《学霸笔记 同步精讲》第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序（课件）人教版生物选择性必修3
文档属性
| 名称 | 《学霸笔记 同步精讲》第3章 基因工程 第2节 基因工程的基本操作程序（课件）人教版生物选择性必修3 |
|
|
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 4.4MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-03-09 00:00:00 | ||
图片预览
文档简介
(共67张PPT)
第3章
第2节 基因工程的基本操作程序
生 物
2026
内容索引
自主预习 新知导学
合作探究 释疑解惑
课堂小结
课标定位
1.通过对相关实例的分析归纳和对教材内容的梳理,说出获取目的基因常用的方法和技术操作。
2.通过图解分析,初步认识基因表达载体的组成及构建的必要性。
3.通过实例分析及对其他材料的研读,学习导入目的基因的一般方法以及检测和鉴定目的基因的方法。
4.概述PCR反应的原理,尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
素养阐释
1.结合基因工程的基本操作程序,理解“基因工程赋予生物新的遗传特性”这一生命观念。
2.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定,感悟科学技术的进步,提升科学探究能力。
3.通过对PCR的学习,培养利用PCR技术解决生活中实际问题的能力。
自主预习 新知导学
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因
(1)概念:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
(2)培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。
2.筛选合适的目的基因
有效方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理:根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
(2)组分和条件:缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶,同时要控制温度。
(3)过程
变性:当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链
↓
复性:当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
↓
延伸:当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(4)方式:成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。
二、基因表达载体的构建
1.基因表达载体的功能
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
3.基因表达载体的构建过程
一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶把两者连接形成一个重组DNA分子(如下图所示)。
三、将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
花粉管通道法有多种操作方式。例如,可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
2.农杆菌转化法
(1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)农杆菌的特点:能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(3)过程
3.将目的基因导入动物细胞和微生物细胞的方法:将目的基因导入动物细胞最常用的方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中;将目的基因导入大肠杆菌细胞一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
四、目的基因的检测与鉴定
1.检测与鉴定的目的:判断目的基因进入受体细胞后,是否稳定维持和 表达其遗传特性。
2.检测方法
(1)分子水平的检测:通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA;用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。
(2)个体生物学水平的鉴定,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.原理:(1)PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
(2)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2.方法步骤
【预习检测】
1.判断正误。
(1)Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的酶。( )
(2)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。( )
(3)目的基因导入马铃薯细胞后,随着马铃薯DNA分子的复制而复制,传给子代细胞并表达。( )
(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质,常用抗原—抗体杂交技术。( )
(5)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。( )
(6)农杆菌转化法利用了Ti质粒的T-DNA可以转移的特点。( )
(7)基因表达载体只包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。( )
(8)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。( )
√
×
√
√
√
√
×
√
2.下列哪项不是PCR所必需的 ( )
A.DNA聚合酶 B.引物
C.解旋酶 D.四种脱氧核苷酸
答案:C
解析:DNA在细胞外解旋时不需要解旋酶。
3.下列关于目的DNA片段体外扩增的叙述,错误的是( )
A.需要向离心管中加入引物、反应物、模板、Mg2+、DNA聚合酶、反应缓冲液等
B.DNA聚合酶需要耐高温,引物只需一种,反应物是四种脱氧核苷酸
C.扩增DNA的反应程序是变性→复性→延伸
D.可以使用琼脂糖凝胶电泳法对PCR结果进行分析
答案:B
4.在基因表达载体的构建中,所需要的酶是( )
①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶
A.①② B.①②③
C.①②④ D.①②③④
答案:A
5.下列不属于目的基因与载体结合过程的是( )
A.用一定的限制酶切割质粒,露出黏性末端
B.用同种限制酶切割目的基因,露出黏性末端
C.将切下的目的基因插入质粒的切口处
D.将重组DNA引入受体细胞中进行扩增
答案:D
6.下列判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中,不属于分子检测的是( )
A.观察害虫吃棉叶是否死亡
B.检测棉花基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
C.检测棉花细胞中mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D.检测棉花细胞中的蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
答案:A
合作探究 释疑解惑
[问题引领]
知识点一 目的基因的筛选与获取
围绕转基因抗虫棉的培育这个案例,阅读教科书第76~79页内容,思考并讨论下列问题。
(1)在该项目中,目的基因是什么 根据什么筛选目的基因
提示:培育转基因抗虫棉的目的基因是来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。筛选Bt基因的依据:Bt基因的序列信息及Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白等。还可以借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库等。
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋 为什么要求所加入的DNA聚合酶具有耐高温的特性 子链的合成为什么需要引物
提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复,达不到扩增的效果。因此, PCR反应中利用高温代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性,因此需要耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连接到已有的短单链核酸上,因此需要一段已知序列的短单链核酸作为引物。
(3)PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补 请说明理由。
提示:否。因为两种引物分别与两个DNA单链的3'端互补结合,而DNA的两条单链的3'端碱基序列往往不同,如果两种引物的碱基序列互补,则会影响引物与DNA单链的结合。
(4)PCR扩增目的基因是获得目的基因的唯一方法吗 你还能说出什么方法
提示:不是。还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
[归纳提升]
1.目的基因的筛选是根据基因的有关信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表达产物等,借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库的辅助进行筛选。
2.细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较
比较项目 DNA复制 PCR
不 同 点 场所 细胞内 体外
能量 需ATP提供能量 不需ATP提供能量
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
特点 边解旋边复制,半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30次左右
缓冲液 不需要 需要
设备 无 严格控制温度变化的温控设备
比较项目 DNA复制 PCR
相 同 点 原料 四种脱氧核苷酸 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则 模板 DNA 引物 都需要与模板相结合的引物 3.PCR反应中应注意的问题
(1)PCR设计的引物长度通常为20~30个核苷酸,若引物太长会使扩增效率降低,而引物太短又容易导致异常DNA的产生。
(2)PCR技术通过高温加热使双链DNA解旋,该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解链的现象称为DNA的变性,在降温时,双链可以重新形成,所以DNA的热变性是可逆的。
(3)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度的设定主要与引物的长度和碱基组成中G—C比例呈正相关。若复性温度太高,则引物无法与模板链结合,无法进行DNA复制,PCR反应得不到扩增产物。
(4)耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。
[典型例题]
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 ,在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
(2)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
答案:(1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键
(2)Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析:(1)体内进行DNA复制时,需用解旋酶破坏氢键使双链DNA解旋,而利用PCR技术扩增目的基因时,是将温度提高至90 ℃以上使DNA变性。(2)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在72 ℃左右,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
【变式训练】
1.利用PCR技术可获得目的基因,下列相关叙述正确的是( )
A.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
B.PCR反应体系中需添加磷酸、脱氧核糖和含氮的碱基作为原料
C.PCR反应体系中需要添加从受体细胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶
D.在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
答案:A
解析:PCR反应体系中需添加脱氧核糖核苷酸作为原料。PCR是通过高温使DNA分子中的氢键断裂的,不需要加入解旋酶,需要加入耐高温的DNA聚合酶。在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA变性、复性、延伸,而不是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。
2.PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,利用该方法可以使目的基因迅速扩增,其简要过程如下图所示。下列关于PCR的叙述,错误的是( )
A.PCR和体内DNA复制都需要模板、能量
B.由PCR的反应过程可知,与氢键相比,磷酸二酯键对高温的稳定性更强
C.PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸和2种引物
D.PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
答案:C
解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量DNA为模板,复制出大量DNA,与体内DNA复制一样,都需要模板和能量,A项正确。由PCR的反应过程可知,高温使双链DNA解链,破坏的是碱基间的氢键,而没有破坏磷酸二酯键,则磷酸二酯键在高温下的稳定性更强,B项正确。PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸,PCR是先解旋后复制特定DNA序列,需2种引物,而细胞内DNA复制是边解旋边复制,需多种引物,C项错误。PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,继续合成子代DNA片段,D项正确。
[问题引领]
知识点二 基因表达载体的构建
1.通过PCR获取足够量的目的基因后,能直接导入受体细胞吗 为什么 构建基因表达载体的目的又是什么呢
提示:不能。若将目的基因直接导入受体细胞,目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制,不能稳定遗传和表达。构建基因表达载体的目的:①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代;②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体中的启动子、终止子、标记基因各有什么作用
提示:启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子位于基因的下游,是一段有特殊序列结构的DNA片段,使转录在所需要的地方停下来。标记基因便于重组DNA分子的筛选。
3.怎样构建基因表达载体 请以抗虫棉基因表达载体的构建为例进行说明。
提示:在构建抗虫棉的基因表达载体时,首先会用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段;再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA分子。
[归纳提升]
1.构建基因表达载体时需要注意的问题
(1)载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段;表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
(2)用到的工具酶:既用到限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
(3)启动子、终止子对于目的基因的表达必不可少。
(4)目的基因不能单独进入受体细胞,必须以表达载体的方式进入。
(5)切割载体的限制酶与切割目的基因的限制酶必须能产生相同的黏性末端,以便DNA连接酶将其连接,可以用同一种限制酶,也可以用不同的限制酶。
(6)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。
(7)将切开的载体与切开的目的基因混合,加入DNA连接酶后,会出现多种连接方式,如载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因连接等。
2.构建基因表达载体时,限制酶的选择技巧(如下图所示)
图甲 图乙
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,最好使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶与切割目的基因的限制酶产生的黏性末端要相同。
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不止一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制原点,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 有特殊序列结构的DNA片段 有特殊序列结构的DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 基因上游 基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录 终止转录 翻译的起始点 终止翻译
[典型例题]
图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图2为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
图1
图2
根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。
(2)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图3所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。
图3
答案:(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
解析:(1)由图1可知,尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图2中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用,甲和丙的目的基因分别插在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。
【变式训练】
1.下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )
A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别
C.启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案:B
2.下图是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( )
A.图示过程是基因工程的核心步骤
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含
有抗原基因的细胞筛选出来
D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案:B
解析:题图过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项正确。构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ和EcoRⅠ,B项错误。卡那霉素抗性基因是标记基因,其存在有利于鉴定和筛选含有目的基因的细胞,C项正确。基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。
[问题引领]
知识点三 将目的基因导入受体细胞
1.农杆菌转化法是如何将目的基因导入植物细胞并整合到细胞的染色体DNA上的
提示:将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,Ti质粒上的T-DNA转移至被侵染的植物细胞,并整合到该细胞的染色体DNA上。
2.将Bt基因导入棉花细胞时我国科学家独创了哪种方法 与农杆菌转化法相比有何优点
提示:花粉管通道法,这是一种更为简便经济的方法。
3.简述如何将目的基因导入大肠杆菌。
提示:先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
[归纳提升]
将目的基因导入受体细胞的几种方法的比较
比较 项目 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 Ca2+处
理法
生物 种类 植物 植物 动物 微生物
受体 细胞 体细胞 受精卵 受精卵 原核细胞
比较 项目 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 Ca2+处
理法
转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中或在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵 (受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将重组的基因表达载体导入其中
常用 方法 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 感受态
细胞法
特点 适用于双子叶植物和裸子植物 不需要专门的组织培养 能有效地将目的基因导入动物细胞 操作简便有效
[典型例题]
下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述错误的是( )
A.①→②利用两种不同限制酶
处理,能避免抗虫基因的DNA片
段自身环化
B.②→③可用氯化钙处理农
杆菌,有助于促进重组Ti质粒转入农杆菌细胞中
C.③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上
D.④→⑤用植物组织培养技术培养,具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异
答案:C
解析:③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒的T-DNA片段会整合到植物细胞的染色体上。
【变式训练】
1.农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后,目的基因插入的位置是
( )
A.Ti质粒上 B.受体细胞的染色体DNA上
C.T-DNA D.农杆菌的拟核
答案:B
2.下图是将人的生长激素基因导入细
菌B制造的“工程菌”的示意图。已知细
菌B细胞内不含质粒A,也不含质粒A上
的基因。下列说法正确的是( )
A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是
显微注射法
B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上,能生长的是导入了重组质粒的细菌和导入了质粒A的细菌
C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上,能生长的是导入了重组质粒的细菌和导入了质粒A的细菌
D.该过程选用的受体细胞可以是含质粒A的细菌
答案:B
解析:将目的基因导入细菌时,常用Ca2+处理细菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。重组质粒中氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,所以在含有氨苄青霉素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌和导入了重组质粒的细菌。重组质粒中四环素抗性基因被破坏,所以能在含有四环素的培养基上生长的只是导入了质粒A的细菌。重组质粒以氨苄青霉素抗性基因作为标记基因,因此受体细胞内不能含氨苄青霉素抗性基因,否则,就不能完成筛选和鉴定。
[问题引领]
知识点四 目的基因的检测与鉴定
1.完成第三步操作后,是否意味着目的基因一定成功导入了受体细胞 是否意味着转基因生物就一定培育成功 为什么
提示:否。目的基因进入受体细胞后是否能稳定存在、是否能传递给下一代、是否能表达和发挥作用,只有通过检测与鉴定才能知道。
2.目的基因的检测与鉴定可从哪几个水平进行
提示:①分子水平的检测:通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA;从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。②个体生物学水平的检测。
[归纳提升]
目的基因检测的必要性:目的基因成功导入受体细胞后,不一定在受体细胞中稳定存在、不一定遗传给下一代、不一定表达和发挥作用,因此需要做目的基因的检测与鉴定。
首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上,常借助PCR等技术;检测目的基因是否转录出mRNA;检测目的基因是否翻译出蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术。
其次,进行个体生物学水平的鉴定。包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的活性比较,以确定功能是否相同等。如下图所示。
[典型例题]
在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(KanR)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞和组织才能在含卡那霉素的培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。
下列有关叙述错误的是( )
A.①过程需要的酶有限制性
内切核酸酶和DNA聚合酶
B.②过程需要加入卡那霉素
进行选择培养
C.④过程可以采用一定的技术进行分子水平的检测
D.④过程可以用虫感染植株进行个体水平的检测
答案:A
解析:①过程构建基因表达载体,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶;②过程需要借助标记基因的功能进行筛选,由于以卡那霉素抗性基因作为标记基因,所以需要在培养基中添加卡那霉素;④过程对目的基因的检测和鉴定,既可在分子水平上进行,也可在个体水平上进行。
【变式训练】
下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述,错误的是( )
A.目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B.检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录的方法都是分子水平的检测
C.目的基因进入受体细胞后,经分子水平检测后,还需要进行个体生物学水平的鉴定
D.如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质,可确定目的基因首端含有启动子
答案:A
解析:目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入染色体DNA中。
课堂小结
第3章
第2节 基因工程的基本操作程序
生 物
2026
内容索引
自主预习 新知导学
合作探究 释疑解惑
课堂小结
课标定位
1.通过对相关实例的分析归纳和对教材内容的梳理,说出获取目的基因常用的方法和技术操作。
2.通过图解分析,初步认识基因表达载体的组成及构建的必要性。
3.通过实例分析及对其他材料的研读,学习导入目的基因的一般方法以及检测和鉴定目的基因的方法。
4.概述PCR反应的原理,尝试进行PCR的基本操作并用电泳鉴定PCR的产物。
素养阐释
1.结合基因工程的基本操作程序,理解“基因工程赋予生物新的遗传特性”这一生命观念。
2.进行DNA片段的扩增及电泳鉴定,感悟科学技术的进步,提升科学探究能力。
3.通过对PCR的学习,培养利用PCR技术解决生活中实际问题的能力。
自主预习 新知导学
一、目的基因的筛选与获取
1.目的基因
(1)概念:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
(2)培育转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。
2.筛选合适的目的基因
有效方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)PCR原理:根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。
(2)组分和条件:缓冲液、DNA模板、2种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶,同时要控制温度。
(3)过程
变性:当温度超过90 ℃时,双链DNA解聚为单链
↓
复性:当温度下降到50 ℃左右时,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
↓
延伸:当温度上升到72 ℃左右时,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(4)方式:成指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数)。
二、基因表达载体的构建
1.基因表达载体的功能
使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
3.基因表达载体的构建过程
一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段,再利用DNA连接酶把两者连接形成一个重组DNA分子(如下图所示)。
三、将目的基因导入受体细胞
1.花粉管通道法
花粉管通道法有多种操作方式。例如,可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中;可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。
2.农杆菌转化法
(1)转化:目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
(2)农杆菌的特点:能在自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没有侵染能力。能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
(3)过程
3.将目的基因导入动物细胞和微生物细胞的方法:将目的基因导入动物细胞最常用的方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中;将目的基因导入大肠杆菌细胞一般先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
四、目的基因的检测与鉴定
1.检测与鉴定的目的:判断目的基因进入受体细胞后,是否稳定维持和 表达其遗传特性。
2.检测方法
(1)分子水平的检测:通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA;用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测Bt基因是否翻译成Bt抗虫蛋白等。
(2)个体生物学水平的鉴定,如通过采摘抗虫棉的叶片饲喂棉铃虫来确定Bt基因是否赋予了棉花抗虫特性以及抗性的程度。
五、DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.原理:(1)PCR利用了DNA的热变性原理,通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。一次PCR一般要经历30次循环。
(2)DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,这个过程就是电泳。
(3)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色,可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
2.方法步骤
【预习检测】
1.判断正误。
(1)Taq DNA聚合酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的酶。( )
(2)基因表达载体中含有启动子和终止密码子。( )
(3)目的基因导入马铃薯细胞后,随着马铃薯DNA分子的复制而复制,传给子代细胞并表达。( )
(4)检测目的基因是否翻译成蛋白质,常用抗原—抗体杂交技术。( )
(5)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射技术。( )
(6)农杆菌转化法利用了Ti质粒的T-DNA可以转移的特点。( )
(7)基因表达载体只包括目的基因、启动子、终止子和标记基因。( )
(8)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。( )
√
×
√
√
√
√
×
√
2.下列哪项不是PCR所必需的 ( )
A.DNA聚合酶 B.引物
C.解旋酶 D.四种脱氧核苷酸
答案:C
解析:DNA在细胞外解旋时不需要解旋酶。
3.下列关于目的DNA片段体外扩增的叙述,错误的是( )
A.需要向离心管中加入引物、反应物、模板、Mg2+、DNA聚合酶、反应缓冲液等
B.DNA聚合酶需要耐高温,引物只需一种,反应物是四种脱氧核苷酸
C.扩增DNA的反应程序是变性→复性→延伸
D.可以使用琼脂糖凝胶电泳法对PCR结果进行分析
答案:B
4.在基因表达载体的构建中,所需要的酶是( )
①限制酶 ②DNA连接酶 ③解旋酶 ④DNA聚合酶
A.①② B.①②③
C.①②④ D.①②③④
答案:A
5.下列不属于目的基因与载体结合过程的是( )
A.用一定的限制酶切割质粒,露出黏性末端
B.用同种限制酶切割目的基因,露出黏性末端
C.将切下的目的基因插入质粒的切口处
D.将重组DNA引入受体细胞中进行扩增
答案:D
6.下列判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中,不属于分子检测的是( )
A.观察害虫吃棉叶是否死亡
B.检测棉花基因组DNA与DNA探针能否形成杂交带
C.检测棉花细胞中mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D.检测棉花细胞中的蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
答案:A
合作探究 释疑解惑
[问题引领]
知识点一 目的基因的筛选与获取
围绕转基因抗虫棉的培育这个案例,阅读教科书第76~79页内容,思考并讨论下列问题。
(1)在该项目中,目的基因是什么 根据什么筛选目的基因
提示:培育转基因抗虫棉的目的基因是来自苏云金杆菌的Bt抗虫蛋白基因,简称Bt基因。筛选Bt基因的依据:Bt基因的序列信息及Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白等。还可以借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库等。
(2)在PCR技术中,为什么不直接加入解旋酶对DNA进行解旋 为什么要求所加入的DNA聚合酶具有耐高温的特性 子链的合成为什么需要引物
提示:DNA解旋酶既可以打开双链模板DNA,又可以打开模板DNA与引物结合的部分,会导致复制与解旋不断地重复,达不到扩增的效果。因此, PCR反应中利用高温代替解旋酶使DNA解旋。PCR反应需要高温变性,因此需要耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶只能将单个的脱氧核苷酸连接到已有的短单链核酸上,因此需要一段已知序列的短单链核酸作为引物。
(3)PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补 请说明理由。
提示:否。因为两种引物分别与两个DNA单链的3'端互补结合,而DNA的两条单链的3'端碱基序列往往不同,如果两种引物的碱基序列互补,则会影响引物与DNA单链的结合。
(4)PCR扩增目的基因是获得目的基因的唯一方法吗 你还能说出什么方法
提示:不是。还可以通过构建基因文库来获取目的基因。
[归纳提升]
1.目的基因的筛选是根据基因的有关信息,包括基因的核苷酸序列、基因的位置、基因的表达产物等,借助测序技术、序列比对工具以及序列数据库的辅助进行筛选。
2.细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较
比较项目 DNA复制 PCR
不 同 点 场所 细胞内 体外
能量 需ATP提供能量 不需ATP提供能量
酶 解旋酶、DNA聚合酶等 耐高温的DNA聚合酶
特点 边解旋边复制,半保留复制 体外迅速扩增
循环次数 受生物体自身控制 30次左右
缓冲液 不需要 需要
设备 无 严格控制温度变化的温控设备
比较项目 DNA复制 PCR
相 同 点 原料 四种脱氧核苷酸 复制原理 严格遵循碱基互补配对原则 模板 DNA 引物 都需要与模板相结合的引物 3.PCR反应中应注意的问题
(1)PCR设计的引物长度通常为20~30个核苷酸,若引物太长会使扩增效率降低,而引物太短又容易导致异常DNA的产生。
(2)PCR技术通过高温加热使双链DNA解旋,该过程不需要解旋酶的参与。双链DNA在高温下解链的现象称为DNA的变性,在降温时,双链可以重新形成,所以DNA的热变性是可逆的。
(3)PCR扩增时,复性温度的设定是成败的关键。复性温度的设定主要与引物的长度和碱基组成中G—C比例呈正相关。若复性温度太高,则引物无法与模板链结合,无法进行DNA复制,PCR反应得不到扩增产物。
(4)耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端开始连接单个的脱氧核苷酸进行PCR扩增。
[典型例题]
基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 ,在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的 。
(2)目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
答案:(1)解旋酶 加热至90 ℃以上 氢键
(2)Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
解析:(1)体内进行DNA复制时,需用解旋酶破坏氢键使双链DNA解旋,而利用PCR技术扩增目的基因时,是将温度提高至90 ℃以上使DNA变性。(2)PCR反应体系中进行互补链的合成时,温度需控制在72 ℃左右,则应使用耐高温的DNA聚合酶,即Taq DNA聚合酶,而不能使用大肠杆菌DNA聚合酶(高温下会失活)。
【变式训练】
1.利用PCR技术可获得目的基因,下列相关叙述正确的是( )
A.在用PCR技术扩增DNA时,DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
B.PCR反应体系中需添加磷酸、脱氧核糖和含氮的碱基作为原料
C.PCR反应体系中需要添加从受体细胞中提取的解旋酶和DNA聚合酶
D.在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA聚合酶催化不同的反应
答案:A
解析:PCR反应体系中需添加脱氧核糖核苷酸作为原料。PCR是通过高温使DNA分子中的氢键断裂的,不需要加入解旋酶,需要加入耐高温的DNA聚合酶。在PCR过程中,温度的周期性改变是为了使DNA变性、复性、延伸,而不是为了使DNA聚合酶催化不同的反应。
2.PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,利用该方法可以使目的基因迅速扩增,其简要过程如下图所示。下列关于PCR的叙述,错误的是( )
A.PCR和体内DNA复制都需要模板、能量
B.由PCR的反应过程可知,与氢键相比,磷酸二酯键对高温的稳定性更强
C.PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸和2种引物
D.PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
答案:C
解析:PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,以极少量DNA为模板,复制出大量DNA,与体内DNA复制一样,都需要模板和能量,A项正确。由PCR的反应过程可知,高温使双链DNA解链,破坏的是碱基间的氢键,而没有破坏磷酸二酯键,则磷酸二酯键在高温下的稳定性更强,B项正确。PCR和体内DNA复制都要消耗4种脱氧核苷酸,PCR是先解旋后复制特定DNA序列,需2种引物,而细胞内DNA复制是边解旋边复制,需多种引物,C项错误。PCR反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板,继续合成子代DNA片段,D项正确。
[问题引领]
知识点二 基因表达载体的构建
1.通过PCR获取足够量的目的基因后,能直接导入受体细胞吗 为什么 构建基因表达载体的目的又是什么呢
提示:不能。若将目的基因直接导入受体细胞,目的基因可能被受体细胞分解或无法随细胞分裂进行复制,不能稳定遗传和表达。构建基因表达载体的目的:①使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代;②使目的基因能够在受体细胞中表达和发挥作用。
2.基因表达载体中的启动子、终止子、标记基因各有什么作用
提示:启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终表达出人类需要的蛋白质。终止子位于基因的下游,是一段有特殊序列结构的DNA片段,使转录在所需要的地方停下来。标记基因便于重组DNA分子的筛选。
3.怎样构建基因表达载体 请以抗虫棉基因表达载体的构建为例进行说明。
提示:在构建抗虫棉的基因表达载体时,首先会用一定的限制酶切割载体,使它出现一个切口;然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段;再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处,这样就形成了一个重组DNA分子。
[归纳提升]
1.构建基因表达载体时需要注意的问题
(1)载体与表达载体的区别:二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段;表达载体在载体的基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构。
(2)用到的工具酶:既用到限制酶切割载体和含目的基因的DNA片段,又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接,两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。
(3)启动子、终止子对于目的基因的表达必不可少。
(4)目的基因不能单独进入受体细胞,必须以表达载体的方式进入。
(5)切割载体的限制酶与切割目的基因的限制酶必须能产生相同的黏性末端,以便DNA连接酶将其连接,可以用同一种限制酶,也可以用不同的限制酶。
(6)目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插到启动子与终止子之间的部位。目的基因的插入不能破坏标记基因。
(7)将切开的载体与切开的目的基因混合,加入DNA连接酶后,会出现多种连接方式,如载体与载体连接、目的基因与目的基因连接、载体与目的基因连接等。
2.构建基因表达载体时,限制酶的选择技巧(如下图所示)
图甲 图乙
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,最好使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①所选限制酶与切割目的基因的限制酶产生的黏性末端要相同。
②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因;如果所选酶的切割位点不止一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制原点,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
项目 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
本质 有特殊序列结构的DNA片段 有特殊序列结构的DNA片段 mRNA上三个相邻碱基 mRNA上三个相邻碱基
位置 基因上游 基因下游 mRNA首端 mRNA尾端
作用 RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录 终止转录 翻译的起始点 终止翻译
[典型例题]
图1中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切核酸酶的识别序列与切割位点,图2为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
图1
图2
根据基因工程的有关知识,回答下列问题。
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被 酶切后的产物连接,理由是 。
(2)若某人利用图2所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子,如图3所示。这三种重组子中,不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有 ,不能表达的原因是 。
图3
答案:(1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,二者的目的基因均不能被转录
解析:(1)由图1可知,尽管BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶的识别位点不同,但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端,故被BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与图2中表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用,甲和丙的目的基因分别插在启动子的上游和终止子的下游,故这两个载体上的目的基因都不能被转录和翻译。
【变式训练】
1.下列有关基因工程中载体的说法,错误的是( )
A.基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建
B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别
C.启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
答案:B
2.下图是利用基因工程技术培育转基因植物,进而生产可食用疫苗的部分过程示意图,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是( )
A.图示过程是基因工程的核心步骤
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.卡那霉素抗性基因的存在有利于将含
有抗原基因的细胞筛选出来
D.除图示组成外,表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
答案:B
解析:题图过程为基因表达载体的构建过程,是基因工程中的核心步骤,A项正确。构建表达载体过程中需要将目的基因完整切割下来,此时要用到限制酶PstⅠ和EcoRⅠ,B项错误。卡那霉素抗性基因是标记基因,其存在有利于鉴定和筛选含有目的基因的细胞,C项正确。基因表达载体应包括启动子、目的基因、终止子和标记基因等结构,D项正确。
[问题引领]
知识点三 将目的基因导入受体细胞
1.农杆菌转化法是如何将目的基因导入植物细胞并整合到细胞的染色体DNA上的
提示:将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,通过农杆菌的转化作用,Ti质粒上的T-DNA转移至被侵染的植物细胞,并整合到该细胞的染色体DNA上。
2.将Bt基因导入棉花细胞时我国科学家独创了哪种方法 与农杆菌转化法相比有何优点
提示:花粉管通道法,这是一种更为简便经济的方法。
3.简述如何将目的基因导入大肠杆菌。
提示:先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,然后再将重组的基因表达载体导入其中。
[归纳提升]
将目的基因导入受体细胞的几种方法的比较
比较 项目 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 Ca2+处
理法
生物 种类 植物 植物 动物 微生物
受体 细胞 体细胞 受精卵 受精卵 原核细胞
比较 项目 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 Ca2+处
理法
转化 过程 将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 可以用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中或在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵 (受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将重组的基因表达载体导入其中
常用 方法 农杆菌 转化法 花粉管 通道法 显微注 射技术 感受态
细胞法
特点 适用于双子叶植物和裸子植物 不需要专门的组织培养 能有效地将目的基因导入动物细胞 操作简便有效
[典型例题]
下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述错误的是( )
A.①→②利用两种不同限制酶
处理,能避免抗虫基因的DNA片
段自身环化
B.②→③可用氯化钙处理农
杆菌,有助于促进重组Ti质粒转入农杆菌细胞中
C.③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒整合到植物细胞的染色体上
D.④→⑤用植物组织培养技术培养,具有抗虫性状的植株产生了可遗传变异
答案:C
解析:③→④用农杆菌侵染植物细胞,重组Ti质粒的T-DNA片段会整合到植物细胞的染色体上。
【变式训练】
1.农杆菌转化法转移目的基因进入受体细胞后,目的基因插入的位置是
( )
A.Ti质粒上 B.受体细胞的染色体DNA上
C.T-DNA D.农杆菌的拟核
答案:B
2.下图是将人的生长激素基因导入细
菌B制造的“工程菌”的示意图。已知细
菌B细胞内不含质粒A,也不含质粒A上
的基因。下列说法正确的是( )
A.将重组质粒导入细菌B常用的方法是
显微注射法
B.将完成导入过程后的细菌涂布在含有氨苄青霉素的培养基上,能生长的是导入了重组质粒的细菌和导入了质粒A的细菌
C.将完成导入过程后的细菌涂布在含有四环素的培养基上,能生长的是导入了重组质粒的细菌和导入了质粒A的细菌
D.该过程选用的受体细胞可以是含质粒A的细菌
答案:B
解析:将目的基因导入细菌时,常用Ca2+处理细菌,使之处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。重组质粒中氨苄青霉素抗性基因没有被破坏,所以在含有氨苄青霉素的培养基上生长的是导入了质粒A的细菌和导入了重组质粒的细菌。重组质粒中四环素抗性基因被破坏,所以能在含有四环素的培养基上生长的只是导入了质粒A的细菌。重组质粒以氨苄青霉素抗性基因作为标记基因,因此受体细胞内不能含氨苄青霉素抗性基因,否则,就不能完成筛选和鉴定。
[问题引领]
知识点四 目的基因的检测与鉴定
1.完成第三步操作后,是否意味着目的基因一定成功导入了受体细胞 是否意味着转基因生物就一定培育成功 为什么
提示:否。目的基因进入受体细胞后是否能稳定存在、是否能传递给下一代、是否能表达和发挥作用,只有通过检测与鉴定才能知道。
2.目的基因的检测与鉴定可从哪几个水平进行
提示:①分子水平的检测:通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA;从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测目的基因是否翻译成相应的蛋白质。②个体生物学水平的检测。
[归纳提升]
目的基因检测的必要性:目的基因成功导入受体细胞后,不一定在受体细胞中稳定存在、不一定遗传给下一代、不一定表达和发挥作用,因此需要做目的基因的检测与鉴定。
首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否插入受体细胞的染色体DNA上,常借助PCR等技术;检测目的基因是否转录出mRNA;检测目的基因是否翻译出蛋白质,采用抗原—抗体杂交技术。
其次,进行个体生物学水平的鉴定。包括抗虫、抗病的接种实验,以确定是否有抗性以及抗性的程度;基因工程产品与天然产品的活性比较,以确定功能是否相同等。如下图所示。
[典型例题]
在培育转基因植物的研究中,卡那霉素抗性基因(KanR)常作为标记基因,只有含卡那霉素抗性基因的细胞和组织才能在含卡那霉素的培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。
下列有关叙述错误的是( )
A.①过程需要的酶有限制性
内切核酸酶和DNA聚合酶
B.②过程需要加入卡那霉素
进行选择培养
C.④过程可以采用一定的技术进行分子水平的检测
D.④过程可以用虫感染植株进行个体水平的检测
答案:A
解析:①过程构建基因表达载体,需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶;②过程需要借助标记基因的功能进行筛选,由于以卡那霉素抗性基因作为标记基因,所以需要在培养基中添加卡那霉素;④过程对目的基因的检测和鉴定,既可在分子水平上进行,也可在个体水平上进行。
【变式训练】
下列关于目的基因的检测与鉴定的叙述,错误的是( )
A.目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入质粒DNA中
B.检测受体细胞是否含有目的基因及其是否成功转录的方法都是分子水平的检测
C.目的基因进入受体细胞后,经分子水平检测后,还需要进行个体生物学水平的鉴定
D.如在受体细胞内检测到目的基因表达的蛋白质,可确定目的基因首端含有启动子
答案:A
解析:目的基因在真核细胞中能否稳定遗传的关键是目的基因是否插入染色体DNA中。
课堂小结