抗体
获取已免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞→融合、筛选→杂交瘤细胞→动物细胞培养→提取单克隆抗体
制备:
应用:
诊断试剂;治疗疾病;运载药物
1. 下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述,错误的是 ( )
A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性
B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合
C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞
D.前者主要为了获得细胞产品,后者主要为了获得杂种植株
C
课后习题·概念检测
2. 科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原,制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是 ( )
A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染 SARS病毒
B. 体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体
C. 将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞
D. 将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内,从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体
A
课后习题·概念检测
假如你掌握了动物细胞融合技术,你想用这种技术来解决哪些问题 解决这些问题的大致思路是怎样的 这样做会有什么风险 请查阅相关资料,完善自己的思路,并形成文字报告,与同学交流。
提示:可以利用动物细胞融合技术培育多倍体胚胎,研究其发育机制,甚至可能培育出新的物种。但是,目前相关技术还不成熟,存在融合率低、胚胎死亡率高等问题,并且还可能带来一些伦理方面的问题。
课后习题·拓展应用
谢
谢
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