3.2基因工程的基本操作程序（第2课时） 课件(共26张PPT)-2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.2基因工程的基本操作程序（第2课时） 课件(共26张PPT)-2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 8.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-03-07 00:00:00 | ||
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文档简介
(共26张PPT)
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
第3章 基因工程
选择性必修三 生物技术与工程
目录
CONTENT
01
新课导入
02
任务探究
03
第2节 基因工程的基本操作程序
第二课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
课堂练习
旧知回顾
新课导入
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内__________和_____的过程
受体细胞
维持稳定
表达
（二）将目的基因导入受体细胞的方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2+转化法
（我国科学家独创）
（一）转化的概念
（常用）
（单子叶植物常用）
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】1.阅读课本80页第4段和81页，明确转化的概念是什么？将目的基因转入受体细胞的方法有哪些？
任务探究
三、将目的基因导入受体细胞
1.操作方法
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
2.实例
我国“转基因抗虫棉”
3.优缺点
简便经济（优点）
要求花朵较大（缺点）
花粉管通道法
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理
能在自然条件下感染_______植物和_______植物，对大多数单子叶植物______________。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种__________植物也取得了成功。
双子叶
裸子
没有感染能力
单子叶
2.转化原理
农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的 _______可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的_____________。
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA上
[思考]构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？
T-DNA
（可转移的DNA）
农杆菌转化法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
1.农杆菌的特点：
3.转化过程
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
①两次拼接
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。
第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
②两次导入
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
将含目的基因的表达载体提纯
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
【补充】病毒侵染法
受精卵
显微 注射
含目的基因的受精卵
具有新性状的动物
雌性动物输卵管或子宫
胚胎移植
早期胚胎
显微注射法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
Ca2+处理大肠杆菌细胞
感受态细胞
细胞吸收DNA分子
基因表达载体与感受态细胞混合
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
Ca2+转化法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
【小结】将目的基因导入受体细胞核心方法比较
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
三、将目的基因导入受体细胞
1.检测目的基因是否插入受体细胞
方法①：PCR扩增技术
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
转基因生物
提取DNA
/mRNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
PCR技术或分子杂交技术
DNA半保留复制
原理：
四、目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
1.检测目的基因是否插入受体细胞
方法②：分子杂交技术
是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
碱基互补配对
原理：
PCR技术或分子杂交技术
基因探针
分子水平的检测
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
1.检测目的基因是否插入受体细胞
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR技术或分子杂交技术
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原— 抗体杂交技术
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
抗原与抗体的特异性结合
原理：
分子水平的检测
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
抗性检测：
功能活性比较：
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
—检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
抗虫、抗病接种实验
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
接种
棉铃虫
个体生物学水平鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
【小结】目的基因的检测与鉴定
分子水平检测
个体生物学水平鉴定
1.检测目的基因是否插入受体细胞
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR技术或分子杂交技术
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原— 抗体杂交技术
检测是否具有抗性（抗虫、抗病接种实验）以及抗性强度等
四、目的基因的检测与鉴定
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
基因工程的基本操作步骤
基因工程的基本操作流程图
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
[活动]自主阅读书本P84-85，完成以下填空，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理。
实验原理
1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理
PCR利用了_________________和________________的原理。
DNA的热变性原理
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有____________，在一定的____下，这些基团可以带上____________，在_____的作用下，这些_________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____。
可解离的基团
pH
正电荷或负电荷
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
电场
在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、_______________和_____等有关。
凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的________下被检测出来。
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
材料用具
1.试剂
（1）4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
（2）电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
（3）PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.用具
①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
材料用具
实验步骤
1.DNA片段扩增的具体过程
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
2.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程
制备凝胶
①融化
②倒模
③凝固
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
①加液
②加样
③电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验结果及分析评价
[思考1]你是否成功扩增出DNA片段？
判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp。
[思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
①如果扩增不成功，可能的原因有：
漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课堂练习
1.某质粒上有SalI、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，获得此质粒的农杆菌表现出对两种抗生素的抗性。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请据图分析，下列表述错误的是（ ）
A. 在构建重组质粒时，选用HindⅢ和SalI两种酶切割目的基因的两端及质粒可防止目的基因和质粒的自我环化
B. 用分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基筛选农杆菌时，发现含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因未起到标记基因的作用
C. 采用农杆菌转化法是因为农杆菌感染烟草细胞时，其内的重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
D. 利用植物组织培养技术培育转基因抗盐烟草植株，依据的原理是高度分化的植物细胞具有发育成完整植株的能力
所给的限制酶在质粒上的切割位点都位于抗四环素基因的部位，如果目的基因插入到质粒中，得到重组质粒，则含重组质粒的农杆菌只含有完整的抗氨苄青霉素基因，不含完整的抗四环素基因（被目的基因破坏），则含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，这能说明抗四环素基因起到了标记基因的作用，
B
课堂练习
2.研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是( )
A. 为方便构建重组质粒，可在引物5'端添加限制酶的识别序列
B. 运用PCR扩增LTP1基因时，应选择左图的A和D作为引物
C. 如图中为了筛选导入重组质粒的啤酒酵母，只需配制含青霉素的培养基
D. 为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子
根据DNA的复制方向，应选择B和C。
启动子和终止子是质粒中具有的
还需要对目的基因和产物进行检测
A
感谢观看
THANKS
基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做重组DNA技术。
第3章 基因工程
选择性必修三 生物技术与工程
目录
CONTENT
01
新课导入
02
任务探究
03
第2节 基因工程的基本操作程序
第二课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
课堂练习
旧知回顾
新课导入
1
2
3
4
目的基因的筛选与获取
基因表达载体的构建
将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测与鉴定
基因工程的基本操作程序（4个步骤）
目的基因进入_________内，并且在受体细胞内__________和_____的过程
受体细胞
维持稳定
表达
（二）将目的基因导入受体细胞的方法
导入植物细胞
导入动物细胞
导入微生物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
显微注射法
Ca2+转化法
（我国科学家独创）
（一）转化的概念
（常用）
（单子叶植物常用）
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】1.阅读课本80页第4段和81页，明确转化的概念是什么？将目的基因转入受体细胞的方法有哪些？
任务探究
三、将目的基因导入受体细胞
1.操作方法
②在植物授粉后一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液(含目的基因）滴在花柱切面，使目的基因通过花粉管通道进入胚囊。
①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。
2.实例
我国“转基因抗虫棉”
3.优缺点
简便经济（优点）
要求花朵较大（缺点）
花粉管通道法
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理
能在自然条件下感染_______植物和_______植物，对大多数单子叶植物______________。随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种__________植物也取得了成功。
双子叶
裸子
没有感染能力
单子叶
2.转化原理
农杆菌细胞内含有________，当它侵染植物细胞时，Ti质粒的 _______可转移至被侵染的细胞，并整合到该细胞的_____________。
Ti质粒
T-DNA
染色体DNA上
[思考]构建基因表达载体时，目的基因该插到Ti质粒哪里？
T-DNA
（可转移的DNA）
农杆菌转化法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
1.农杆菌的特点：
3.转化过程
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
①两次拼接
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。
第二次拼接(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
②两次导入
第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。
第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞
三、将目的基因导入受体细胞
将含目的基因的表达载体提纯
科学家用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内，如腺病毒载体等。
【补充】病毒侵染法
受精卵
显微 注射
含目的基因的受精卵
具有新性状的动物
雌性动物输卵管或子宫
胚胎移植
早期胚胎
显微注射法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
Ca2+处理大肠杆菌细胞
感受态细胞
细胞吸收DNA分子
基因表达载体与感受态细胞混合
使细胞处于一种能够吸收周围环境中的DNA分子的生理状态。
【注意】原核生物作为受体细胞产生的真核生物的蛋白质通常没有生物活性，需要在体外进行再加工。
（因为没有内质网、高尔基体对蛋白质进一步加工。）
Ca2+转化法
三、将目的基因导入受体细胞
【任务三】2.试分析花粉管通道法的操作方法、实例和优缺点；农杆菌转化法的特点、转化原理和转化过程以及显微注射法和Ca2+转化法的原理。
【小结】将目的基因导入受体细胞核心方法比较
种类 项目 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用 方法
受体 细胞
转化 过程
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
目的基因插入Ti质粒的T DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→能吸收周围环境中DNA分子的生理状态细胞→重组的基因表达载体导入细胞中
三、将目的基因导入受体细胞
1.检测目的基因是否插入受体细胞
方法①：PCR扩增技术
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
转基因生物
提取DNA
/mRNA
DNA作为模板
PCR操作
是否扩增出目的基因
电泳操作
PCR技术或分子杂交技术
DNA半保留复制
原理：
四、目的基因的检测与鉴定
分子水平的检测
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
1.检测目的基因是否插入受体细胞
方法②：分子杂交技术
是一段带有检测标记（荧光或同位素标记），且顺序已知的，与目的基因能互补的核酸序列（DNA或RNA）。应是单链，若为双链，必须先行变性处理成单链。
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
碱基互补配对
原理：
PCR技术或分子杂交技术
基因探针
分子水平的检测
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
1.检测目的基因是否插入受体细胞
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR技术或分子杂交技术
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原— 抗体杂交技术
过程：提取转基因植物的蛋白质+相应抗体 → 是否出现杂交带
抗原与抗体的特异性结合
原理：
分子水平的检测
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
抗性检测：
功能活性比较：
基因工程产品与天然产品的功能活性比较
—检测是否具有抗性以及抗性强度等
如：胰岛素注射到糖尿病模型小鼠
抗虫、抗病接种实验
没有抗虫基因的棉花植株
有抗虫基因的棉花植株
棉铃虫没有死亡
棉铃虫死亡
接种
棉铃虫
个体生物学水平鉴定
四、目的基因的检测与鉴定
【任务四】1.阅读课本82页，明确基因检测与鉴定的方式有哪几种？并对其进行详细分析。
【小结】目的基因的检测与鉴定
分子水平检测
个体生物学水平鉴定
1.检测目的基因是否插入受体细胞
2.检测目的基因是否转录出了mRNA
PCR技术或分子杂交技术
3.检测目的基因是否翻译成蛋白质
抗原— 抗体杂交技术
检测是否具有抗性（抗虫、抗病接种实验）以及抗性强度等
四、目的基因的检测与鉴定
获取质粒、
噬菌体等载体
筛选和获取目的基因
检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性
将含有目的基因的表达载体导入受体细胞
用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体
基因工程的基本操作步骤
基因工程的基本操作流程图
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
[活动]自主阅读书本P84-85，完成以下填空，掌握DNA片段的扩增及电泳鉴定的原理。
实验原理
1.PCR在体外进行DNA片段的扩增原理
PCR利用了_________________和________________的原理。
DNA的热变性原理
DNA半保留复制
2.DNA片段电泳鉴定的原理
DNA分子具有____________，在一定的____下，这些基团可以带上____________，在_____的作用下，这些_________会向着__________________的电极移动，这个过程就是_____。
可解离的基团
pH
正电荷或负电荷
带电分子
电泳
与它所带电荷相反
电场
在凝胶中DNA分子的迁移速率与___________、_______________和_____等有关。
凝胶中的DNA分子通过_____，可以在波长为______的________下被检测出来。
凝胶的浓度
染色
300nm
紫外灯
DNA分子的大小
构象
材料用具
1.试剂
（1）4种脱氧核苷酸等量混合液、2种引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水。
（2）电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等。
（3）PCR反应体系的配方
10倍浓缩的扩增缓冲液（含Mg2+） 5μL
20mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液（实为dNTP） 1μL
20μmol/L的引物Ⅰ 2.5μL
20μmol/L的引物Ⅱ 2.5μL
H2O 28～33μL
1-5U/μL的Taq DNA聚合酶（即耐高温的DNA聚合酶） 1～2U
模板DNA （用量为1pg-1μg） 5～10μL
总体积 50μL
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
2.用具
①PCR仪 （自动控温，实现DNA的扩增）
②微量离心管 （实际上是进行PCR反应的场所）
③微量移液器 （用于向微量离心管转移PCR配方中的液体）
④一次性吸液枪头（微量移液器吸取一种试剂更换一次枪头）
⑤电泳装置（包括电泳仪、电泳槽等）
（注意：加不同样品时，需要更换枪头）
材料用具
实验步骤
1.DNA片段扩增的具体过程
移液
用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部（提高反应速率）。
反应
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性 复性 延伸
预变性 94℃,5min / /
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
最后一次 94℃,1min 55℃,30s 72℃,1min
预变性：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。
可根据目的片段长度适当调整延伸时间。
2.PCR扩增产物电泳鉴定的具体过程
制备凝胶
①融化
②倒模
③凝固
用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%～1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。
将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。
待凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。
进行电泳
①加液
②加样
③电泳
将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。
将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物。
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察鉴定
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。
实验结果及分析评价
[思考1]你是否成功扩增出DNA片段？
判断的依据是什么？
以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。进行电泳鉴定的结果应该是一条条带。
该片段大小约为750bp。
[思考2]你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。
①如果扩增不成功，可能的原因有：
漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
②如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：
引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；复性温度过低；DNA聚合酶的质量不好；模板DNA出现污染；Mg2＋浓度过高等。
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
注意事项
1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。
3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。
5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。
探究实践：DNA片段的扩增及电泳鉴定
课堂练习
1.某质粒上有SalI、HindⅢ、BamHⅠ三种限制酶切割位点，同时还含有抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因，获得此质粒的农杆菌表现出对两种抗生素的抗性。利用此质粒获得转基因抗盐烟草的过程，如下图所示。请据图分析，下列表述错误的是（ ）
A. 在构建重组质粒时，选用HindⅢ和SalI两种酶切割目的基因的两端及质粒可防止目的基因和质粒的自我环化
B. 用分别含有氨苄青霉素和四环素的培养基筛选农杆菌时，发现含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，说明抗四环素基因未起到标记基因的作用
C. 采用农杆菌转化法是因为农杆菌感染烟草细胞时，其内的重组Ti质粒上的T-DNA能将目的基因插入到烟草细胞的染色体DNA上
D. 利用植物组织培养技术培育转基因抗盐烟草植株，依据的原理是高度分化的植物细胞具有发育成完整植株的能力
所给的限制酶在质粒上的切割位点都位于抗四环素基因的部位，如果目的基因插入到质粒中，得到重组质粒，则含重组质粒的农杆菌只含有完整的抗氨苄青霉素基因，不含完整的抗四环素基因（被目的基因破坏），则含有目的基因的农杆菌不能在含四环素的培养基上生长，这能说明抗四环素基因起到了标记基因的作用，
B
课堂练习
2.研究人员将大麦细胞的LTP1基因导入酵母中，让酵母产生LTP1蛋白。下图为该实验过程的部分流程。下列说法正确的是( )
A. 为方便构建重组质粒，可在引物5'端添加限制酶的识别序列
B. 运用PCR扩增LTP1基因时，应选择左图的A和D作为引物
C. 如图中为了筛选导入重组质粒的啤酒酵母，只需配制含青霉素的培养基
D. 为了让大麦的基因在酵母中表达，需要在目的基因两侧添加大麦的启动子和终止子
根据DNA的复制方向，应选择B和C。
启动子和终止子是质粒中具有的
还需要对目的基因和产物进行检测
A
感谢观看
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