3.2基因工程的基本操作程序（第1课时） 课件(共73张PPT+内嵌视频) -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3

(共73张PPT)
人教版·选择性必修3
第三章 基因工程
基因工程的基本操作程序
第2节
PCR扩增仪
2. 基因工程操作的每一步涉及的技术和方法有哪些
目录 /CONTENTS
1. 基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
转基因抗虫棉
非转基因抗虫棉
资料：1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉品种100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。
苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白(Bt 抗虫蛋白)，破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫(P76)
1.Bt抗虫蛋白的抗虫原理？
2.抗虫棉中的Bt抗虫蛋白会不会对人畜产生危害？
P77 [相关信息]
你知道转基因抗虫棉的机制是什么吗？培育转基因抗虫棉一般需要哪些步骤？
当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡
Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响
从社会中来
3.将目的基因导入受体细胞
苏云金杆菌
与载体拼接
普通棉花
（无抗虫特性）
棉花细胞
抗虫棉
提取
表达Bt基因
导入
Bt基因
重组DNA分子
1.目的基因的筛选与获取
2.基因表达载体的构建
4.目的基因的 检测与鉴定
基因工程的基本操作程序
从社会中来
基因工程的基本操作程序
将目的基因导入受体细胞
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达
（核心）
从课本中来
一
第一步：目的基因的筛选与获取
注意： 所有的基因都编码蛋白质或肽链。
基因的种类一般分为结构基因、转录基因和调控基因。
结构基因的功能：
具有转录和翻译功能，能控制生物性状（编码蛋白质或肽链）。
转录基因的功能：
只有转录功能，没有翻译功能。能转录形成tRNA和rRNA
调控基因的功能：
不能进行转录和翻译，只能调控其他基因的表达。
拓展：基因类型
目的基因的筛选与获取
一
不是
(1)概念：
在基因工程的设计和操作中，用于改变 性状或获得
等的基因。
(2)实例：
与生物抗逆性、优良品质、生产药物、
毒物降解和工业用酶等相关的基因。
主要指的是编码 的基因。
1、目的基因
资料：苏云金杆菌通过产生苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt 抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。
科学家将“杀虫基因”转入棉花中，棉花产生Bt 抗虫蛋白抵抗虫害。
目的基因
那么，如何筛选目的基因呢？
目的基因的筛选与获取
一
受体细胞
预期表达产物
蛋白质
课本P76
用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花虫害
也对Bt基因的表达产物——Bt 抗虫蛋白有了较为深入的了解
苏云金杆菌的杀虫作用与Bt 基因有关
不仅掌握了Bt 基因的序列信息
Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因
(1). 较为有效的方法之一：
从相关的 和 的基因中进行筛选
2、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
已知结构
功能清晰
二、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
(2)认识基因结构和功能的技术方法
课本P77
随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)、公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI等的应用，
越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
2、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
课本P77
DNA测序
序列数据库
（如GenBank）
序列比对工具
（如BLAST）
一
第一步：目的基因的筛选与获取
序列数据库（如GenBank）
序列数据库是分子生物信息数据库中最基本的数据库，包括核酸和蛋白质两类，以核苷酸碱基顺序或氨基酸残基顺序为基本内容，并附有注释信息。
2、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
一
第一步：目的基因的筛选与获取
序列比对工具（如BLAST）
BLAST全称Basic Local Alignment Search Tool，即“基于局部比对算法的搜索工具”，是生物信息学常用的工具软件，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。
二、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
mRNA
基因的一条链
科学家分离得到某原核生物基因，并将其解离成两条单链现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示
(1)原核生物基因
基因的编码区
基因的
非编码区
基因的
非编码区
基因的一条链
成熟mRNA
基因的编码区
基因的
非编码区
基因的
非编码区
(2)真核生物基因
科学家分离得到某真核生物基因，并将其解离成两条单链
现让其中一条链与由该基因转录而来的mRNA杂交配对，结果如图所示
目的基因的筛选与获取
一
资料2：基因结构
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某原核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
启动子：
给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
RNA聚合酶
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列
终止子：
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
启动子：启动子是RNA 聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA 序列
终止子：给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
某原核细胞基因
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
？如果该基因为真核细胞基因有什么不同？
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
某真核细胞基因
非编码区
非编码区
编码区
不编码mRNA
不编码mRNA
(编码mRNA)
启动子
终止子
RNA聚合酶
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
初始mRNA
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区（可转录）
启动子
终止子
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
1.外显子和内含子均会被 ，再经过切去 对应部位、连接 对应部位等RNA加工过程，形成可以直接用于翻译的mRNA
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
转录成RNA
内含子
外显子
2.外显子：
3.内含子：
编码蛋白质的序列称为外显子
外显子之间不能编码蛋白质的序列.
基因1 基因2 基因3
基因通常是有遗传效应的DNA片段
DNA片段
内含子
外显子
非编码区
编码区
启动子
终止子
真核生物基因
放大
启动子
终止子
原核生物基因
非编码区
非编码区
编码区
非编码区
目的基因的筛选与获取
一
知识归纳：基因结构
知识归纳：基因结构
编码区：
非编码区：
原核基因
真核基因
编码区
非编码区：
能转录相应的mRNA，进一步能编码蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
外显子：
内含子：
能转录相应的mRNA，不能编码蛋白质的DNA序列，
然后在翻译前就被剪切掉
能转录相应的mRNA，进一步能编码出蛋白质的DNA序列
不编码蛋白质，含有能调控遗传信息表达的DNA序列
(如启动子、终止子等）
目的基因的筛选与获取
一
内含子
外显子
启动子
终止子
不间隔的、连续的
非编码区
非编码区
编码区
启动子
终止子
(2)真核生物基因
(1)原核生物基因
非编码区
非编码区
编码区
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动转录
转录
前体mRNA
成熟mRNA
剪切、拼接
间隔的、不连续的
1
2
3
4
1
2
3
4
1
2
3
4
终止转录
真核生物的基因：
起始密码子和终止密码子？
不能编码蛋白质的序列
=非编码区+内含子
能编码蛋白质的序列
=外显子
RNA聚合酶识别并结合的位点，驱动基因转录出mRNA
启动子
终止子
是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因上游
也是一段有特殊序列结构的DNA片段
位于基因下游
终止转录
本质：
位置：
作用：
本质：
位置：
作用：
能转录相应的mRNA，
能转录相应的mRNA，
外显子:
内含子:
进一步能编码蛋白质的DNA序列
但却不能编码蛋白质的DNA序列
知识归纳：基因结构
目的基因的筛选与获取
一
【总结】原核细胞与真核细胞的基因结构比较
不能编码蛋白质的序列
=非编码区
原核生物的基因：
不能编码蛋白质的序列
真核生物的基因：
=非编码区+内含子
原核细胞 真核细胞
不同点 编码区是_____的 编码区是间隔的、_____的
相同点 都由能够编码蛋白质的________和具有调控作用的________区组成的 连续
不连续
编码区
非编码
知识归纳：基因结构
目的基因的筛选与获取
一
1.下列有关基因结构的叙述，正确的是（ ）
A.真核细胞的基因中，编码区也含有不能编码蛋白质的碱基序列，叫外显子
B.原核细胞的基因中，编码区的外显子是连续的
C.无论是真核还是原核生物，能编码蛋白质合成的序列均位于编码区
D.终止密码子是转录终止的信号，阻碍RNA聚合酶的移动
C
真核生物的基因结构:包括编码区和非编码区
(编码区又分为内含子和外显子，内含子转录后被剪切掉)
原核生物的基因结构:包括编码区和非编码区
(编码区无内含子和外显子之分，是连续的)
终止密码子位于mRNA上，作用是终止翻译的过程，而RNA聚合酶则是用于转录的酶
当堂检测
2、筛选合适的目的基因
目的基因的筛选与获取
一
(2)认识基因结构和功能的技术方法
课本P77
随着测序技术的发展，以及序列数据库(GenBank)、序列比对工具(如BLAST)、公共生物医学数据库、分析分子及基因组数据的软件工具NCBI等的应用，
越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。
明确了目的基因后，该怎么获得它呢？
一
第一步：目的基因的筛选与获取
人工合成
从基因文库中获取
利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
3.获取目的基因的方法
先对目的基因进行扩增
获得目的基因后是否就该立即开始准备转基因操作？
抗虫基因
快速获得大量抗虫基因
苏云金杆菌
提取
目的基因的筛选与获取
一
思考:
课本P77
(1)人工合成目的基因
DNA合成仪
①前提：
②方法：
3 获取目的基因的方法
目的基因的筛选与获取
一
基因比较 、
核苷酸序列 。
小
已知
通过DNA合成仪用化学方法直接合成目的基因
【思考】若不明确基因碱基序列呢？
蛋白质氨基酸序列
mRNA序列
基因序列
反转录法
(1)人工合成目的基因
目的基因的筛选与获取
一
DNA
合
成
仪
(1)人工合成目的基因
目的基因的筛选与获取
一
(2)从基因文库中直接获取
将含有某种生物不同基因的许多 片段，导入 的群体中 ，各个受体菌分别含有这种生物的 ，称为基因文库
(主要指cDNA文库)
基因文库
基因组文库
部分基因文库
3 获取目的基因的方法
目的基因的筛选与获取
一
DNA
储存
不同基因
受体菌
一
第一步：目的基因的筛选与获取
——获取
某种生物体内的 DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
目的基因的筛选与获取
一
①基因组文库
全部
一
第一步：目的基因的筛选与获取
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
——获取
目的基因的筛选与获取
一
①基因组文库
一
第一步：目的基因的筛选与获取
受体菌
导入受体菌
每个受体菌都含有了一段不同的 。这个群体包含了这种生物的所有基因，叫做这种生物的基因组文库。
该受体菌群为基因组文库
——获取
目的基因的筛选与获取
一
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
DNA片段
①基因组文库
一
第一步：目的基因的筛选与获取
②cDNA文库
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的 。
某种生物体内的全部DNA
某个时期
基因选择性表达
转录
转录
转录
转录
mRNA
翻译
翻译
翻译
翻译
蛋白质
——获取
目的基因的筛选与获取
一
反转录
cDNA文库
包含某种生物 基因
部分
cDNA文库
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA(也叫cDNA)片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就叫做这种生物的cDNA文库。
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
mRNA
翻译
蛋白质
某原核细胞基因
反转录
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC
CA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG ……
GT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC ……
cDNA
复制
双链DNA
受体菌
无启动子、终止子等非编码区
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
目的基因的筛选与获取
一
基因结构
--ATGCATGCAT…… CGATCGTAGCCA …… TCCCTAAGGATAG CCATCCCAGATG …… CATGCATCCATGC---
--TACGTACGTA ……GCTAGCATCGGT…… AGGGATTCCTATC GGTAGGGTCTAC …… GTACGTAGGTACG---
非编码区
非编码区
编码区
(编码mRNA)
启动子
终止子
CA …… UCCCUAAGGAUAG CCAUCCCAGAUG
转录
某真核细胞基因
外显子
内含子
外显子
内含子
外显子
RNA加工
CA …… UAGGAUCCAGAUG
翻译
蛋白质
初始mRNA
成熟mRNA
反转录
GT …… ATCCTAGGTCTAC
GT …… ATCCTAGGTCTAC
CA …… TAGGATCCAGATG
复制
受体菌
无启动子、终止子等非编码区及无内含子
基因结构
部分基因文库和基因组文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子(非编码区)
基因中内含子
基因多少
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
使用cDNA文库获得目的基因更加高效，除去了不能编码蛋白质的序列(如非编码区、内含子)
目的基因的筛选与获取
一
(2)从基因文库中直接获取
3 获取目的基因的方法
一
第一步：目的基因的筛选与获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
目的基因的筛选与获取
一
(2)从基因文库中直接获取
3 获取目的基因的方法
一
第一步：目的基因的筛选与获取
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（了解）
基因组文库
cDNA文库
某种生物体内的全部DNA
适当的不同限制酶切割
与质粒连接
受体菌
导入受体菌
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢？
这还是一件比较复杂的事情，简单地说就是根据目的基因的有关信息，例如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA 以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。
目的基因的筛选与获取
一
(2)从基因文库中直接获取
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
PCR由穆里斯等人（先入为主）于1985年发明，为此，穆里斯于1993年获得诺贝尔化学奖 如果说，沃森和克里克发现DNA双螺旋结构，标志着分子生物学时代的开启，那么PCR技术则标志着分子生物学的腾飞。PCR技术的出现，彻底变革了生物化学、分子生物学、遗传学、以及现代医学等。
目的基因的筛选与获取
一
3 获取目的基因的方法
穆里斯
合作探究：请同学们自主阅读教材P76-77，小组合作思考讨论完成问题。
1.总结出PCR的概念、原理、目的、优点。
2.结合体内DNA复制过程，思考PCR的进行需要哪些条件？所需设备是什么？
3.构建出PCR的大致过程。
4.PCR扩增为什么需要引物？
5.如何对产物进行鉴定？
6. PCR技术与DNA复制过程比较？
目的基因的筛选与获取
一
3 获取目的基因的方法
PCR技术：
PCR是_______________的缩写，是一项根据________________
的原理，在_____提供参与DNA复制的_________与_________，对______________________进行_________的技术
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外
各种组分
反应条件
目的基因的核苷酸序列
大量复制
聚合酶链式反应
DNA半保留复制
体外（PCR扩增仪/PCR仪）
对目的基因的核苷酸序列进行大量复制
原理
操作环境
目的
全称
PCR扩增仪
目的基因的筛选与获取
一
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
【重温】DNA体内复制的过程及条件
合成子链
解旋
形成新DNA
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链
4种脱氧核苷酸
解旋酶
DNA聚合酶
引物
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
打开DNA双链
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
目的基因的筛选与获取
一
3′
5′
DNA的合成方向：
DNA聚合酶
3′
5′
模板链
子链
因为DNA聚合酶不能直接将单个的核苷酸聚合成链
原因：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有链的3′-端
子链合成需要引物：
从子链的5 ′端向3 ′端延伸
【重温】DNA体内复制的过程及条件
目的基因的筛选与获取
一
引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
3’
5’
引物1
3’
5’
引物2
引物:
3’
5’
DNA母链1
3’
5’
DNA母链2
引物可以是DNA单链，也可以为RNA单链
·细胞内的DNA复制通常以RNA单链为引物
·细胞外（PCR）一般以DNA单链为引物
用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸
引物结合在模板链的3’端
目的基因的筛选与获取
一
参与的组分 在DNA复制中的作用
打开DNA双链
提供DNA复制的模板
合成DNA子链的原料
催化合成DNA子链
使DNA聚合酶能够从引物的3’端
开始连接脱氧核苷酸
缓冲液（含Mg2+）
DNA母链
4种脱氧核苷酸
90℃以上高温
耐高温的DNA聚合酶
引物
激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶
（2种）
不同的温度：变性、复性和延伸需要不同温度
（Taq 酶）
4.PCR技术
课本P77-79
(1)DNA体外复制（PCR）的条件
目的基因的筛选与获取
一
微量离心管
缓冲液
PCR反应需要在一定的缓冲溶液中才能进行。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+ 。
DNA模板
四种脱氧核苷酸(dNTP)
引物
分别与两条模板链结合的2种引物
耐高温的DNA聚合酶
（Taq酶）
目的基因的筛选与获取
一
Mg2+
微量离心管
缓冲液
离心处理后
目的基因的筛选与获取
一
缓冲液
目的基因的筛选与获取
一
(2)PCR反应过程
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
A.变性
当温度上升到 以上时，双链DNA解聚为 。
B.复性
当温度下降到 左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
C.延伸
当温度上升到 左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的 的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
4.PCR技术
目的基因的筛选与获取
一
90℃
单链
50℃
72℃
DNA聚合酶
第一轮循环的产物作为第二轮反应的 ，经过 和
三步产生第二轮循环的产物
第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮的产物
第二轮循环的产物
第三轮循环的产物
完成以后，常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物
4.PCR技术
目的基因的筛选与获取
一
(2)PCR反应过程
模板
变性、复性
延伸
一
——获取
a、变性（超过90℃）：双链DNA模板在热作用下， 断裂，形成 。
b、复性（下降到50℃）：系统温度降低，引物与DNA模板通过碱基互补配对，形成局部 。
c、延伸（上升到72℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，溶液中的的 在 的作用下，根据碱基互补配对原则，合成与模板互补的 的新的DNA链。
氢键
单链DNA
双链
4种脱氧核苷酸
5′端→3′端
耐高温的DNA聚合酶
过程归纳：
4.PCR技术
目的基因的筛选与获取
一
(2)PCR反应过程
P77-79
利用PCR技术扩增目的基因，在第几次循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(即出现完整的目的基因)？
第三次循环
目的基因的筛选与获取
一
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
合作探究1:
3’
5’
目的基因
目的基因
第
一
次
循
环
90℃以上，DNA双链解开
50℃左右，引物与DNA结合
72℃左右，新DNA合成
3’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
目的基因的筛选与获取
一
第
二次
循
环
5’
3’
5’
5’
3’
5’
高温变性、低温复性
目的基因的筛选与获取
一
中温延伸
第
二次
循
环
3’
5’
高温变性、低温复性
目的基因的筛选与获取
一
第
三次
循
环
3’
5’
中温延伸
目的基因的筛选与获取
一
第
三次
循
环
3’
5’
目的基因
目的基因
目的基因的筛选与获取
一
第一轮循环
第二轮循环
第三轮循环
3’
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
非目的基因序列
目的基因序列
引物
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
P77-79
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数
含引物的DNA分子数
DNA链数目
共消耗引物的个数
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数
2
2
2
0
4
4
6
0
8
8
14
2
2n
2n
2n+1-2
2n-2n
呈指数形式扩增（ n次扩增循环后，DNA数量约为2n）
PCR结果：
4
8
16
2n+1
目的基因的筛选与获取
一
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
设计引物的要求：
①引物自身 有互补序列
②引物之间 有互补序列
③引物长度要 。
④引物能与目的基因两侧特异性 。
……
防止引物自身互补折叠
防止两引物之间配对，导致引物不能各自同模板链结合
【拓展】设计引物的注意事项
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
不能
不能
适宜
结合
设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ′自身内部部分碱基发生互补配对而失效
思考讨论
目的基因的筛选与获取
一
思考：用PCR可以扩增mRNA吗？
mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增
（逆转录PCR，简称RT-PCR ）
①逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子
②核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA
③以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，
形成双链DNA分子，即cDNA
3 获取目的基因的方法
★(3)利用PCR获取和扩增目的基因
目的基因的筛选与获取
一
缓冲液
4.PCR技术
目的基因的筛选与获取
一
比较项目 细胞内DNA复制 PCR技术
区别 解旋方式
场所
酶
温度
结果
联系 解旋酶催化
主要在细胞核内
解旋酶、DNA聚合酶等
细胞内温和条件
合成整个DNA分子
①模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板
②原料：均为四种脱氧核苷酸
③酶：均需DNA聚合酶
④引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物开始进行互补链的合成
DNA在高温下变性解旋
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
耐高温的DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）
控制温度，需在不同温度下进行
扩增特定的DNA片段或基因
在PCR过程中实际加入的为dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP），既可提供合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量
脱氧核苷三磷酸
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供，无需添加ATP
PCR技术与细胞内DNA复制的比较
(1)PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 （　 　）
(2)PCR扩增技术中，需用解旋酶使双链DNA解聚 （　 　）
(3)PCR过程使用的DNA聚合酶的特点是耐高温 （　 　）
(4)PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高 （　 ）
(5)PCR扩增过程中，需要添加ATP为新链合成提供能量（ ）
(6)PCR扩增过程中，通过温度变化的控制为变性、复性和延伸等过程提供能量（ ）
1.判断常考语句，澄清易混易错
温度不能为变性、复性和延伸等过程提供能量
PCR技术扩增时需要能量，所需要的能量可由dNTP提供
当堂检测
2.下列属于PCR技术所需条件的是（ ）
①单链的核苷酸序列引物　
②目的基因所在的DNA片段
③脱氧核苷酸　④核糖核苷酸　⑤DNA连接酶　
⑥DNA聚合酶　⑦限制酶
A.①②③⑤ B.①②③⑥ C.①②③⑤⑦ D.①②④⑤⑦
B
当堂检测
感谢观看