《学霸笔记 同步精讲》第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具（课件）人教版生物选择性必修3
文档属性
| 名称 | 《学霸笔记 同步精讲》第3章 基因工程 第1节 重组DNA技术的基本工具（课件）人教版生物选择性必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 3.4MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-03-09 00:00:00 | ||
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文档简介
(共56张PPT)
第3章
第1节 重组DNA技术的基本工具
生 物
2026
内容索引
自主预习 新知导学
合作探究 释疑解惑
课堂小结
课标定位
素养阐释
1.概述基因工程的概念,明确重组DNA技术中三种基本工具的作用和特点。
2.概述DNA的粗提取与鉴定实验的原理,能进行正确的实验操作。
1.结合基因工程的基本原理,形成“基因工程赋予生物新的遗传特性”的生命观念。
2.独立进行DNA的粗提取与鉴定实验,提升科学探究能力。
3.通过了解科学的进步对重组DNA技术发展的促进作用,认同科学和技术能够改善人们的生活,拓展人们的视野。
自主预习 新知导学
一、基因工程的诞生和发展
1.基因工程的概念:是指按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫作重组DNA技术。
2.基因工程的基础:基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。
3.基因工程的问世:1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体,构建重组DNA,导入受体细胞,使外源基因在原核细胞中成功表达,并实现
物种间的基因交流。至此,基因工程正式问世。
4.基因工程的发展(连线)
二、重组DNA技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)限制酶的切割方式
①限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将
DNA分子的两条链分别切开,产生的是黏性末端。
如:EcoRⅠ限制酶识别的序列和切割位点如下图
所示。
②限制酶在它识别序列的中心轴线处切开,产生的是平末端。如:SmaⅠ限制酶识别的序列和切割位点如下图所示(图中虚线为中轴线)。
2.DNA连接酶
(1)种类
(2)作用:将双链DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
(3)结果:将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
种类 来源 特点
E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
3.基因进入受体细胞的载体
(1)质粒
①本质:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②作为载体的条件:a.有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中;b.进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制;c.常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
(2)其他载体:噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.材料用具:(略)
3.方法步骤
(1)提取:称取约30 g洋葱,切碎,研磨→过滤(除杂质,取上清液)→析出DNA(在上清液中加入预冷的酒精溶液,静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒卷起丝状物,吸去水分;或离心,取沉淀物,晾干)。
(2)鉴定
【预习检测】
1.判断正误。
(1)限制酶只能用于切割目的基因。( )
(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。( )
(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端或平末端。( )
(4)DNA连接酶能使两碱基通过形成氢键连接起来。( )
(5)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于T4 DNA连接酶。( )
(6)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。( )
(7)载体的作用是携带目的基因进入受体细胞中,使之稳定存在并表达。
( )
(8)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。( )
×
√
√
×
×
√
√
√
2.实施基因工程的最终目的是( )
A.提取生物体的DNA分子
B.对DNA分子进行人工剪切
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.创造符合人们需要的新的生物类型和生物产品
答案:D
解析:A、B和C三项均为基因工程操作的具体内容,但不是基因工程的目的。实施基因工程的最终目的是通过转基因等技术定向改造生物的遗传物质,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
3.下列关于重组DNA技术的基本工具的说法,正确的是( )
A.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
B.微生物中的限制酶对自身DNA无损害作用
C.限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端
D.质粒是基因工程中唯一的载体
答案:B
解析:常用的DNA连接酶分为两类:E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶,两者都既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,也可以连接双链DNA片段的平末端。微生物中的限制酶通常能限制异源DNA的侵入并使之失活,即能将外源DNA切断,从而保护自身的遗传特性。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式,即黏性末端和平末端。质粒是基因工程中常用的载体,除此之外,用到的载体还有噬菌体和动植物病毒等。
4.两个核酸片段在适宜条件下,经X酶的催化作用发生下图所示的变化。则X酶是( )
A.DNA连接酶
B.RNA聚合酶
C.DNA聚合酶
D.限制酶
答案:A
解析:题图中X酶可将两个具有互补黏性末端的DNA片段连接在一起,因此该酶为DNA连接酶。
5.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是( )
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破,可获取富含DNA的滤液
B.DNA不溶于体积分数为95%的预冷的酒精溶液,但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.植物材料需先用清水使细胞吸水涨破,释放DNA
D.鉴定DNA时,应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
答案:B
解析:家兔属于哺乳动物,哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核,不能用于DNA的粗提取,A项错误。植物细胞在清水中不会涨破,需加入研磨液进行研磨,从而释放DNA,C项错误。鉴定DNA时,将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂,进行沸水浴冷却后呈蓝色,D项错误。
合作探究 释疑解惑
[问题引领]
知识点一 限制性内切核酸酶
1.限制酶的识别序列有什么特点
提示:大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。限制酶所识别的序列为回文序列(两条链从5'到3'方向的序列一致),都有一条中轴线。
2.限制酶虽然主要存在于原核生物中,但对原核生物自身DNA不会起到切割作用,这是为什么
提示:原核生物自身DNA上不存在限制酶的识别序列和切割位点。
3.结合教科书第71页图3-3,分析黏性末端和平末端是如何形成的。
提示:限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开,就形成黏性末端;在识别序列的中心轴线处切开,就产生平末端。
4.某同学认为同一限制酶切割产生相同的黏性末端,因此基因工程必须使用同一种限制酶处理后的黏性末端才行,这名同学的说法正确吗 说明你的理由。
提示:不正确。不同的限制酶也可能产生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶处理获得相同的黏性末端。
[归纳提升]
1.限制酶
(1)限制酶的作用
限制酶具有特殊的识别和切割功能,在基因工程中,一方面用于切割含目的基因的DNA分子,以获取目的基因;另一方面用于切割载体。
(2)识别序列的特点
2.比较DNA酶、解旋酶、限制酶
酶 作用 产物
DNA酶 断开相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,水解DNA 形成四种脱氧核苷酸
解旋酶 解旋,断开双链互补碱基之间的氢键 DNA单链
限制酶 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 含有黏性末端或平末端的双链DNA片段
3.限制酶是一类酶,不是一种酶。不同种类的限制酶识别序列和切割位点不同,具有专一性,但不同限制酶切割后可能形成相同的末端。
[典型例题]
下表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点,请回答下列问题。
(1)从表中4种酶的切割位点看,可以切出平末端的限制酶是 。
(2)限制酶切割的DNA片段的“缝合”依靠的是 酶,它的作用是形成磷酸二酯键;两条链间的碱基对通过 连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶 切割。
图1
图2
(4)在相关酶的作用下,图1中的甲与图2中的乙 (填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由: 。
答案:(1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ (4)能 二者具有相同的黏性末端
解析:(1)由题表中4种限制酶的切割位点可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段“缝合”时用DNA连接酶进行连接,形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)由质粒的碱基序列可知,质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成链状DNA。(4)由题图可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
【变式训练】
1.下表为几种限制酶的切割位点,下列相关叙述错误的是( )
A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键
B.BamHⅠ切割的序列能被BclⅠ切割
C.BclⅠ切割的序列能被Sau3AⅠ切割
D.以上信息说明限制酶具有特异性和专一性
答案:B
解析:由题表可知,限制酶BamHⅠ的识别序列为GGATCC,且在GG之间进行切割;BclⅠ的识别序列为TGATCA,且在TG之间进行切割;Sau3AⅠ的识别序列为GATC,且在G前面进行切割。BamHⅠ切割的序列与BclⅠ切割的序列不同,所以BamHⅠ切割的序列不能被BclⅠ切割。
2.下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的 ( )
A.1种 B.2种
C.3种 D.4种
答案:C
解析:题图中③④为相同的平末端,可能由同一种限制酶切割所得,所以题图4种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
[问题引领]
知识点二 DNA连接酶
1.DNA连接酶通过形成什么化学键把两个DNA片段连接起来
提示:通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来。
2.常用的两类DNA连接酶的作用有什么区别
提示:E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
3.DNA连接酶的识别有无特异性 能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端
提示:DNA连接酶无识别的特异性,对于互补的黏性末端以及平末端都能通过形成磷酸二酯键将它们连接起来。不同限制酶切割形成的黏性末端只要互补,DNA连接酶就可催化二者连接起来。
[归纳提升]
1.DNA连接酶主要包括E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶两类。E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。这两类酶“缝合”时都能形成磷酸二酯键。
2.DNA聚合酶与DNA连接酶的比较
酶 DNA聚合酶 DNA连接酶
形成磷酸二酯键的方式 只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的3'末端的羟基上,形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
模板 以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过形成磷酸二酯键合成一条与模板链互补的DNA链 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,因此,DNA连接酶不需要模板
引物 需要引物 不需要引物
[典型例题]
下列有关DNA连接酶的说法,正确的是( )
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样,能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA 连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
答案:A
解析:DNA连接酶连接的是双链DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上。E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都既可以连接有平末端的DNA片段,也可以连接有黏性末端的DNA片段。
【变式训练】
1.基因工程离不开DNA连接酶,下列有关叙述错误的是( )
A.DNA连接酶起作用时,不需要模板
B.基因工程中的“分子缝合针”只有T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶
C.DNA连接酶通过形成磷酸二酯键“缝合”双链DNA片段
D.T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端
答案:B
2.下列有关DNA连接酶的作用的叙述,正确的是( )
A.识别DNA分子上的特定碱基序列
B.将DNA分子长链切开
C.将碱基进行配对
D.将来源不同的两个DNA片段进行连接
答案:D
解析:限制酶能够识别DNA分子上的特定碱基序列,A项错误。限制酶能够将DNA分子长链切开,B项错误。碱基配对遵循碱基互补配对原则,不需要酶催化,C项错误。DNA连接酶是基因工程的“分子缝合针”,能将来源不同的两个DNA片段进行连接,D项正确。
[问题引领]
知识点三 基因进入受体细胞的载体
1.质粒为什么能充当“分子运输车”
提示:质粒具备载体的条件:①有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中;②进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制;③带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
2.标记基因是怎样起筛选作用的
提示:标记基因是一种已知功能或已知序列的基因,通常是一些抗生素抗性基因或表达产物有特定颜色的基因。可将受体细胞接种于特定的培养基上,通过观察受体细胞是否有特定抗性或颜色等判断载体是否进入受体细胞。
3.为什么基因工程中用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
提示:一般来说,天然质粒往往不能满足人们的所有要求,因此人们根据不同的目的和需求,对某些天然的质粒进行人工改造。
[归纳提升]
1.载体的作用
(1)用它作为运载工具,将目的基因送入受体细胞。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2.作为载体的必备条件
(1)有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。
(2)具备自我复制能力,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。
(3)带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
3.载体的种类
(1)细菌质粒:它是细菌拟核DNA之外的小型环状双链DNA分子,有的细菌只有一个,有的细菌有多个。
(2)噬菌体。
(3)动植物病毒。
4.质粒载体与天然质粒的区别
质粒载体是在天然质粒的基础上人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有一个至多个限制性内切核酸酶识别位点的序列,并去掉了大部分非必需序列,使相对分子质量尽可能小,以便于操作。
5.标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了含有该抗生素抗性基因载体的受体细胞。原理如下图所示。
[典型例题]
下图是某质粒的结构示意图(a、b、c代
表外源基因可能的插入位点)。下表是外
源基因插入某位点后含重组质粒的细菌在
不同培养基上的生长情况。请根据表中提供的细菌的生长情况,推测①②③三种重组细菌的外源基因插入位点,正确的一组是( )
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
答案:A
细菌 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长的情况 细菌在含四环素的培养基上生长的情况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
解析:①细菌在两种培养基上都能生长,说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏,外源基因插入位点是c点;②细菌在含氨苄青霉素的培养基上能生长,在含四环素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,四环素抗性基因被破坏了,外源基因插入位点是b点;③细菌在含四环素的培养基上能生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏了,四环素抗性基因没有被破坏,外源基因插入位点是a点。
【变式训练】
1.下列可作为“分子运输车”的是( )
①天然质粒 ②人工改造的质粒 ③λ噬菌体的衍生物 ④动植物病毒
A.①②③④ B.①②③
C.②③④ D.①②④
答案:C
解析:天然质粒需要经过改造才能成为基因工程的“分子运输车”。
2.下列有关质粒的叙述,正确的是( )
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.细菌质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
答案:B
[问题引领]
知识点四 DNA的粗提取与鉴定
1.提取大分子物质的基本思路是什么
提示:提取生物大分子的基本思路是将被分离的生物大分子与其他物质分开,并加以纯化。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。
2.如何用酒精析出DNA
提示:由于DNA不溶于酒精,在过滤得到的上清液中加入等体积的体积分数为95%的预冷酒精即可使DNA析出,然后用玻璃棒慢慢卷起丝状的DNA。
3.DNA的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热,它们有什么不同
提示:还原糖加斐林试剂后,置于50~65 ℃温水中加热;而DNA加二苯胺试剂后,置于沸水中加热。
[归纳提升]
1.DNA粗提取与鉴定的原理
(1)粗提取DNA的原理:①DNA不溶于预冷的酒精溶液,但是某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
(2)鉴定DNA的原理:在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.实验材料的选择
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是哺乳动物成熟的红细胞内无细胞核。
3.破碎细胞,获取含DNA的滤液的方法
动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要进行充分的研磨,过滤后收集研磨液。
4.析出DNA
在一倍体积的上清液中倒入体积相等的预冷的酒精溶液,溶液中析出白色丝状物。预冷的酒精溶液的作用:抑制核酸水解酶的活性,防止DNA水解;降低分子运动,使DNA易于析出;低温有利于增加DNA的柔韧性,减少断裂。
[典型例题]
下图为菜花DNA的粗提取与鉴定的实验流程图。据图回答下列问题。
(1)选择菜花作为提取DNA的实验材料的原因是 。
(2)研磨前,向研钵中加入石英砂的目的是 ,加入的物质a是 。
(3)研磨液过滤后,应向滤液中加入预冷的酒精溶液,目的是 ;也可以向滤液中加入少量蛋白酶,目的是 。
(4)鉴定DNA所用的化学试剂为 。在该鉴定实验中,A试管溶液不变蓝,B试管溶液变蓝,由此可知,A、B两支试管属于对照组的是 ,对照组试管中加入的物质有 。
答案:(1)菜花中的DNA含量相对较高
(2)使研磨充分 研磨液
(3)析出DNA,溶解部分杂质 分解蛋白质
(4)二苯胺 A NaCl溶液和二苯胺试剂
解析:(1)菜花中DNA含量相对较高,可以作为提取DNA的材料。
(2)向研钵中加入石英砂是为了使研磨更充分。在本实验中同时向研钵中加入一定量的研磨液,可以瓦解细胞膜,有利于DNA的释放。同时,研磨液中含一定的NaCl,有利于DNA的溶解。
(3)在含有DNA的滤液中,加入预冷的酒精溶液,可以使DNA析出,溶解部分杂质;蛋白酶能分解滤液中的蛋白质。
(4)鉴定DNA的原理是在沸水浴条件下,DNA与二苯胺反应呈现蓝色,因此鉴定DNA所用的化学试剂为二苯胺。B试管中溶液呈现蓝色,说明含有DNA,所以属于对照组的是A试管。对照组试管中加入的物质有NaCl溶液和二苯胺试剂,目的是排除NaCl溶液对二苯胺显色的影响。
【变式训练】
关于利用新鲜的洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )
A.向洋葱组织中加入蒸馏水并搅拌即可释放核DNA
B.假如用鸡血来代替洋葱进行该实验,破碎细胞的方法相同
C.利用DNA不溶于预冷酒精的特性,可粗提取DNA
D.含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在常温下混合呈蓝色
答案:C
解析:洋葱细胞为植物细胞,有细胞壁保护,因此加蒸馏水不会使洋葱细胞吸水涨破。洋葱有细胞壁的保护,破碎细胞时需加研磨液研磨,鸡血细胞无细胞壁的保护,可向其中加入一定量的蒸馏水使细胞吸水涨破。含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在沸水浴下混合呈蓝色。
课堂小结
第3章
第1节 重组DNA技术的基本工具
生 物
2026
内容索引
自主预习 新知导学
合作探究 释疑解惑
课堂小结
课标定位
素养阐释
1.概述基因工程的概念,明确重组DNA技术中三种基本工具的作用和特点。
2.概述DNA的粗提取与鉴定实验的原理,能进行正确的实验操作。
1.结合基因工程的基本原理,形成“基因工程赋予生物新的遗传特性”的生命观念。
2.独立进行DNA的粗提取与鉴定实验,提升科学探究能力。
3.通过了解科学的进步对重组DNA技术发展的促进作用,认同科学和技术能够改善人们的生活,拓展人们的视野。
自主预习 新知导学
一、基因工程的诞生和发展
1.基因工程的概念:是指按照人们的愿望,通过转基因等技术,赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看,由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫作重组DNA技术。
2.基因工程的基础:基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。
3.基因工程的问世:1973年,科学家证明质粒可以作为基因工程的载体,构建重组DNA,导入受体细胞,使外源基因在原核细胞中成功表达,并实现
物种间的基因交流。至此,基因工程正式问世。
4.基因工程的发展(连线)
二、重组DNA技术的基本工具
1.限制性内切核酸酶
(1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能:能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(3)限制酶的切割方式
①限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将
DNA分子的两条链分别切开,产生的是黏性末端。
如:EcoRⅠ限制酶识别的序列和切割位点如下图
所示。
②限制酶在它识别序列的中心轴线处切开,产生的是平末端。如:SmaⅠ限制酶识别的序列和切割位点如下图所示(图中虚线为中轴线)。
2.DNA连接酶
(1)种类
(2)作用:将双链DNA片段连接起来,恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
(3)结果:将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
种类 来源 特点
E.coli DNA连接酶 大肠杆菌 E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶 T4噬菌体
3.基因进入受体细胞的载体
(1)质粒
①本质:一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
②作为载体的条件:a.有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中;b.进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制;c.常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
(2)其他载体:噬菌体、动植物病毒等。
三、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
(1)DNA不溶于酒精,但某些蛋白质溶于酒精。
(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
(3)在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.材料用具:(略)
3.方法步骤
(1)提取:称取约30 g洋葱,切碎,研磨→过滤(除杂质,取上清液)→析出DNA(在上清液中加入预冷的酒精溶液,静置2~3 min,溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒卷起丝状物,吸去水分;或离心,取沉淀物,晾干)。
(2)鉴定
【预习检测】
1.判断正误。
(1)限制酶只能用于切割目的基因。( )
(2)限制酶切割DNA分子具有特异性。( )
(3)限制酶切割DNA后可产生黏性末端或平末端。( )
(4)DNA连接酶能使两碱基通过形成氢键连接起来。( )
(5)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远高于T4 DNA连接酶。( )
(6)质粒是小型环状DNA分子,是基因工程常用的载体。( )
(7)载体的作用是携带目的基因进入受体细胞中,使之稳定存在并表达。
( )
(8)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。( )
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2.实施基因工程的最终目的是( )
A.提取生物体的DNA分子
B.对DNA分子进行人工剪切
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.创造符合人们需要的新的生物类型和生物产品
答案:D
解析:A、B和C三项均为基因工程操作的具体内容,但不是基因工程的目的。实施基因工程的最终目的是通过转基因等技术定向改造生物的遗传物质,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
3.下列关于重组DNA技术的基本工具的说法,正确的是( )
A.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
B.微生物中的限制酶对自身DNA无损害作用
C.限制酶切割DNA后一定能产生黏性末端
D.质粒是基因工程中唯一的载体
答案:B
解析:常用的DNA连接酶分为两类:E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶,两者都既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,也可以连接双链DNA片段的平末端。微生物中的限制酶通常能限制异源DNA的侵入并使之失活,即能将外源DNA切断,从而保护自身的遗传特性。经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式,即黏性末端和平末端。质粒是基因工程中常用的载体,除此之外,用到的载体还有噬菌体和动植物病毒等。
4.两个核酸片段在适宜条件下,经X酶的催化作用发生下图所示的变化。则X酶是( )
A.DNA连接酶
B.RNA聚合酶
C.DNA聚合酶
D.限制酶
答案:A
解析:题图中X酶可将两个具有互补黏性末端的DNA片段连接在一起,因此该酶为DNA连接酶。
5.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是( )
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破,可获取富含DNA的滤液
B.DNA不溶于体积分数为95%的预冷的酒精溶液,但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.植物材料需先用清水使细胞吸水涨破,释放DNA
D.鉴定DNA时,应将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
答案:B
解析:家兔属于哺乳动物,哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核,不能用于DNA的粗提取,A项错误。植物细胞在清水中不会涨破,需加入研磨液进行研磨,从而释放DNA,C项错误。鉴定DNA时,将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后加入二苯胺试剂,进行沸水浴冷却后呈蓝色,D项错误。
合作探究 释疑解惑
[问题引领]
知识点一 限制性内切核酸酶
1.限制酶的识别序列有什么特点
提示:大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。限制酶所识别的序列为回文序列(两条链从5'到3'方向的序列一致),都有一条中轴线。
2.限制酶虽然主要存在于原核生物中,但对原核生物自身DNA不会起到切割作用,这是为什么
提示:原核生物自身DNA上不存在限制酶的识别序列和切割位点。
3.结合教科书第71页图3-3,分析黏性末端和平末端是如何形成的。
提示:限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开,就形成黏性末端;在识别序列的中心轴线处切开,就产生平末端。
4.某同学认为同一限制酶切割产生相同的黏性末端,因此基因工程必须使用同一种限制酶处理后的黏性末端才行,这名同学的说法正确吗 说明你的理由。
提示:不正确。不同的限制酶也可能产生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶处理获得相同的黏性末端。
[归纳提升]
1.限制酶
(1)限制酶的作用
限制酶具有特殊的识别和切割功能,在基因工程中,一方面用于切割含目的基因的DNA分子,以获取目的基因;另一方面用于切割载体。
(2)识别序列的特点
2.比较DNA酶、解旋酶、限制酶
酶 作用 产物
DNA酶 断开相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,水解DNA 形成四种脱氧核苷酸
解旋酶 解旋,断开双链互补碱基之间的氢键 DNA单链
限制酶 识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 含有黏性末端或平末端的双链DNA片段
3.限制酶是一类酶,不是一种酶。不同种类的限制酶识别序列和切割位点不同,具有专一性,但不同限制酶切割后可能形成相同的末端。
[典型例题]
下表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点,请回答下列问题。
(1)从表中4种酶的切割位点看,可以切出平末端的限制酶是 。
(2)限制酶切割的DNA片段的“缝合”依靠的是 酶,它的作用是形成磷酸二酯键;两条链间的碱基对通过 连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶 切割。
图1
图2
(4)在相关酶的作用下,图1中的甲与图2中的乙 (填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由: 。
答案:(1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ (4)能 二者具有相同的黏性末端
解析:(1)由题表中4种限制酶的切割位点可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段“缝合”时用DNA连接酶进行连接,形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)由质粒的碱基序列可知,质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成链状DNA。(4)由题图可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
【变式训练】
1.下表为几种限制酶的切割位点,下列相关叙述错误的是( )
A.限制酶能够水解DNA上特定的磷酸二酯键
B.BamHⅠ切割的序列能被BclⅠ切割
C.BclⅠ切割的序列能被Sau3AⅠ切割
D.以上信息说明限制酶具有特异性和专一性
答案:B
解析:由题表可知,限制酶BamHⅠ的识别序列为GGATCC,且在GG之间进行切割;BclⅠ的识别序列为TGATCA,且在TG之间进行切割;Sau3AⅠ的识别序列为GATC,且在G前面进行切割。BamHⅠ切割的序列与BclⅠ切割的序列不同,所以BamHⅠ切割的序列不能被BclⅠ切割。
2.下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的 ( )
A.1种 B.2种
C.3种 D.4种
答案:C
解析:题图中③④为相同的平末端,可能由同一种限制酶切割所得,所以题图4种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
[问题引领]
知识点二 DNA连接酶
1.DNA连接酶通过形成什么化学键把两个DNA片段连接起来
提示:通过形成磷酸二酯键将两个DNA片段连接起来。
2.常用的两类DNA连接酶的作用有什么区别
提示:E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
3.DNA连接酶的识别有无特异性 能否催化连接不同限制酶切割形成的黏性末端
提示:DNA连接酶无识别的特异性,对于互补的黏性末端以及平末端都能通过形成磷酸二酯键将它们连接起来。不同限制酶切割形成的黏性末端只要互补,DNA连接酶就可催化二者连接起来。
[归纳提升]
1.DNA连接酶主要包括E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶两类。E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。这两类酶“缝合”时都能形成磷酸二酯键。
2.DNA聚合酶与DNA连接酶的比较
酶 DNA聚合酶 DNA连接酶
形成磷酸二酯键的方式 只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的3'末端的羟基上,形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
模板 以一条DNA链为模板,将单个核苷酸通过形成磷酸二酯键合成一条与模板链互补的DNA链 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来,因此,DNA连接酶不需要模板
引物 需要引物 不需要引物
[典型例题]
下列有关DNA连接酶的说法,正确的是( )
A.DNA连接酶和限制酶的作用恰好相反,DNA连接酶可以将限制酶切开的双链DNA片段“缝合”起来
B.DNA连接酶和DNA聚合酶一样,能连接单链DNA片段
C.E.coli DNA 连接酶只能连接有黏性末端的DNA片段
D.T4 DNA连接酶只能连接有平末端的DNA片段
答案:A
解析:DNA连接酶连接的是双链DNA片段,而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段上。E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都既可以连接有平末端的DNA片段,也可以连接有黏性末端的DNA片段。
【变式训练】
1.基因工程离不开DNA连接酶,下列有关叙述错误的是( )
A.DNA连接酶起作用时,不需要模板
B.基因工程中的“分子缝合针”只有T4 DNA连接酶和E.coli DNA连接酶
C.DNA连接酶通过形成磷酸二酯键“缝合”双链DNA片段
D.T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端
答案:B
2.下列有关DNA连接酶的作用的叙述,正确的是( )
A.识别DNA分子上的特定碱基序列
B.将DNA分子长链切开
C.将碱基进行配对
D.将来源不同的两个DNA片段进行连接
答案:D
解析:限制酶能够识别DNA分子上的特定碱基序列,A项错误。限制酶能够将DNA分子长链切开,B项错误。碱基配对遵循碱基互补配对原则,不需要酶催化,C项错误。DNA连接酶是基因工程的“分子缝合针”,能将来源不同的两个DNA片段进行连接,D项正确。
[问题引领]
知识点三 基因进入受体细胞的载体
1.质粒为什么能充当“分子运输车”
提示:质粒具备载体的条件:①有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段(基因)插入其中;②进入受体细胞后,能在细胞中进行自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制;③带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
2.标记基因是怎样起筛选作用的
提示:标记基因是一种已知功能或已知序列的基因,通常是一些抗生素抗性基因或表达产物有特定颜色的基因。可将受体细胞接种于特定的培养基上,通过观察受体细胞是否有特定抗性或颜色等判断载体是否进入受体细胞。
3.为什么基因工程中用作载体的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的
提示:一般来说,天然质粒往往不能满足人们的所有要求,因此人们根据不同的目的和需求,对某些天然的质粒进行人工改造。
[归纳提升]
1.载体的作用
(1)用它作为运载工具,将目的基因送入受体细胞。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
2.作为载体的必备条件
(1)有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA片段插入其中。
(2)具备自我复制能力,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。
(3)带有标记基因,便于重组DNA分子的筛选。
3.载体的种类
(1)细菌质粒:它是细菌拟核DNA之外的小型环状双链DNA分子,有的细菌只有一个,有的细菌有多个。
(2)噬菌体。
(3)动植物病毒。
4.质粒载体与天然质粒的区别
质粒载体是在天然质粒的基础上人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有一个至多个限制性内切核酸酶识别位点的序列,并去掉了大部分非必需序列,使相对分子质量尽可能小,以便于操作。
5.标记基因的筛选原理
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了含有该抗生素抗性基因载体的受体细胞。原理如下图所示。
[典型例题]
下图是某质粒的结构示意图(a、b、c代
表外源基因可能的插入位点)。下表是外
源基因插入某位点后含重组质粒的细菌在
不同培养基上的生长情况。请根据表中提供的细菌的生长情况,推测①②③三种重组细菌的外源基因插入位点,正确的一组是( )
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
答案:A
细菌 细菌在含氨苄青霉素的培养基上生长的情况 细菌在含四环素的培养基上生长的情况
① 能生长 能生长
② 能生长 不能生长
③ 不能生长 能生长
解析:①细菌在两种培养基上都能生长,说明氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因都没有被破坏,外源基因插入位点是c点;②细菌在含氨苄青霉素的培养基上能生长,在含四环素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,四环素抗性基因被破坏了,外源基因插入位点是b点;③细菌在含四环素的培养基上能生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能生长,说明氨苄青霉素抗性基因被破坏了,四环素抗性基因没有被破坏,外源基因插入位点是a点。
【变式训练】
1.下列可作为“分子运输车”的是( )
①天然质粒 ②人工改造的质粒 ③λ噬菌体的衍生物 ④动植物病毒
A.①②③④ B.①②③
C.②③④ D.①②④
答案:C
解析:天然质粒需要经过改造才能成为基因工程的“分子运输车”。
2.下列有关质粒的叙述,正确的是( )
A.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器
B.细菌质粒是细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
C.质粒只有在侵入宿主细胞后才能在宿主细胞内复制
D.细菌质粒的复制过程一定是在宿主细胞外独立进行的
答案:B
[问题引领]
知识点四 DNA的粗提取与鉴定
1.提取大分子物质的基本思路是什么
提示:提取生物大分子的基本思路是将被分离的生物大分子与其他物质分开,并加以纯化。对于DNA的粗提取而言,就是要利用DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分。
2.如何用酒精析出DNA
提示:由于DNA不溶于酒精,在过滤得到的上清液中加入等体积的体积分数为95%的预冷酒精即可使DNA析出,然后用玻璃棒慢慢卷起丝状的DNA。
3.DNA的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热,它们有什么不同
提示:还原糖加斐林试剂后,置于50~65 ℃温水中加热;而DNA加二苯胺试剂后,置于沸水中加热。
[归纳提升]
1.DNA粗提取与鉴定的原理
(1)粗提取DNA的原理:①DNA不溶于预冷的酒精溶液,但是某些蛋白质溶于酒精,利用这一原理,可以初步分离DNA与蛋白质;②DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液。
(2)鉴定DNA的原理:在一定温度下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.实验材料的选择
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是使用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是哺乳动物成熟的红细胞内无细胞核。
3.破碎细胞,获取含DNA的滤液的方法
动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要进行充分的研磨,过滤后收集研磨液。
4.析出DNA
在一倍体积的上清液中倒入体积相等的预冷的酒精溶液,溶液中析出白色丝状物。预冷的酒精溶液的作用:抑制核酸水解酶的活性,防止DNA水解;降低分子运动,使DNA易于析出;低温有利于增加DNA的柔韧性,减少断裂。
[典型例题]
下图为菜花DNA的粗提取与鉴定的实验流程图。据图回答下列问题。
(1)选择菜花作为提取DNA的实验材料的原因是 。
(2)研磨前,向研钵中加入石英砂的目的是 ,加入的物质a是 。
(3)研磨液过滤后,应向滤液中加入预冷的酒精溶液,目的是 ;也可以向滤液中加入少量蛋白酶,目的是 。
(4)鉴定DNA所用的化学试剂为 。在该鉴定实验中,A试管溶液不变蓝,B试管溶液变蓝,由此可知,A、B两支试管属于对照组的是 ,对照组试管中加入的物质有 。
答案:(1)菜花中的DNA含量相对较高
(2)使研磨充分 研磨液
(3)析出DNA,溶解部分杂质 分解蛋白质
(4)二苯胺 A NaCl溶液和二苯胺试剂
解析:(1)菜花中DNA含量相对较高,可以作为提取DNA的材料。
(2)向研钵中加入石英砂是为了使研磨更充分。在本实验中同时向研钵中加入一定量的研磨液,可以瓦解细胞膜,有利于DNA的释放。同时,研磨液中含一定的NaCl,有利于DNA的溶解。
(3)在含有DNA的滤液中,加入预冷的酒精溶液,可以使DNA析出,溶解部分杂质;蛋白酶能分解滤液中的蛋白质。
(4)鉴定DNA的原理是在沸水浴条件下,DNA与二苯胺反应呈现蓝色,因此鉴定DNA所用的化学试剂为二苯胺。B试管中溶液呈现蓝色,说明含有DNA,所以属于对照组的是A试管。对照组试管中加入的物质有NaCl溶液和二苯胺试剂,目的是排除NaCl溶液对二苯胺显色的影响。
【变式训练】
关于利用新鲜的洋葱进行“DNA的粗提取与鉴定”实验,下列说法正确的是( )
A.向洋葱组织中加入蒸馏水并搅拌即可释放核DNA
B.假如用鸡血来代替洋葱进行该实验,破碎细胞的方法相同
C.利用DNA不溶于预冷酒精的特性,可粗提取DNA
D.含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在常温下混合呈蓝色
答案:C
解析:洋葱细胞为植物细胞,有细胞壁保护,因此加蒸馏水不会使洋葱细胞吸水涨破。洋葱有细胞壁的保护,破碎细胞时需加研磨液研磨,鸡血细胞无细胞壁的保护,可向其中加入一定量的蒸馏水使细胞吸水涨破。含DNA的NaCl溶液与二苯胺试剂在沸水浴下混合呈蓝色。
课堂小结