3.1重组DNA技术的基本工具（第二课时） 课件(共63张PPT+内嵌视频) -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.1重组DNA技术的基本工具（第二课时） 课件(共63张PPT+内嵌视频) -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 72.2MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-03-03 00:00:00 | ||
图片预览
文档简介
(共63张PPT)
第3章 第1节
人教版 选择性必修3
重组 DNA 技术的基本工具
一/
目录
CONTENTS
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
1/
DNA连接酶 — “分子缝合针”
2/
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
3/
02
DNA连接酶 — “分子缝合针”
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
…… TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG ……
…… AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC ……
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
它们具有相同的黏性末端!
5’
3’
3’
5’
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
磷酸二酯键形成
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
磷酸二酯键形成
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
从大肠杆菌（Escherichia coli）
中分离得到的
从T4噬菌体中分离出来的
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
两种都可以
但连接平末端的效率相对较低
记忆小技巧：
E谐音1
T为英文2的首字母
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
A1
A1
A1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A1
A1
B2
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
……会出现非常多种可能
怎么解决这个问题？
课堂活动
A2
还有可能出现环化等
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
课堂活动
——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果
第一步：按上图所示剪好两个大小相同的纸条并写上碱基序列
第二步：用EcoRⅠ酶切割这个DNA片段，展示结果
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
课堂活动
——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果
哪些片段可以被DNA连接酶连接？
环化DNA片段是怎样的？
怎么避免该问题？
展示再用SpeⅠ限制酶切割后的片段
现在还会不会出现自身环化和反向连接等问题？
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
DNA聚合酶:
将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上
温故而知新：
还记得DNA复制的过程吗？
1）解旋
在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。
解旋酶
ATP
DNA复制过程:
2）合成引物（补充）
在引物酶的作用下，产生一小段RNA作为引物,后期引物会被切除
引物酶
引物
5’
3’
引物的作用简单理解就是引出DNA聚合酶，因为DNA聚合酶必须识别3’端才能结合上去。
3）合成子链
DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
模板
模板
DNA聚合酶
5’
3’
子链延伸方向
子链延伸方向
两条子链延伸方向相反，但都是从5’→3’
随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。
子链
母链
母链
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
子链
4）重新螺旋
每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
小结：几种相关酶的比较
含有所需要基因的DNA分子
为什么要将所需基因插入该DNA中？它的作用是什么？
03
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
(2)作用不同：
拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。
(1)分子量不同：
拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
（4）易分离，对受体细胞无害。
在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不完全具备对载体的要求，例如缺少合适的限制酶切点(如限制酶切点在标记基因内)、缺少启动子和终止子等。因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。现在常用的质粒，都是早期利用天然质粒经历多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作为标记基因，便于筛选转化成功的细菌)、添加 MCS(多克隆位点)区域等。所谓添加MCS，是质粒中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点。有时为了提高转录效率，还会插入增强子；也有可能需要剔除对受体细胞有害的基因等。
天然质粒为什么要经过人工改造才能被用作载体？（了解）
载体都是质粒吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
载体种类
质粒
动植物病毒
噬菌体
一种常用载体,大多数质粒的受体细胞是细菌。
受体细胞是细菌
受体细胞是动植物细胞
人工改造
“分子缝合针”
“分子运输车”
“分子手术刀”
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
总结：
限制酶
DNA连接酶
载体
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？
学习了如何对DNA进行操作，大家想不想见一见我们的主角——DNA
四
DNA 的粗提取与鉴定
四
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。
（提取原理）
（提取原理）
（鉴定原理）
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
四
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。
（二）目的要求
1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
（三）材料用具
四
DNA 的粗提取与鉴定
（三）材料用具
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（三）材料用具
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）
用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
SDS（十二烷基疏酸钠）
可使蛋白质变性与DNA分离
EDTA（乙二胺四乙酸）
DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA降解DNA
Tris（三羟甲基氨基甲烷）
提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态
研磨液
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)酒精预冷的作用:
同“低温放置的作用”
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
P117
现配现用
易被空气氧化，颜色改变
四
DNA 的粗提取与鉴定
（五）结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
四
DNA 的粗提取与鉴定
（五）结果分析与评价
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（六）进一步探究
本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
练习与应用
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
练习与应用
一、概念检测
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
练习与应用
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
A片段
B片段
练习与应用
二、拓展应用
练习与应用
二、拓展应用
A片段
B片段
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用
二、拓展应用
A片段
B片段
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
感谢观看
THANKS
第3章 第1节
人教版 选择性必修3
重组 DNA 技术的基本工具
一/
目录
CONTENTS
限制性内切核酸酶 — “分子手术刀”
1/
DNA连接酶 — “分子缝合针”
2/
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
3/
02
DNA连接酶 — “分子缝合针”
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
苏云金杆菌DNA片段中的部分基因
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
目的基因切割下来后怎么把它重新连起来呢？
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
…… TCCCTAAGGAATTCCATCCCAGATG……CATGCA……CCACATG ……
…… AGGGATTCCTTAAGGTAGGGTCTAC……GTACGT……GGTGTAC ……
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
某DNA片段
5’
3’
3’
5’
你知道如何将Bt基因插入下面DNA片段中吗？
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
它们具有相同的黏性末端!
5’
3’
3’
5’
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
磷酸二酯键形成
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
苏-基因2
Bt基因
5’
3’
3’
5’
用EcoRⅠ限制酶切割该DNA片段
如何将他们连接起来呢？
DNA连接酶 — “分子缝合针”
它们具有相同的黏性末端!
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键
磷酸二酯键形成
完全互补的黏性末端能通过氢键暂时连接在一起，但并不稳定。
而要形成重组DNA分子，还必须使基本骨架之间通过磷酸二酯键 “ 缝 ” 上，就像断成两截的梯子，不仅要把中间的踏板连接起来，还要把两边的扶手连接在一起一样 。
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
5’
3’
3’
5’
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
片段1
片段2
片段3
将片段1与片段2连接
将片段2与片段3连接
DNA连接酶
DNA连接酶种类
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
从大肠杆菌（Escherichia coli）
中分离得到的
从T4噬菌体中分离出来的
只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
两种都可以
但连接平末端的效率相对较低
记忆小技巧：
E谐音1
T为英文2的首字母
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
5’
3’
Bt基因
5’
3’
5’
3’
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
A1
A1
A1
B2
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
如果用DNA连接酶连接会出现哪些情况？
A1
A1
A1
B2
A1
A2
A3
B1
B2
目标
重组DNA分子
A2
B1
B2
和上面的还一样吗？
碱基序列不同
……会出现非常多种可能
怎么解决这个问题？
课堂活动
A2
还有可能出现环化等
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
课堂活动
——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果
第一步：按上图所示剪好两个大小相同的纸条并写上碱基序列
第二步：用EcoRⅠ酶切割这个DNA片段，展示结果
注：DNA连接酶无特异性，符合要求的DNA片段都能连接！
课堂活动
——体验用限制酶切割和DNA连接酶连接及可能出现的结果
哪些片段可以被DNA连接酶连接？
环化DNA片段是怎样的？
怎么避免该问题？
展示再用SpeⅠ限制酶切割后的片段
现在还会不会出现自身环化和反向连接等问题？
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
DNA连接酶:
一种能够将两个DNA片段连接起来的酶
DNA聚合酶:
将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上
温故而知新：
还记得DNA复制的过程吗？
1）解旋
在能量的驱动下，解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开，氢键断裂。
解旋酶
ATP
DNA复制过程:
2）合成引物（补充）
在引物酶的作用下，产生一小段RNA作为引物,后期引物会被切除
引物酶
引物
5’
3’
引物的作用简单理解就是引出DNA聚合酶，因为DNA聚合酶必须识别3’端才能结合上去。
3）合成子链
DNA聚合酶等以解开的每一条母链为模板，以游离的4种脱氧核苷酸为原料，按照碱基互补配对原则，各自合成与母链互补的一条子链。
模板
模板
DNA聚合酶
5’
3’
子链延伸方向
子链延伸方向
两条子链延伸方向相反，但都是从5’→3’
随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也在不断延伸。
子链
母链
母链
5’
3’
5’
3’
3’
3’
5’
5’
子链
4）重新螺旋
每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。
二
DNA连接酶 — “分子缝合针”
名称 作用部位 作用结果
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
DNA(水解)酶
解旋酶
磷酸二酯键
碱基对之间的氢键
将DNA切成两个片段
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
将双链DNA分子局部解旋为单链
小结：几种相关酶的比较
含有所需要基因的DNA分子
为什么要将所需基因插入该DNA中？它的作用是什么？
03
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
怎样才能将外源基因送入细胞呢？通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
通常是大型环状DNA携带着细菌的遗传信息，它的功能是决定遗传性状和传递遗传信息，是重要的遗传物质。
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
(2)作用不同：
拟核DNA是细菌的主要遗传物质，包含细菌生命活动的遗传信息，没有了它细菌就无法存活、繁殖；质粒DNA是附加的遗传物质，使生物表达一些特殊的性状，如耐药性、特定物质的降解能力等，如果没有了质粒细菌依然可以正常生活、繁殖。
(1)分子量不同：
拟核DNA分子量较大：质粒DNA分子量较小。如大肠杆菌细胞内的质粒仅为拟核DNA分子的1%-2%。
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
什么是质粒？
大肠杆菌细胞
拟核 DNA
质粒
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞（如酵母菌等）细胞核或原核细胞（如细菌等）拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
细菌中的拟核DNA与质粒DNA有什么差异和联系呢？
复制原点
氨苄青霉素抗性基因
（四环素抗性基因等）
便于重组DNA分子的筛选
外源DNA（基因）要能插入质粒，质粒还需要满足什么条件？
目的基因插入位点
（限制酶切割位点）
一个至多个
你能总结作为载体需具备的条件吗？
（1）有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中。
（2）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制。
（3）常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选。如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。
（4）易分离，对受体细胞无害。
在基因工程操作中，天然的载体很难满足上述全部要求，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不完全具备对载体的要求，例如缺少合适的限制酶切点(如限制酶切点在标记基因内)、缺少启动子和终止子等。因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。现在常用的质粒，都是早期利用天然质粒经历多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作为标记基因，便于筛选转化成功的细菌)、添加 MCS(多克隆位点)区域等。所谓添加MCS，是质粒中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点。有时为了提高转录效率，还会插入增强子；也有可能需要剔除对受体细胞有害的基因等。
天然质粒为什么要经过人工改造才能被用作载体？（了解）
载体都是质粒吗？
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
载体种类
质粒
动植物病毒
噬菌体
一种常用载体,大多数质粒的受体细胞是细菌。
受体细胞是细菌
受体细胞是动植物细胞
人工改造
“分子缝合针”
“分子运输车”
“分子手术刀”
三
基因进入受体细胞的载体 — “分子运输车”
实现这一精确的操作过程至少需要三种“分子工具”，即
准确切割DNA分子的“分子手术刀”
将DNA片段再连接起来的“分子缝合针”
将体外重组好的DNA分子导入受体细胞的“分子运输车”
总结：
限制酶
DNA连接酶
载体
抗虫棉
Bt抗虫蛋白
苏云金杆菌
取出
转移
通过本节的学习，现在你能描述如何使用这三种工具来获得抗虫棉吗？
学习了如何对DNA进行操作，大家想不想见一见我们的主角——DNA
四
DNA 的粗提取与鉴定
四
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。
（提取原理）
（提取原理）
（鉴定原理）
DNA
+
二苯胺
沸水浴
蓝色
四
DNA 的粗提取与鉴定
（一）实验原理
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA和蛋白质。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可作为鉴定DNA的试剂。
（二）目的要求
1.了解DNA的物理和化学性质，理解DNA粗提取和鉴定的原理。
2.学会DNA粗提取的方法以及用二苯胺试剂对DNA进行鉴定。
（三）材料用具
四
DNA 的粗提取与鉴定
（三）材料用具
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（三）材料用具
不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
新鲜洋葱（也可以选择香蕉、菠菜、菜花或猪肝等作为实验材料，提取DNA的方法可能稍有不同）
用洋葱做材料，为什么要充分研磨？
充分研磨，可以破坏细胞壁，裂解细胞，释放DNA。
猪血和鸡血，哪个适合用作提取DNA的材料？操作时如何防止血液凝固？
猪血（哺乳动物的成熟红细胞）无细胞核，不适合；
鸡血中红细胞有核DNA，且核DNA的量较多，适合。
鸡血中加入柠檬酸钠，可防止血液凝固。
如果用鸡血动物细胞做材料，也需要研磨裂解释放细胞中的DNA吗？
加入清水，让细胞吸水胀破，释放DNA。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨。
SDS（十二烷基疏酸钠）
可使蛋白质变性与DNA分离
EDTA（乙二胺四乙酸）
DNA酶抑制剂，可防止细胞破碎后DNA降解DNA
Tris（三羟甲基氨基甲烷）
提供缓冲体系，使DNA在缓冲体系中呈稳定状态
研磨液
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。也可直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
②低温放置几分钟的作用
可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；
抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少其断裂；
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；或将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
(1)搅拌时应轻缓、并沿一个方向
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
(2)酒精预冷的作用:
同“低温放置的作用”
四
DNA 的粗提取与鉴定
（四）实验步骤
取材、研磨
过滤
分离
鉴定
结果观察
(1)研磨的目的
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
(2)研磨时间不宜太长
防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量
(3)有条件的可以在材料处理的过程中加入纤维素酶、果胶酶
研磨效果好（有利于充分研磨）
(4)研磨不宜太用力
取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCI溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
实验组
对照组
水浴加热
加入2mol/L氯化钠溶液
不加入丝状物
加入4ml二苯胺试剂
P117
现配现用
易被空气氧化，颜色改变
四
DNA 的粗提取与鉴定
（五）结果分析与评价
1.你提取出白色丝状物或沉淀物了吗？用二苯胺试剂鉴定的结果如何？
观察提取的DNA的颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多。二苯胺试剂鉴定呈现蓝色说明实验基本成功；如果不呈现蓝色，可能的原因有所提取的DNA含量低，或者在实验操作过程中出现了失误等。
本实验粗提取的DNA可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
2.你能分析出粗提取的DNA中可能含有哪些杂质吗？
四
DNA 的粗提取与鉴定
（五）结果分析与评价
3.与其他同学提取的DNA进行比较，看看实验结果有何不同，分析产生差异的原因。
本实验可以采取分组的方式进行。可以选取不同的实验材料；也可以查阅资料了解其他提取DNA的方法，对同种材料采用不同的方法。最后从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺试剂显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
四
DNA 的粗提取与鉴定
（六）进一步探究
本实验只是对DNA进行了粗提取，请查阅资料，了解实验室提取纯度较高的DNA的一种方法，并与本实验中所使用的方法进行比较，总结两种方法的异同。
实验室提取纯度较高的DNA的方法有不少。例如，可以先添加质量分数为25%的SDS溶液，使蛋白质变性后与DNA分开；随后，加入氯仿—异丙醇混合液(体积比为24：1)，通过离心将蛋白质及其他杂质除去，取上清液；可重复上述操作几次，直至上清液变成透明的黏稠液体。此外由于苯酚可以迅速使蛋白质变性，抑制核酸酶的活性，因此还可以先用苯酚处理，然后离心分层，这时DNA溶于上层水相，蛋白质变性后存在于酚层中，用吸管、微量移液器等实验用具就可以将两者分开。
练习与应用
一、概念检测
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是 （ ）
A. 能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
练习与应用
一、概念检测
2. 在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是 （ ）
A. 大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
练习与应用
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
练习与应用
二、拓展应用
1. 想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
2．有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeⅠ进行切割，B片段分别用限制酶Hind Ⅲ、XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
A片段
B片段
练习与应用
二、拓展应用
练习与应用
二、拓展应用
A片段
B片段
（1）哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶SpeⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
XbaⅠ。
因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
练习与应用
二、拓展应用
A片段
B片段
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
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