3.1重组DNA技术的工具 课件(共41张PPT)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3
文档属性
| 名称 | 3.1重组DNA技术的工具 课件(共41张PPT)-2025-2026学年高二下学期《生物》（人教版）选必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 5.6MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-02-24 00:00:00 | ||
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文档简介
(共41张PPT)
第3章 基因工程
第1节重组DNA技术的工具
指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
基因工程
操作环境：
操作对象：
操作水平：
工程原理：
工程产物：
意义：
生物体外
基因
DNA分子水平
人类需要的基因产物
基因重组
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
2）都遵循碱基互补配对原则
3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
思考1:DNA为何能在不同生物间进行转移与拼接？
1）基因是控制生物性状的结构与功能单位
2）遗传信息传递都遵循中心法则
3）生物界几乎共用一套遗传密码
思考2：外源基因在受体细胞中能表达的原因？
DNA
（基因）
翻译
转录
蛋白质
（性状）
RNA
复
制
中心法则
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
基因工程发展历程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
环斑病毒的
非转基因木瓜
转基因木瓜
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
思考：解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？
步骤一：抗病基因的提取出来
步骤二：抗病基因与运载体DNA“缝合”
步骤三：抗病基因进入 番木瓜
思考：1.剪刀破坏的是DNA的什么结构？
磷酸二酯键,形成若干个DNA片段
2.剪刀属于哪种“分子工具”？
3.使用DNA水解酶可以吗？
通过磷酸二酯键相连
氢键
酶
不可以，DNA水解酶会将DNA水解成单个脱氧核糖核苷酸
5’… GAATTCCCGGGAGA…CCCGGG…G CCCGGGAATTCCGGATCC …3’
3’… CTTAAGGGCCCTCT …目的基因… CGGGCCCTTAAGG CCTAGG…5’
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
1、来源：
2、种类：
主要来自原核生物
3、特点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
①
②
③
4、作用部位：
特定切点上的磷酸二酯键
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
5、作用结果：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出（未配对）的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
5、作用结果：
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列,并在 和 之间切割形成 ___末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
作用结果:
形成黏性末端和平末端
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
限制酶名字的由来
资料卡
是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如：
大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶: 。
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶: 。
EcoRⅠ
SmaⅠ
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
1.写出下列限制酶切割形成的末端序列
-G
-CCTAG-
-G
-CTTAA-
-A
-TTCGA-
-A
-TCTAG-
学以致用
or
-GATCC
G-
or
-AATTC
G-
or
-AGCTT
A-
or
-GATCT
A-
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
6、识别序列的特点：
(3)限制酶所识别的序列反向对称重复排列。
(1)限制酶具有________性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
(2)同一种限制酶一定能切出_______黏性末端，不同限制酶可能切出_________黏性末端，同样能连接。
回文序列
专一
相同的
相同的
BamHⅠ
EcoRⅠ
Hind Ⅲ
Bgld Ⅱ
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
2.以下黏性末端是由_____种限制酶作用产生的
3
学以致用
思考1：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。
思考2：试推测限制酶为什么不会切割细菌自身的DNA？
含有某种限制酶的细菌的DNA分子不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰（甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。）
旁栏思考题
限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
思考：切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
2.作用：
将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
1.概念：
能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
两个DNA片段
3.种类和差别：
类型
来源
功能 只缝合____________ 缝合_________和_________________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
E.coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
①…CTGCA …G
②…C
…GTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
以下哪些末端能够重新组合在一起？
学以致用
① ③连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
② ④ 连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
能
不能
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
DNA连接酶作用对象：
两个DNA片段
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
DNA聚合酶作用对象：
单个脱氧核糖核苷酸
A
A
T
G
A
T
T
C
DNA聚合酶
DNA母链
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
学以致用
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
基因工程
DNA
复制
一、重组DNA技术的基本工具
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
一、重组DNA技术的基本工具
（三）载体-“分子运输车”
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞
④对受体细胞无害、易分离
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
3.运载体需具备的条件：
标记基因的筛选原理：
一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
一、重组DNA技术的基本工具
（三）载体-“分子运输车”
扩展：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是
例题应用
A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
√
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
一、概念检测
练习与应用
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
1. 实验原理
提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
a、DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
b、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液
提取
提取
鉴定
c、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
2. 材料用具
① 选材：
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等。
② 试剂：
染色体数目多，细胞分裂旺盛，DNA含量较高。
SDS（十二烷基磺酸钠）：
EDTA（乙二胺四乙酸）：
使DNA保持稳定状态。
能有效的破坏细胞膜的磷脂和膜蛋白。
是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
Tris-HCl的缓冲体系（PH=8.0）：
研磨液
体积分数为95%的酒精
析出DNA
2mol/L的NaCl溶液
溶解DNA
二苯胺试剂
鉴定DNA，要现配现用
NaCl：
DNA与蛋白质分离。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
研磨
1
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨；
提取上清液
2
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。
① ＤＮＡ的提取：
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
上清液可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
① ＤＮＡ的提取：
加酒精析出
3
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
ａ、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
ｂ、低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
ｃ、抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出
动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
避免破坏DNA
搅拌时动作要轻缓的原因
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
② ＤＮＡ的鉴定：
溶解ＤＮＡ
4
鉴定ＤＮＡ
5
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。
向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
对照组
实验组
水浴加热
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
４. 结果分析与评价
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理
步骤3 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 溶液不变蓝色
实验结论 加丝状物或沉淀物
加4mL的二苯胺试剂
溶液逐渐变蓝
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
【请同学们补充完整以下实验步骤】
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
思考·讨论：
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿——异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。
５. 进一步探究
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。( )
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。( )
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
知识巩固
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。( )
√
×
×
解析：DNA能与二苯胺试剂在沸水浴下反应，使溶液呈现蓝色，而非蓝色沉淀。
解析：研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在上清液中。
1.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时,说法正确的是（ ）
A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B.离心后上清液中加入75%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA
C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D.可利用DNA在低温下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定
√
2.下列与“DNA的粗提取与鉴定”实验相关的说法，错误的是
A.研磨液中应加入DNA酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA酶降解DNA
B.研磨时需要控制好时间，以防影响DNA的提取量
C.鉴定时加入二苯胺试剂后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应
D.鉴定时溶液蓝色的深浅与DNA含量的多少有关
√
3.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序
是__________________________
(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目
的是 。
③→②→①→④→⑤
溶解DNA
(3)步骤①的目的是 ，
其依据的原理是 。
析出并获得DNA
DNA不溶于酒精
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴
加 试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。
白
二苯胺
沸水浴冷却
蓝色
谢谢观看
第3章 基因工程
第1节重组DNA技术的工具
指按照人们的愿望, 通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作DNA重组技术。
基因工程
操作环境：
操作对象：
操作水平：
工程原理：
工程产物：
意义：
生物体外
基因
DNA分子水平
人类需要的基因产物
基因重组
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1）DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸
2）都遵循碱基互补配对原则
3）双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
思考1:DNA为何能在不同生物间进行转移与拼接？
1）基因是控制生物性状的结构与功能单位
2）遗传信息传递都遵循中心法则
3）生物界几乎共用一套遗传密码
思考2：外源基因在受体细胞中能表达的原因？
DNA
（基因）
翻译
转录
蛋白质
（性状）
RNA
复
制
中心法则
1944年艾弗里等人证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
1950年埃特曼发明了一种测定氨基酸序列的方法。
1958年梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
1953年沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1961年尼伦伯格和马太破译了第一个编码氨基酸的密码子。
1967年，科学家发现，在细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移。
1970年科学家在细菌中发现了第一个限制性内切核酸酶（简称限制酶）。
20世纪70年代初，多种限制酶、DNA连接酶和逆转录酶被相继发现。
1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
1973年，证明质粒可以作为基因工程的载体，构建重组DNA，导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，基因工程正式问世。
1977年，桑格等科学家发明了DNA序列分析的方法。此后，DNA合成仪的问世为体外合成DNA提供了方便。
1982年，第一个基因工程药物-重组人胰岛素被批准上市。
1983年，科学家采用农杆菌转化法培育出世界上第一例转基因烟草。
1984年，我国科学家朱作言领导的团队培育出世界上第一条转基因鱼。
1985年，穆里斯等人发明了PCR。
1990年，人类基因组计划启动。2003年完成
21世纪以来，科学家发明了多种高通量测序技术，加速了人们对基因组序列的了解。
2013年，华人科学家张锋及其团队首次报道利用最新的基因组编辑技术编辑了哺乳动物基因组。该技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
基因工程发展历程
番木瓜容易受番木瓜环斑病毒的侵袭。当番木瓜被这种病毒感染后，产量会大大下降。科学家通过精心设计，用“分子工具”培育出了转基因番木瓜，它可以抵御番木瓜环斑病毒。
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
环斑病毒的
非转基因木瓜
转基因木瓜
“分子手术刀”
“分子缝合针”
“分子运输车”
思考：解决培育番木瓜的关键步骤需要哪些分子工具呢？
步骤一：抗病基因的提取出来
步骤二：抗病基因与运载体DNA“缝合”
步骤三：抗病基因进入 番木瓜
思考：1.剪刀破坏的是DNA的什么结构？
磷酸二酯键,形成若干个DNA片段
2.剪刀属于哪种“分子工具”？
3.使用DNA水解酶可以吗？
通过磷酸二酯键相连
氢键
酶
不可以，DNA水解酶会将DNA水解成单个脱氧核糖核苷酸
5’… GAATTCCCGGGAGA…CCCGGG…G CCCGGGAATTCCGGATCC …3’
3’… CTTAAGGGCCCTCT …目的基因… CGGGCCCTTAAGG CCTAGG…5’
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
1、来源：
2、种类：
主要来自原核生物
3、特点：
数千种
能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
（限制酶不是一种酶，而是一类酶）
①
②
③
4、作用部位：
特定切点上的磷酸二酯键
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
5、作用结果：
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
限制酶(EcoRⅠ)能识别 序列，并在 和 之间切开
键,形成 末端。
-GAATTC-
-CTTAAG-
G
A
黏性
磷酸二酯
EcoR I
5'
5'
3'
3'
黏性末端
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧将DNA两条单链分别切开，带有几个伸出（未配对）的核苷酸，这样的切口叫黏性末端。
5、作用结果：
Sma I
5'
5'
3'
3'
平末端
限制酶(SmaⅠ)能识别 序列,并在 和 之间切割形成 ___末端 。
-CCCGGG-
-GGGCCC-
G
C
平
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。
作用结果:
形成黏性末端和平末端
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
限制酶名字的由来
资料卡
是用生物属名的头一个字母与种加词的头两个字母，组成了3个字母的略语，以此来表示这个酶是从哪种生物中分离出来的。
例如：
大肠杆菌（Escherichia coli）R型菌株中分离出的第一个限制酶: 。
粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）中分离出的第一个限制酶: 。
EcoRⅠ
SmaⅠ
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为: 。
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
BamHⅠ EcoRⅠ__________________________
Hind Ⅲ Bgl Ⅱ _________________________
1.写出下列限制酶切割形成的末端序列
-G
-CCTAG-
-G
-CTTAA-
-A
-TTCGA-
-A
-TCTAG-
学以致用
or
-GATCC
G-
or
-AATTC
G-
or
-AGCTT
A-
or
-GATCT
A-
【思考】同种限制酶切割产生的黏性末端是否相同？
不同限制酶切割产生的黏性末端是否一定不同？
相同
可能会相同
6、识别序列的特点：
(3)限制酶所识别的序列反向对称重复排列。
(1)限制酶具有________性。一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。
(2)同一种限制酶一定能切出_______黏性末端，不同限制酶可能切出_________黏性末端，同样能连接。
回文序列
专一
相同的
相同的
BamHⅠ
EcoRⅠ
Hind Ⅲ
Bgld Ⅱ
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
2.以下黏性末端是由_____种限制酶作用产生的
3
学以致用
思考1：推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。
思考2：试推测限制酶为什么不会切割细菌自身的DNA？
含有某种限制酶的细菌的DNA分子不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰（甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。）
旁栏思考题
限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身安全。
一、重组DNA技术的基本工具
（一）限制性内切核酸酶-“分子手术刀”
思考：切开的黏性末端或平末端如何连接起来呢？
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
2.作用：
将 “缝合”起来，恢复被 切开的两个核苷酸之间的______________。
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
1.概念：
能够将 连接起来的酶，称之为DNA连接酶。
两个DNA片段
3.种类和差别：
类型
来源
功能 只缝合____________ 缝合_________和_________________
结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________ 大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端(效率较低)
磷酸二酯键
E.coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
①…CTGCA …G
②…C
…GTTAA
③ G…
ACGTC…
④ AATTC…
G…
A. ①③；②④ B. ①②；③④ C. ①④；②③ D.以上都不对
以下哪些末端能够重新组合在一起？
学以致用
① ③连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
② ④ 连接在一起后，____________（能/不能）再被限制酶识别。
能
不能
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
DNA连接酶作用对象：
两个DNA片段
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
思考：DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
DNA聚合酶作用对象：
单个脱氧核糖核苷酸
A
A
T
G
A
T
T
C
DNA聚合酶
DNA母链
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
项目 DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键
一、重组DNA技术的基本工具
（二）DNA连接酶-“分子缝合针”
2.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制酶、
DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③ C．①④②③ D．①④③②
C
学以致用
总结归纳
几种相关酶的比较
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对之间
的氢键
将DNA切成两个片段
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
基因工程
DNA
复制
一、重组DNA技术的基本工具
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制.
1.作用：
动植物病毒
噬菌体
2.种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
一、重组DNA技术的基本工具
（三）载体-“分子运输车”
①能在受体细胞中稳定保存并复制
②有一个至多个限制酶切割位点，便于插入（携带）目的基因
③具有标记基因，便于筛查含有重组DNA分子的细胞
④对受体细胞无害、易分离
真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
3.运载体需具备的条件：
标记基因的筛选原理：
一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。
一、重组DNA技术的基本工具
（三）载体-“分子运输车”
扩展：标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，导入了载体并成功表达了的受体细胞才能够生存。如图所示：
也可以用荧光蛋白基因做标记
1.以下是几种不同限制酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是
例题应用
A.以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
B.②片段是在识别序列为 的限制酶作用下形成的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下可形成重组DNA分子
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
√
限制酶
DNA连接酶
载体
①对受体细胞无害；
②有一个至多个限制酶切割位点；
③有特殊的标记基因；
④能自我复制或能整合到宿主DNA上。
质粒、λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
基因工程的基本工具
作为载体的条件
种类：
磷酸二酯键
来源：
主要来源于原核生物
特点：
作用部位：
具有专一性
结果：
形成黏性末端或平末端
连接部位：磷酸二酯键
种类： E.coliDNA连接酶、T4 DNA连接酶
作用： 把两条双链DNA片段拼接起来
课堂小结
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒 B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端 D. 用来识别特定基因的DNA探针
C
A
一、概念检测
练习与应用
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
1. 实验原理
提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
a、DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精
b、DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L NaCl溶液
提取
提取
鉴定
c、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
在2mol/L的NaCl溶液中溶解度最高，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
2. 材料用具
① 选材：
新鲜洋葱或香蕉、菠菜、菜花、猪肝等。
② 试剂：
染色体数目多，细胞分裂旺盛，DNA含量较高。
SDS（十二烷基磺酸钠）：
EDTA（乙二胺四乙酸）：
使DNA保持稳定状态。
能有效的破坏细胞膜的磷脂和膜蛋白。
是一种DNA酶的抑制剂，可防止细胞破碎后DNA酶降解DNA;
Tris-HCl的缓冲体系（PH=8.0）：
研磨液
体积分数为95%的酒精
析出DNA
2mol/L的NaCl溶液
溶解DNA
二苯胺试剂
鉴定DNA，要现配现用
NaCl：
DNA与蛋白质分离。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
研磨
1
称取约30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨；
提取上清液
2
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。或将洋葱研磨液倒入塑料离心管中离心，在1500r/min的转速下离心5min,再取上清液放入烧杯中。
① ＤＮＡ的提取：
研磨不充分，会使DNA分子不能从细胞核中释放出来，从而影响提取的DNA含量
不能用滤纸代替纱布，因为DNA会被吸附到滤纸上而大量损失。
上清液可能含有DNA、RNA以及蛋白质、脂质、糖类等。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
① ＤＮＡ的提取：
加酒精析出
3
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2～3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或者将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。
ａ、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
ｂ、低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。
ｃ、抑制分子运动，使DNA易形成沉淀析出
动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
避免破坏DNA
搅拌时动作要轻缓的原因
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
3. 方法步骤
② ＤＮＡ的鉴定：
溶解ＤＮＡ
4
鉴定ＤＮＡ
5
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。
向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
空白对照组：
在等体积的NaCl溶液中加入二苯胺试剂，将试管置于同等沸水浴中加热5min。
对照组
实验组
水浴加热
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
４. 结果分析与评价
试管编号 A（对照组） B（实验组）
步骤1 2mol/L的NaC1溶液5mL 步骤2 不进行任何处理
步骤3 步骤4 沸水浴加热5min 实验现象 溶液不变蓝色
实验结论 加丝状物或沉淀物
加4mL的二苯胺试剂
溶液逐渐变蓝
DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺试剂会被染成蓝色
【请同学们补充完整以下实验步骤】
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
思考·讨论：
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色，说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
本实验出提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同分析产生差异的原因。
从多种方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料，哪种提取方法的效果更好。
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
本试验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。
例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿——异丙醇混合液（体积比为24:1），通过离心将蛋白质及其它杂质除去，取清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的粘稠液体。此外，由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将二者分开。
５. 进一步探究
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。( )
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。( )
探究 · 实践：DNA的粗提取与鉴定
知识巩固
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。( )
√
×
×
解析：DNA能与二苯胺试剂在沸水浴下反应，使溶液呈现蓝色，而非蓝色沉淀。
解析：研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在上清液中。
1.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时,说法正确的是（ ）
A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B.离心后上清液中加入75%冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA
C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D.可利用DNA在低温下遇到二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定
√
2.下列与“DNA的粗提取与鉴定”实验相关的说法，错误的是
A.研磨液中应加入DNA酶的抑制剂，以防细胞破碎后DNA酶降解DNA
B.研磨时需要控制好时间，以防影响DNA的提取量
C.鉴定时加入二苯胺试剂后沸水浴即可观察到较为明显的显色反应
D.鉴定时溶液蓝色的深浅与DNA含量的多少有关
√
3.如图为鸡血细胞中DNA的粗提取和鉴定实验过程中的部分操作示意图，请据图分析，回答下列问题：
(1)右述图示中，该实验的正确操作顺序
是__________________________
(用序号与箭头表示)。
(2)步骤④中使用2 mol/L NaCl溶液的目
的是 。
③→②→①→④→⑤
溶解DNA
(3)步骤①的目的是 ，
其依据的原理是 。
析出并获得DNA
DNA不溶于酒精
(4)步骤①中所得到的丝状物为 色，若要鉴定其主要成分为DNA，可滴
加 试剂， 后，如果出现 则证明该丝状物的主要成分为DNA。
白
二苯胺
沸水浴冷却
蓝色
谢谢观看