3.2基因工程的基本操作程序（第2课时） 课件(共52张PPT+内嵌视频) -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.2基因工程的基本操作程序（第2课时） 课件(共52张PPT+内嵌视频) -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 177.7MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-03-03 00:00:00 | ||
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文档简介
(共52张PPT)
人教版·选择性必修3
第三章 基因工程
基因工程的基本操作程序
第2节
PCR扩增仪
第2课时
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
学习回顾：PCR扩增目的基因的过程
P80
获得足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？
核心工作
基因表达载体的构建
二
思考讨论
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
合作探究1：请同学们自主阅读教材P80，小组合作思考讨论完成问题。
1.基因表达载体的构建的目的？
载体还需要哪些结构？
各个元件有什么作用？
2.目的基因插入什么位置？
目的基因插入位点是随意的吗？
3.请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
4.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？
如果不能，怎么改进？
基因表达载体的构建
二
核心工作
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
④复制原点
⑤目的基因
问题: 目的基因该插入什么位置？
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
1.基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以 .
2.基因表达载体的组成
②同时使目的基因能够 和 。
稳定存在
遗传给下一代
表达
发挥作用
问题：作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
基因表达载体的构建
二
核心工作
P80
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
基因表达载体的构建
二
核心工作
问题: 目的基因该插入什么位置？
2.基因表达载体的组成
启动子与终止子位于DNA分子中，
作用：起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，
作用：起始和终止翻译过程。
问题：辨析“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
问题: 请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
基因表达载体的构建
二
核心工作
2.基因表达载体的组成
问题: 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
3.基因表达载体构建过程
基因表达载体的构建
二
核心工作
问题: 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？
有何缺点？怎么改进？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
单酶切缺点：
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
问题:如何解决这一问题？
双酶切
3.基因表达载体构建过程
基因表达载体的构建
二
核心工作
1.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 ( )
A B C D
当堂检测
A
2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( )
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
当堂检测
A
3.构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，应用______________________两种不同限制酶的来分别切割载体和目的基因。
Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ
当堂检测
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （ ）
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （ ）
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因 （ ）
4.判断常考语句，澄清易混易错
当堂检测
5.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
当堂检测
合作探究2：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题
1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？
各自适用于什么生物？
2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。
3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。
将目的基因导入受体细胞
三
植物细胞
微生物细胞
动物细胞
Ca2+转化法
病毒介导法
显微注射法
农杆菌转化法
花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入受体细胞的方法
(常用)
P81
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
农杆菌
是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等
目的基因进入 细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和 的过程。实质是 。
转化：
受体
基因重组
表达
P81
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
P81
农杆菌特点及原理：
·能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。
·农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
②受体细胞：
农杆菌Ti质粒
主要是双子叶植物和裸子植物
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
将目的基因导入受体细胞
三
①载体：
P81
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
③过程
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
农杆菌
基因表达载体
构建
转入
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
（2）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
2.将目的基因导入动物细胞
（1）显微注射法：
P82
①受体细胞：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
②过程：
受精卵
将目的基因导入受体细胞
三
①体积大，易操作；
②全能性高，易培养成完整个体。
（2）病毒介导法
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
2.将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
P82
(2)受体细胞：
Ca2+处理法
常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
(3)过程：
大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
CaCl2(Ca2+)
将目的基因导入受体细胞
三
P82
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
3.将目的基因导入微生物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞 -
转化过程 目的基因插入Ti质粒的 T-DNA上→ 农杆菌（Ca2+处理）→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
【小结】
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受精卵
常用原核细胞
将目的基因导入受体细胞
三
3.将目的基因导入微生物细胞
我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是（ ）
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
当堂检测
D
问题：将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
目的基因的检测与鉴定
四
讨论：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
1.目的：
2.检测内容及方法：
目的基因的检测与鉴定
四
DNA分子杂交技术
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
目的基因的检测与鉴定
四
(1).分子水平的检测
2.检测内容及方法：
①基因是否插入染色体DNA
基本思路：
①基因是否插入染色体DNA
PCR技术
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker； 1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
15N
思考：DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
目的基因的检测与鉴定
四
(1).分子水平的检测
2.检测内容及方法：
方法：PCR扩增和分子杂交技术
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
② 目的基因是否转录
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
基本思路：
PCR技术
② 目的基因是否转录
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
(1).分子水平的检测
③目的基因是否翻译
抗原-抗体杂交技术
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
苏云金杆菌
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
(2)个体水平：
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
利用PCR获取和扩增
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物);
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
◎课堂小结
1.实验原理
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_________原理，通过 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历 循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了 的原理；
DNA半保留复制
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
课本P84-85
①DNA分子具有_______________，在一定的_____下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_______的作用下，这些__________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_______
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_________________来鉴定
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、________________和______等有关
④凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为________的_______下被检测出来
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
2.材料用具
课本P84-85
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
PCR仪
微量离心管
电泳装置
微量移液器
自动控温，实现DNA的扩增
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
包括电泳仪、电泳槽等
2.材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28--33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1--2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5--10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
2.材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
3.方法步骤
课本P84-85
(1)DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
预变性：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
④ 配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
⑤制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
梳子孔为加样孔，
加样孔侧连电极负极
3.方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
⑧加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)
⑨电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑩观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
3.方法步骤
DNA片段的电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使
用前必须进行 处理
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须
。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
实验注意事项:
高压灭菌
更换
课本P84-85
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该图示片段大小约为750bp
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
4.结果分析与评价
A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因
1. 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（ ）
B
9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株
当堂检测
2.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
当堂检测
感谢观看
人教版·选择性必修3
第三章 基因工程
基因工程的基本操作程序
第2节
PCR扩增仪
第2课时
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）
4种脱氧核苷酸（dNTP）
引物
待扩增的DNA片段（模板）
5’
5’
变性
复性
延伸
温度上升到90℃以上，双链DNA解聚为单链
当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
温度上升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。
学习回顾：PCR扩增目的基因的过程
P80
获得足量的目的基因后，是否能直接将目的基因导入受体细胞呢？
核心工作
基因表达载体的构建
二
思考讨论
就算可以进行转录和翻译成蛋白质，游离的DNA片段也无法随着细胞分裂进行复制，导致子代细胞不再含有目的基因
游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解
不能原因
那怎样才能让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代呢？
合作探究1：请同学们自主阅读教材P80，小组合作思考讨论完成问题。
1.基因表达载体的构建的目的？
载体还需要哪些结构？
各个元件有什么作用？
2.目的基因插入什么位置？
目的基因插入位点是随意的吗？
3.请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
4.使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？
如果不能，怎么改进？
基因表达载体的构建
二
核心工作
质粒
①启动子
基因的前端，RNA聚合酶识别和结合的部位；驱动基因转录出mRNA
②终止子：
限制酶切割位点
基因的尾端，能终止mRNA的转录
③标记基因
④复制原点
⑤目的基因
问题: 目的基因该插入什么位置？
用来鉴别或筛选含有重组DNA分子的细胞
1.基因表达载体构建的目的
①让目的基因在受体细胞中 ，并且可以 .
2.基因表达载体的组成
②同时使目的基因能够 和 。
稳定存在
遗传给下一代
表达
发挥作用
问题：作为基因表达载体，除了目的基因外，还需要哪些元件呢？
基因表达载体的构建
二
核心工作
P80
目的基因插入位点不是随意的：基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入 ，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
启动子和终止子之间的部位
诱导型启动子
诱导物
作用
激活或抑制
目的基因表达
诱导型启动子：
基因表达载体的构建
二
核心工作
问题: 目的基因该插入什么位置？
2.基因表达载体的组成
启动子与终止子位于DNA分子中，
作用：起始和终止转录过程。
启动密码子与终止密码子位于mRNA分子中，
作用：起始和终止翻译过程。
问题：辨析“启动子与终止子”和“起始密码子与终止密码子”
问题: 请文字和箭头表示基因表达载体的构建过程。
基因表达载体的构建
二
核心工作
2.基因表达载体的组成
问题: 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？有何缺点？怎么改进？
同种限制酶或产生相同黏性末端的限制酶切割
DNA
连接酶
目的基因
限制酶切割位点
获取目的基因
限制酶切割位点
质粒
重组
DNA分子
限制酶
限制酶
3.基因表达载体构建过程
基因表达载体的构建
二
核心工作
问题: 使用一种DNA限制酶进行切割，是否只会得到一种重组DNA？
有何缺点？怎么改进？
载体
目的基因
自连
片段间的连接
目的基因自连
质粒自连
目的基因与质粒连接
目的基因与目的基因连接
质粒与质粒连接
正向连接 反向连接
1
1’
2
2’
1
2
2’
1’
2
2’
1’
1
单酶切缺点：
①质粒、目的基因自身环化；②质粒与目的基因反向连接
问题:如何解决这一问题？
双酶切
3.基因表达载体构建过程
基因表达载体的构建
二
核心工作
1.某目基因两侧的 DNA序列所含的限制酶酶切位点如图所示,下列可作该目的基因最佳载体的是 ( )
A B C D
当堂检测
A
2.下列关于基因表达载体的叙述不正确的是( )
A.启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码
B.启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用
C.标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选
D.基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别
当堂检测
A
3.构建基因表达载体：为使目的基因与载体正确连接，应用______________________两种不同限制酶的来分别切割载体和目的基因。
Pvit Ⅱ和EcoR Ⅰ
当堂检测
(1)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取 （ ）
(2)基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子 （ ）
(3)标记基因不一定是抗生素抗性基因 （ ）
4.判断常考语句，澄清易混易错
当堂检测
5.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，Amp R表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述错误的是 ( )
A．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B．在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C．若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D．导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
D
当堂检测
合作探究2：请同学们自主阅读教材P81，小组合作思考讨论完成问题
1.总结将目的基因导入受体细胞的方法有哪些？
各自适用于什么生物？
2.农杆菌的特点？农杆菌转化法的原理。
3.请文字和箭头表示农杆菌转化法的过程。
将目的基因导入受体细胞
三
植物细胞
微生物细胞
动物细胞
Ca2+转化法
病毒介导法
显微注射法
农杆菌转化法
花粉管通道法
将目的基因导入受体细胞
三
将目的基因导入受体细胞的方法
(常用)
P81
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
农杆菌
是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物和裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤等
目的基因进入 细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和 的过程。实质是 。
转化：
受体
基因重组
表达
P81
科学研究发现，当植物体受到损伤时，伤口处的细胞会分泌大量的酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞，这时农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移至受体细胞染色体的DNA上。这种酚类化合物主要在双子叶植物细胞壁中合成，单子叶植物通常没有
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
为什么农杆菌容易感染双子叶植物？
P81
农杆菌特点及原理：
·能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物。
·农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
②受体细胞：
农杆菌Ti质粒
主要是双子叶植物和裸子植物
随着转化方法的突破，农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
将目的基因导入受体细胞
三
①载体：
P81
构建表 达载体
含目的基因的重组Ti质粒
表现出新性状的植株
导入植物
细胞
植物细胞
将目的基因插入染色体DNA中
目的基因
Ti质粒
T-DNA
含重组Ti质粒的农杆菌
转入农杆菌
③过程
农杆菌转化法示意图
Ti质粒
目的基因
农杆菌
基因表达载体
构建
转入
导入
植物细胞
T-DNA携带目的基因插入植物细胞染色体DNA中
表达
新性状
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
目的基因
Ti质粒
表
达
载
体
农杆菌
植物细胞
植物细胞
染色体DNA
新性状植株
构建
转入
导入
插入
表达
③过程：
1.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法
将目的基因导入受体细胞
三
（2）花粉管通道法（我国科学家独创）
方法2：在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
方法1：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中
目的基因
目的基因
适用生物：开花植物
1.将目的基因导入植物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
2.将目的基因导入动物细胞
（1）显微注射法：
P82
①受体细胞：
为什么常选用受精卵作为受体细胞呢？
构建基因表达载体并提纯
利用显微注射将基因表达载体注入动物的受精卵中
早期胚胎培养
胚胎移植
获得具有新性状的动物
②过程：
受精卵
将目的基因导入受体细胞
三
①体积大，易操作；
②全能性高，易培养成完整个体。
（2）病毒介导法
科学家也用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内。如用腺病毒载体，搭载新冠病毒S基因，进入人体内，使人体产生对S蛋白的免疫记忆。
2.将目的基因导入动物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
3.将目的基因导入微生物细胞
(1)常用方法：
P82
(2)受体细胞：
Ca2+处理法
常选择原核细胞（其中以大肠杆菌应用最为广泛）
目的：可使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
优点：繁殖快，多为单细胞，遗传物质相对较少，易于培养
(3)过程：
大肠杆菌
使细胞处于一种能吸收周围环境DNA分子的生理状态
溶于缓冲液中的重组DNA分子
转化
CaCl2(Ca2+)
将目的基因导入受体细胞
三
P82
原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
实例：利用转基因大肠杆菌生产药物
3.将目的基因导入微生物细胞
将目的基因导入受体细胞
三
种类项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法
受体细胞 -
转化过程 目的基因插入Ti质粒的 T-DNA上→ 农杆菌（Ca2+处理）→ 导入植物细胞→ 整合到受体细胞DNA中→表达 目的基因表达载体提纯→取受精卵→ 显微注射→ 受精卵发育→ 获得具有新性状的动物 Ca2＋处理细胞→
感受态细胞→
表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
【小结】
农杆菌转化法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2＋处理法
受精卵
常用原核细胞
将目的基因导入受体细胞
三
3.将目的基因导入微生物细胞
我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是（ ）
A.不必构建表达载体就可以直接导入
B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞
D.有时可以取代农杆菌转化法
当堂检测
D
问题：将表达载体导入受体细胞后，如何判断导入是否成功？即使导入成功，如何判断目的基因是否可以正常表达？
请大家回顾基因表达的过程，推测可以从哪些方面进行检测与鉴定？
目的基因的检测与鉴定
四
讨论：
检测目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性
类型 检测内容 方法
分子水平的检测
个体生物学水平的鉴定
受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因
目的基因是否转录出了mRNA
PCR等技术
目的基因是否翻译成蛋白质
抗原-抗体杂交技术
个体是否具有相应性状
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
1.目的：
2.检测内容及方法：
目的基因的检测与鉴定
四
DNA分子杂交技术
方法：PCR扩增和DNA分子杂交技术
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部DNA，与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现杂交DNA片段。
目的基因的检测与鉴定
四
(1).分子水平的检测
2.检测内容及方法：
①基因是否插入染色体DNA
基本思路：
①基因是否插入染色体DNA
PCR技术
转基因生物
提取DNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
M：marker； 1-阳性质粒；
2：原始品系；3-9转Bt品系；
转Bt基因品系PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
转基因生
物的DNA
探针
15N
变性
变性
15N
思考：DNA分子杂交检测目的基因的原理是什么？
碱基互补配对原则
杂交DNA分子（可检测）
目的基因的检测与鉴定
四
(1).分子水平的检测
2.检测内容及方法：
方法：PCR扩增和分子杂交技术
1.制作出与目的基因序列相同的有同位素标记的DNA片段，并用PCR扩增（基因探针）
2、提取受体细胞全部RNA，直接与基因探针置于同一培养液。或先将RNA逆转录为cDNA，再与基因探针置于同一培养液。
3、高温变性处理，使之全部变为单链，观察是否出现分子杂交片段。
② 目的基因是否转录
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
基本思路：
PCR技术
② 目的基因是否转录
转基因生物
PCR操作
是否扩增出目的基因
逆转录
cDNA
提取RNA
mRNA作为模板
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
(1).分子水平的检测
③目的基因是否翻译
抗原-抗体杂交技术
提取
Bt毒蛋白
注射小鼠体内
抗体
标记抗体
提取蛋白
电泳分离
抗原
抗体
杂交
脱分化
苏云金杆菌
(1).分子水平的检测
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
转基因生物 鉴定方法 成功标志
抗虫植物
抗病毒（菌）植物
抗盐植物
抗除草剂植物
饲喂害虫（抗虫接种实验）
害虫死亡
病毒（菌）感染（抗病接种实验）
未出现病斑
盐水浇灌
正常生长
喷洒除草剂
正常生长
(2)个体水平：
目的基因的检测与鉴定
四
2.检测内容及方法：
抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等
基因工程的基本操作程序
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
第一步
第二步
第三步
第四步
目的基因的检测与鉴定
前提
核心
关键
保证
利用PCR获取和扩增
目的基因、启动子、终止子、标记基因
农杆菌转化法(植物)、显微注射法(动物) 、 感受态细胞转化法(微生物);
分子检测：是否插入、转录、翻译
个体水平：是否具有抗性以及抗性强度等。
◎课堂小结
1.实验原理
(1)利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理
①PCR利用了DNA的_________原理，通过 来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够________________的仪器，一次PCR一般要经历 循环；
热变性
调节温度
自动调控温度
30
②PCR扩增DNA片段还利用了 的原理；
DNA半保留复制
课本P84-85
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
探究 实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.实验原理
(2)DNA片段电泳鉴定的原理
课本P84-85
①DNA分子具有_______________，在一定的_____下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在_______的作用下，这些__________会向着____________________的电极移动，这个过程就是_______
可解离的基团
pH
电场
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
②PCR的产物一般通过_________________来鉴定
③在凝胶中DNA分子的迁移速率与____________、________________和______等有关
④凝胶中的DNA分子通过______，可以在波长为________的_______下被检测出来
琼脂糖凝胶电泳
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
DNA分子在一定pH的缓冲液中可以带负电荷，在电场中DNA便向正极端移动
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
2.材料用具
课本P84-85
①PCR仪（自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管（实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器（用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
PCR仪
微量离心管
电泳装置
微量移液器
自动控温，实现DNA的扩增
实际上是进行PCR反应的场所
用于向微量离心管转移PCR配方中的液体
包括电泳仪、电泳槽等
2.材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28--33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1--2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5--10μL
总体积 50μL
⑧PCR反应体系的配方
⑥4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水
⑦电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等
2.材料用具
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
3.方法步骤
课本P84-85
(1)DNA片段的扩增
①移液：
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分
②离心：
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）
③反应：
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合
预变性：
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
④ 配制琼脂糖溶液
根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀
⑤制备凝胶
A.将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔
C.将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜
B.待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内
梳子孔为加样孔，
加样孔侧连电极负极
3.方法步骤
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
(2)DNA片段的电泳鉴定
⑧加样
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物(Marker)
⑨电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm，待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
⑩观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
3.方法步骤
DNA片段的电泳鉴定
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
课本P84-85
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使
用前必须进行 处理
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须
。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
实验注意事项:
高压灭菌
更换
课本P84-85
(1)你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？
可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带，该图示片段大小约为750bp
如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。
(2)你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
DNA片段的扩增及电泳鉴定
探究 实践
4.结果分析与评价
A. PCR产物的分子大小在250至500bp之间
B. 3号样品为不含目的基因的载体DNA
C. 9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D. 10号的电泳结果能确定反应体系等对实验结果没有干扰
3号PCR结果包含250~500bp片段，应包含目的基因
1. 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到如图所示电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水。PCR时加入的模板DNA如图所示。据此做出分析不合理的是（ ）
B
9号PCR结果不包含250~50bp片段，所以不是所需转基因植株
当堂检测
2.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
C
当堂检测
感谢观看