1.科学思维——归纳概括与DNA有关的几种酶的作用及特点
1.（2024·江苏泰州高二模拟）下列有关酶的叙述，正确的是（ ）
A.DNA连接酶以DNA的一条链为模板，将单个脱氧核苷酸连接起来
B.限制性内切核酸酶识别特定的核苷酸序列并在特定位点切割DNA分子
C.DNA聚合酶可将两个DNA分子片段连接起来
D.逆转录酶是以RNA为模板指导核糖核苷酸连接合成DNA的酶
解析：B DNA连接酶连接两个DNA分子片段，A错误；DNA聚合酶催化脱氧核苷酸形成长链，C错误；逆转录酶是以RNA为模板指导脱氧核苷酸连接合成DNA的酶，D错误。
2.如图表示DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，下列选项中，表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用图解的正确顺序是（ ）
A.①②③④ B.②①④③
C.①④②③ D.①④③②
解析：C ①表示将一个DNA片段切割成两个，并且形成了黏性末端，需要用限制酶；②表示将两个DNA片段连接起来，需要用DNA连接酶；③表示解旋过程，需要用解旋酶；④表示DNA复制过程，需要用DNA聚合酶。C正确，A、B、D错误。
2.社会责任—— RT-PCR与病毒核酸检测
RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经逆转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段，操作原理如下图：
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
3.实时荧光定量PCR简称qPCR，灵敏度高特异性好，是目前检测微小残留病变的常用方法。将荧光标记的Taq man 探针与待测样本DNA混合，当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被Taq DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到在特定光激发下发出荧光（如图所示），随着循环次数的增加，荧光信号强度增加，通过实时检测荧光信号强度，可得Ct值（该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关）。下列相关叙述错误的是（ ）
A.每个模板DNA分子含有2个游离的磷酸基团
B.在反应过程中，无需ATP为新链的合成提供能量
C.做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成引物和Taq man探针
D.荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明含有的病变的概率越小
解析：D DNA分子为反向平行的两条链，每条链都含有1个游离的磷酸基团，则一个DNA分子含有2个游离的磷酸基团，A正确；在反应过程中，dNTP为新链的合成提供能量，无需ATP，B正确；做qPCR之前，需要先根据目的基因的核苷酸序列合成1对引物和1种Taq man探针，C正确；若荧光信号达到设定的阈值时，经历的循环数越少，说明扩增次数少，说明更多的荧光探针与目的基因进行了碱基互补配对，可推测获得的核酸产物中含有病变的概率越大，D错误。
4.逆转录 PCR（RT-PCR）是以 mRNA 为模板进行的特殊 PCR，过程如下图。相关叙述不正确的是（ ）
A.过程①除图示条件外还需逆转录酶、扩增缓冲液等
B.过程②形成的双链 cDNA 中含外显子和内含子等片段
C.过程③中引物 P1、P2 所含 A—T 的比例会影响复性温度
D.RT-PCR 技术可应用于RNA病毒的核酸检测
解析：B 图中过程①是逆转录过程，该过程需要逆转录酶的催化，此外还需扩增缓冲液等，A正确；经逆转录得到的单链cDNA中不含内含子等非转录区段，故过程②形成的双链 cDNA 中也不含内含子，B错误；由于A和T之间有2个氢键，而G和C之间有3个氢键，故引物 P1、P2 所含 A—T 的比例会影响复性温度，A—T比例越高，复性温度越低，C正确；RT-PCR是将RNA的逆转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术，可应用于RNA病毒的核酸检测，D正确。
3.科学探究——PCR定点突变技术在基因改造中的应用
蛋白质工程通过改造基因实现对蛋白质的定向改造。PCR定点突变技术是最常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中，它又可以分为重叠延伸PCR、大引物PCR等。大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。该技术的流程如图所示。
5.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列叙述不正确的是（ ）
A.第一轮PCR过程中复性所用的温度与第二轮PCR复性的温度不一样
B.PCR扩增的定点诱变产物通常需要连接到载体分子上才能表达出相应的性状，该定点诱变产物需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
C.第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D.将某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），属于蛋白质工程
解析：C 为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第二轮PCR的复性温度应该比第一轮高，A正确；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则需要在PCR扩增的定点诱变产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；除了第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物之外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；欲将某功能蛋白的第17位Cys（UGU）改造成Ser（UCU），应将诱变引物设计包含—AGA—或—TCT—序列，该过程属于蛋白质工程技术范畴，D正确。
1.（2023·辽宁高考8题）CD163蛋白是PRRSV病毒感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起（如下图），使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去（ ）
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
解析：B 为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程，则拼接在一起的红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因都需要进行转录和翻译，使其表达成一条多肽，因此拼接在一起的CD163基因转录形成的mRNA中不能出现终止密码子，否则红色荧光蛋白RFP基因转录形成的mRNA不能进行翻译，无法合成红色荧光蛋白，因此该拼接过程的关键步骤是除去CD163基因中编码终止密码子的序列，B符合题意，A、C、D不符合题意。
2.（2023·湖北高考4题）用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体（重组质粒），并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（ ）
A.若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B.若用Pvu Ⅰ酶切，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因
C.若用Sph Ⅰ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用Sph Ⅰ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）和Tet的培养基中能形成菌落
解析：D 若用Hind Ⅲ酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒时，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，只会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是普通质粒，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet（四环素）的培养基中不能形成菌落，D错误。
3.（2023·浙江6月选考19题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期望获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是（ ）
A.Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B.翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C.2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D.若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
解析：B 由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，故Gata3基因的启动子可以控制GFP基因表达，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，且转录和翻译的方向均是沿mRNA的5'→3'，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3-GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3-GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
4.（2023·广东高考11题）“DNA粗提取与鉴定”实验的基本过程是：裂解→分离→沉淀→鉴定。下列叙述错误的是（ ）
A.裂解：使细胞破裂释放出DNA等物质
B.分离：可去除混合物中的多糖、蛋白质等
C.沉淀：可反复多次以提高DNA的纯度
D.鉴定：加入二苯胺试剂后即呈现蓝色
解析：D 裂解的目的是使细胞破裂，释放出DNA等物质，A正确；DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质等，DNA分离过程中混合物中的多糖、蛋白质等可被去除，B正确；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质，可反复多次以提高DNA的纯度，C正确；进行DNA鉴定时可以使用二苯胺试剂，但要进行沸水浴加热后才能观察到颜色变化，D错误。
5.（2023·新课标卷6题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
解析：C 只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A不合理；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B不合理；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C合理；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不合理。
6.（2022·重庆高考3题）将人胰岛素A链上1个天冬氨酸替换为甘氨酸，B链末端增加2个精氨酸，可制备出一种人工长效胰岛素。下列关于该胰岛素的叙述，错误的是（ ）
A.进入人体后需经高尔基体加工 B.比人胰岛素多了2个肽键
C.与人胰岛素有相同的靶细胞 D.可通过基因工程方法生产
解析：A 胰岛素作用于细胞表面的受体，不需要经高尔基体的加工，A错误；人工长效胰岛素比人胰岛素的B链上多了两个精氨酸，氨基酸与氨基酸之间通过肽键连接，故多2个肽键，B正确；人工胰岛素和人胰岛素作用相同，都是降血糖的作用，故靶细胞相同，C正确；人工长效胰岛素是对天然蛋白质的改造，需要通过基因工程生产，D正确。故选A。
7 / 7第1课时 目的基因的筛选与获取和基因表达载体的构建
导学 聚焦 1.运用结构与功能和技术思维理解PCR技术的过程、原理、条件等内容。 2.结合基因工程的基本操作程序，针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计
知识点（一） 目的基因的筛选与获取
1.筛选合适的目的基因
2.获取目的基因的方法
3.利用PCR获取和扩增目的基因
（1）原理： DNA半保留复制 。
（2）PCR反应的条件
参与的组分 在DNA复制中的作用
DNA母链 提供DNA复制的 模板
4种脱氧核苷酸 合成DNA子链的原料
（耐高温的）DNA聚合酶 催化合成DNA子链
引物（长度通常为20～30个核苷酸） 使DNA聚合酶能够从 引物的3'端 开始连接脱氧核苷酸
缓冲液（含Mg2＋） 真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 Mg2＋ 激活
（3）PCR扩增的过程
过程Ⅰ为 变性 ，该阶段的温度为 90 ℃ 以上，目的是使双链DNA解聚为 单链 。
过程Ⅱ为 复性 ，该阶段的温度为 50 ℃ 左右，两种引物通过 碱基互补配对 与两条单链DNA结合。
过程Ⅲ为 延伸 ，该阶段的温度为 72 ℃ 左右，该过程需要在耐高温的 DNA聚合酶 的催化下，利用 4种脱氧核苷酸 为原料，根据碱基互补配对原则从子链的 3' 端延伸合成新的子链DNA。
（4）PCR产物的鉴定：常采用 琼脂糖凝胶电泳 来鉴定。
4.判断下列有关表述的正误
（1）目的基因一定是编码蛋白质的基因。（ × ）
提示：目的基因包括编码蛋白质的基因和调控基因。
（2）DNA聚合酶能够从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸。（ × ）
提示：DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。
（3）PCR过程不需要解旋酶。（ √ ）
（4）PCR技术中，DNA模板链上碱基G和C的比例越高，DNA变性解链的温度就越高。（ √ ）
探讨 分析PCR扩增技术的原理和过程
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，下图为PCR扩增中第一轮的变化，结合所学知识回答下列问题：
（1）结合下图分析PCR过程中为什么需要引物？DNA链复制的方向是怎样的？
提示：DNA聚合酶不能从头合成子链，只能把游离的脱氧核苷酸连接到已经存在的片段上。加入引物，能够使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。DNA链复制的方向总是从子链的5'端向3'端延伸。
（2）PCR扩增目的基因时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对，复性温度过低又会造成引物不能与DNA模板链的特定部位结合。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，假设引物的长度相同，在G—C含量高时，对复性温度的设定有什么要求？说明理由。
提示：在引物的G—C含量高时，设定的复性温度要高一些。因为DNA分子中G—C之间有三个氢键，A—T之间有两个氢键。
（3）在利用PCR获取和扩增目的基因时，从第几轮循环才会产生完整的目的基因（可用相关图解解释）？
提示：第3轮，如图所示：
（4）如果循环n次，则共消耗多少对引物？
提示：共消耗2n－1对引物。
（5）下图是某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列），都不合理，请分别说明理由。
提示：第1组：引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 会因局部发生碱基互补配对而失效。第2组：引物 Ⅰ'自身折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
1.生物体内DNA复制与PCR反应的比较
2.PCR中的数量关系
复制次数 1 2 3 n
DNA分子数 2 4 8 2n
含引物的DNA分子数 2 4 8 2n
含其中一种引物的DNA分子数 1＝ 21－1 3＝ 22－1 7＝ 23－1 2n－1
同时含两种引物的DNA分子数 0＝ 21－2 2＝ 22－2 6＝ 23－2 2n－2
共消耗引物的对数 1＝ 21－1 3＝ 22－1 7＝ 23－1 2n－1
含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数 0＝ 21－2 0＝ 22－4 2＝ 23－6 2n－2n
1.下列有关体内DNA复制与PCR技术比较的叙述，错误的是（ ）
A.二者子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端
B.二者均需要解旋酶破坏氢键来实现解旋
C.体内DNA复制需要能量，PCR反应也需要能量
D.二者遵循的碱基互补配对原则相同
解析：B DNA体内复制与利用PCR技术扩增DNA时，子链的延伸方向相同，均为5'端→3'端，A正确；PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，在高温条件下氢键断裂，B错误；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时都需要能量，但两者所需能量来源不同，C正确；体内DNA复制与利用PCR扩增DNA时，遵循的碱基互补配对原则相同，D正确。
2.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是（ ）
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后，片段c的数量为230
解析：C 图中片段a、b只有一种引物，是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A错误；由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B错误；由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C正确；经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，D错误。
3.利用PCR将某小段含目的基因的DNA分子扩增循环n次，则（ ）
A.需要已知目的基因的全部序列以便设计引物
B.共需2n－2个引物参与子代DNA分子的合成
C.应向反应体系中加入解旋酶、DNA聚合酶、缓冲液等
D.理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占7/8
解析：D 只需要已知目的基因两端的序列便可设计引物，A错误；扩增循环n次，需一种引物的数量为2n－1，常规PCR共需两种引物的数量为2×（2n－1）＝2n＋1－2，B错误；不需向PCR的反应体系中加入解旋酶，C错误；理论上第4轮循环产物中含两种引物的DNA片段占（24－2）/16＝7/8，D正确。
知识点（二） 基因表达载体的构建
1.构建基因表达载体的目的
（1）使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以 遗传 给下一代。
（2）使目的基因能够 表达 和发挥作用。
2.基因表达载体的组成
小提醒：目的基因插入位点不是随意的。基因表达载体需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入启动子和终止子之间的部位，若目的基因插入启动子部位，启动子将失去原功能。
3.基因表达载体的构建过程
（1）先用一定的 限制酶 切割载体，使它出现一个切口；
（2）然后用 同种限制酶 或 能产生相同末端 的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；
（3）再利用 DNA连接酶 将目的基因片段拼接到载体的切口处，形成重组DNA分子。
4.判断下列有关表述的正误
（1）基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。（ × ）
提示：基因工程操作程序的核心步骤是基因表达载体的构建。
（2）基因表达载体中有的含有启动子和终止密码子。（ × ）
提示：基因表达载体中有的含有启动子和终止子。
（3）标记基因不一定是抗生素抗性基因。（ √ ）
（4）基因表达载体中启动子是DNA聚合酶识别和结合的部位。（ × ）
提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
探讨 分析基因表达载体构建的目的和方法
目的基因导入受体细胞之前，需构建基因表达载体，图甲、乙分别表示质粒及目的基因所在DNA片段，图中箭头表示相关限制酶的切割位点。
（1）构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里？为什么？
提示：启动子下游和终止子上游；因为只有插入在启动子和终止子之间，目的基因才可以正常表达。
（2）构建基因表达载体时，能否用SmaⅠ酶切割质粒？为什么？
提示：不能；因为SmaⅠ会破坏质粒的抗生素抗性基因。该基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进一步筛选。
（3）与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和Hind Ⅲ 两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
提示：可以防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接。
1.启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别
位置 作用
启动子 位于DNA分子上 RNA聚合酶识别结合位点，启动转录过程
终止子 位于DNA分子上 决定转录的结束
起始密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的开始
终止密码子 位于mRNA分子上 决定翻译的结束
2.构建基因表达载体中限制酶的选择技巧
（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoR Ⅰ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点，如图乙）。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
1.下列关于基因表达载体构建的叙述，错误的是（ ）
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸
B.基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止密码子、标记基因等组件
C.人工构建的诱导型启动子，当诱导物存在时，可激活或抑制目的基因的表达
D.由于受体细胞不同，基因表达载体的构建也有所差别
解析：B 启动子在基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，组成它的基本单位是脱氧核苷酸，A正确；基因表达载体的组成包括目的基因、启动子、终止子、标记基因等组件，B错误；由于受体细胞有植物、动物和微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，D正确。
2.某实验小组利用如图所示的质粒和目的基因来构建基因表达载体，将目的基因导入大肠杆菌细胞并表达。下列叙述错误的是（ ）
A.图中的质粒用酶A切割后，会产生4个游离的磷酸基团
B.在构建重组质粒时，可用酶A和酶C切割质粒和目的基因
C.成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
D.若用酶B和酶C切割，则可以避免质粒的自身环化
解析：B 限制酶每一次切割后会得到两个末端，会有2个游离的磷酸基团，而图中的质粒含有2个酶A的切割位点，则会产生4个游离的磷酸基团，A正确；在构建重组质粒时，可用酶B和酶C切割质粒和目的基因，假如用酶A切割质粒会破坏两个标记基因，B错误；用酶B和酶C切割质粒时四环素抗性基因被破坏，成功导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长，C正确；用酶B和酶C两种限制酶切割可以避免目的基因和质粒自身环化以及两者之间的反向连接等问题，D正确。
（1）PCR每一次循环一般可以分为 变性、复性和延伸 三步。
（2）PCR技术中引物的作用是 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 。
（3）一个基因表达载体的组成中除 目的基因、标记基因 外还必须有 启动子、终止子 等。
（4）在构建基因表达载体时，一般用同种限制酶切割目的基因和载体的目的是 产生相同的黏性末端，便于DNA连接酶连接成重组DNA 。
1.在核酸分子杂交技术中，常常使用已知序列的单链核酸片段作为探针（探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染料等进行标记的已知核苷酸序列的核酸片段）。为了获得B链作探针，可应用PCR技术进行扩增，应选择的引物种类是（ ）
A.引物1与引物2 B.引物3与引物4
C.引物2与引物3 D.引物1与引物4
解析：C 要获得B链，根据PCR中子链延伸方向为5'端到3'端，则需选择引物2与引物3进行扩增，故选C。
2.（2024·海南中学模拟）PCR是聚合酶链式反应的缩写，下图表示PCR的过程，下列叙述错误的是（ ）
A.反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶在B过程起作用
B.引物a和引物b的长度应适宜，且相互之间不能发生碱基互补配对
C.PCR是体外进行的DNA扩增，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则
D.A过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，使双链DNA解聚为单链
解析：A 反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶的作用是催化合成DNA子链，在C过程中起作用，A错误；引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，且引物之间不能发生碱基互补配对，否则引物之间会配对形成双链核酸，从而失去作用，B正确；PCR是体外进行DNA扩增的技术，根据题图可知，PCR扩增遵循DNA半保留复制原则，C正确；A过程为DNA变性过程，该过程通过高温破坏DNA分子中的氢键，当温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解聚为单链，D正确。
3.限制酶的发现为DNA的切割和功能基因的获得创造了条件。限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列及切割位点分别为、。含某目的基因的DNA片段如图所示，若利用质粒A（含限制酶Sau3AⅠ、EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点各1个）构建基因表达载体，为克服目的基因和质粒A的自身环化以及目的基因与质粒的任意连接等，应该如何选择限制酶（ ）
A.用限制酶EcoRⅠ或BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
B.用限制酶Sau3AⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
C.用限制酶Sau3AⅠ和EcoRⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
D.用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ处理含某目的基因的DNA和质粒A
解析：D 用限制酶Sau3AⅠ切割目的基因会破坏目的基因，质粒含有限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切割位点，获取目的基因也可以用限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ进行切割，但为了防止目的基因或质粒自身环化，需要使用不同种限制酶进行切割，则可以使用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ去切割质粒和目的基因，则获得的重组质粒会进行正常连接。
4.（2024·天津滨海新区高二期末）基因工程中，需使用特定的限制性内切核酸酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列和切割位点是—G↓GATCC—，限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列和切割位点是—↓GATC—，根据图示分析下列叙述正确的是（ ）
A.质粒用限制性内切核酸酶Ⅱ切割，目的基因用限制性内切核酸酶Ⅰ切割
B.用限制性内切核酸酶切割获得目的基因时，有四个磷酸二酯键被水解
C.限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后获得的黏性末端不同
D.质粒中标记基因的作用是便于筛选出目的基因已经表达的细胞
解析：B 限制性内切核酸酶Ⅱ能识别限制性内切核酸酶Ⅰ的识别序列，限制性内切核酸酶Ⅰ不能识别限制性内切核酸酶Ⅱ的识别序列；要将目的基因从该DNA链中提取出来，需要在目的基因左右切开，所以要用限制性内切核酸酶Ⅱ；质粒不能用限制性内切核酸酶Ⅱ，若用该酶切割，质粒的两个标记基因均被破坏，A错误；由于DNA是双链，用限制性内切核酸酶Ⅱ将目的基因左右切开时，有四个磷酸二酯键被水解，B正确；限制性内切核酸酶Ⅰ和限制性内切核酸酶Ⅱ切割后产生的黏性末端相同，C错误；质粒中标记基因的作用是用来筛选含有目的基因的受体细胞，D错误。
知识点一 目的基因的筛选与获取
1.下列有关获取目的基因的叙述错误的是（ ）
A.目的基因就是编码蛋白质的基因
B.筛选和获取目的基因是基因工程的第一步
C.来自苏云金杆菌的Bt基因可作为转基因抗虫棉的目的基因
D.序列比对工具的应用为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会
解析：A 目的基因主要是指编码蛋白质的基因，A错误；目的基因的筛选与获取是实施基因工程的第一步，B正确；来自苏云金杆菌的Bt基因可作为培育转基因抗虫棉用到的目的基因，C正确；随着测序技术的发展，以及序列数据库和序列比对工具等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能，D正确。
2.下列关于PCR技术的叙述，正确的是（ ）
A.PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B.该技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C.该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D.该技术应用DNA半保留复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
解析：D PCR技术扩增的目的基因序列不一定完全是已知的，A错误；该技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链进行碱基互补配对，其序列不是互补的，C错误。
3.用PCR扩增下面的DNA片段：
5'-GACCTGTGGAAGC……CATACGGGATTG-3'
3'-CTGGACACCTTCG……GTATGCCCTAAC-5'
供选择的引物有：
①5'-GACCTGTGGAAGC-3'
②5'-CATACGGGATTG-3'
③5'-GTATGCCCTAAC-3'
④5'-CAATCCCGTATG-3'
共四种，应选择（ ）
A.①② B.②③
C.③④ D.①④
解析：D 用PCR扩增DNA片段的过程中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3'端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5'端至3'端延伸的，故引物的碱基序列应与每条模板链5'端的一段核苷酸链的碱基序列相同，即应以模板链5'端的一段脱氧核苷酸单链片段作为引物；由题干信息分析可知，5'端的碱基序列是5'-GACCTGTGGAAGC-3'和5'-CAATCCCGTATG-3'，故对应的引物为①④，D正确。
4.下图表示形成cDNA并进行PCR扩增的过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A.过程①所需的原料是核糖核苷酸
B.过程②所需的酶必须耐高温
C.过程③需要解旋酶破坏氢键
D.过程④的引物对之间不能互补配对
解析：D 过程①为逆转录，所需的原料是脱氧核苷酸，A错误；由DNA单链合成DNA双链的过程中所需要的DNA聚合酶不需要耐高温，B错误；过程③为变性，温度上升到超过90 ℃时，双链DNA解聚为单链，不需要解旋酶破坏氢键，C错误；过程④为复性，温度降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，但引物对之间不能互补配对，D正确。
5.下图表示利用PCR技术扩增目的基因的部分过程，其原理与细胞内DNA复制类似。下列叙述错误的是（ ）
A.耐高温的DNA聚合酶总将游离的脱氧核苷酸连接到3'端
B.在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段
C.引物之间或引物自身发生碱基互补配对，则不能有效扩增目的基因
D.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物A的DNA片段占3/4
解析：D 由图可知，以原来的每条母链为模板经第一轮合成的两个DNA分子中，只含有引物A或引物B，而以新合成的子链为模板合成新DNA分子时，两种引物都含有，故第三轮循环共产生8个DNA分子，其中含有引物A的分子是7个，即占7/8，D错误。
知识点二 基因表达载体的构建
6.（2024·黑龙江齐齐哈尔期中）基因工程的核心是构建基因表达载体，下列不属于载体作用的是（ ）
A.载体能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”
B.载体能协助目的基因在受体细胞中复制
C.载体含有启动子和终止子可协助目的基因表达
D.载体具有标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
解析：A 载体不能防止目的基因被受体细胞限制酶“切割”，A错误；载体在受体细胞中能够稳定存在，并且自我复制，使目的基因数量扩大，B正确；启动子是RNA聚合酶的识别和结合的位点，能启动转录过程，终止子控制着转录的结束，所以载体含有的启动子和终止子可协助目的基因的表达，C正确；载体具有标记基因，标记基因便于筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。
7.（2024·黑龙江哈尔滨期末）蜘蛛丝是天然蛋白纤维，其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维，有广泛的应用前景。中国科学家利用质粒（如图）成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒，并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法错误的是（ ）
A.为防止目的基因自身环化，可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因
B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达
C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位，可以驱动遗传信息的复制和转录
D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞
解析：C 用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因，可以使目的基因两端产生不同的黏性末端，防止目的基因自身环化，A正确；为能从蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白，基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在蚕丝腺细胞中转录的启动子，即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达，B正确；启动子只能驱动基因转录，不能驱动其复制，C错误；基因表达载体中的标记基因的作用是鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞，D正确。
8.图甲、乙中的箭头表示三种限制性内切核酸酶的酶切位点，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是（ ）
A.在构建重组质粒时，可用PstⅠ和Hind Ⅲ 切割质粒和外源DNA
B.在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因
C.若只用PstⅠ处理质粒和外源DNA分子片段，无法避免自身环化和反向连接
D.导入重组质粒的大肠杆菌可以在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：D 切割目的基因时，用BamHⅠ切割会破坏目的基因，只用PstⅠ切割目的基因和质粒载体，会出现目的基因和质粒的自身环化，或目的基因和质粒的反向连接，而用PstⅠ和Hind Ⅲ 进行酶切，能确保目的基因和质粒的正向连接，并且质粒上保留新霉素抗性基因作为标记基因，A、C正确；在酶切过程中，不能破坏质粒中全部的标记基因，至少需保留其中的一个，B正确；用PstⅠ切割后，质粒上氨苄青霉素抗性基因被破坏了，导入重组质粒的大肠杆菌不可以在含氨苄青霉素的培养基中生长，D错误。
9.如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性内切核酸酶。下列说法错误的是（ ）
A.图示过程是基因工程的核心步骤
B.表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D.除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：B 图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤；构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ；抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞；基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
10.（2024·陕西咸阳期末）PCR引物的3'端为结合模板DNA的关键，5'端无严格限制，可用于添加限制酶切点等序列，dNTP是DNA合成的原料，还可供能。下列相关说法错误的是（ ）
A.图示环节所需的温度比上一个环节的低
B.引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列
C.耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链
D.1个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量相同
解析：D 图示环节为引物与模板碱基互补配对，表示的是复性环节，复性的上一环节为变性，复性的温度比变性的温度低，A正确；引物的设计要有一段已知目的基因的核苷酸序列，保证其与已知模板能碱基配对，在后续扩增的过程中才能进行子链的延伸，B正确；子链是从5'端向3'端延伸的，耐高温的DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA链，C正确；由于两个引物均不在该片段的端点，因此一个循环后，子代DNA双链的脱氧核苷酸数量不相同，D错误。
11.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个（ ）
A.2 B.4
C.6 D.8
解析：D 该DNA复制4次共形成16个DNA，其中①②分别有1个，③④分别有3个，⑤有8个，D正确。
12.聚合酶链式反应（PCR）是一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术。下列关于PCR引物的叙述不正确的是（ ）
A.为保证模板链与引物结合的效率，两种引物之间尽量避免存在互补序列
B.为了便于将扩增的DNA片段与载体连接，可在引物的3'端加上限制酶识别序列
C.在两种引物上设计加入不同的限制酶识别序列，主要目的是使目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化
D.复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关
解析：B 引物自身不应存在互补序列，否则会出现引物与自身配对、引物跟引物配对的情况，降低PCR的效率，A正确；引物引导子链合成的方向是5'端→3'端，因此为了便于扩增的DNA片段与载体连接，需要在引物的5'端加上限制酶识别序列，B错误；设计引物时需要避免引物之间碱基互补配对而造成引物自身环化的现象，为了便于扩增的DNA片段与载体连接，常在两条引物上设计加入不同的限制酶识别位点，主要目的是使目的基因能定向插入表达载体，避免目的基因自身环化，C正确；复性所需的温度、时长和延伸所需的温度、时长均与引物有关，如引物中G与C含量高，需要设定更高的复性和延伸温度，D正确。
13.某病毒的检测可以采用实时荧光RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）的方法，RT-PCR的具体过程如图。下列有关叙述错误的是（ ）
A.过程①以mRNA为模板合成单链DNA
B.过程②③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，理论上需要n个引物B
C.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测，可提高检测的灵敏度
D.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接
解析：B 过程①是以mRNA形成单链DNA的过程，表示逆转录，A正确；过程③拟对单链cDNA进行第n次循环的扩增，根据DNA分子半保留复制特点可知，该过程理论上至少需要2n－1个引物B，B错误；利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度，是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量（或浓度），便于检测，C正确；游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接，D正确。
14.（多选）用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，经四轮循环后产物中有五种不同的DNA分子。下列有关叙述正确的是（ ）
A.第一轮循环得到2个DNA分子，即①②各一个
B.第二轮循环得到4个DNA分子，即①②③④各一个
C.第三轮循环得到8个DNA分子，其中有2个是等长的，也就是有2个⑤
D.第四轮循环得到16个DNA分子，其中有4个⑤
解析：ABC 第四轮循环得到的16个DNA分子中，两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段有24－2×4＝8（个），即有8个⑤，D错误。
15.下面几幅图与基因工程有关。图1为限制酶EcoR Ⅰ的识别序列，图2表示目的基因及限制酶切割位点，图3表示目的基因上的DNA片段，图4表示质粒。请回答下列问题：
（1）获得图2中目的基因的方法除PCR技术外，还有从基因文库中获取、人工合成。
（2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，图2中A、B、C、D 4种单链DNA片段中，有B、C 两种引物（DNA复制方向由5'→3'）。
（3）图3为目的基因中的某一片段，下列有关叙述正确的是A。
A.该片段的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成
B.该片段含A—T碱基对比较多，故其结构比较稳定
C.若利用PCR扩增该片段，则需解旋酶将①氢键全部解开
D.若该目的基因复制6次，则需要碱基A的数量是252个
（4）在构建目的基因表达载体时，用Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ 两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接，从图2切割下目的基因需要消耗4个水分子。不选用限制酶PstⅠ和HindⅢ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。
解析：（1）获得目的基因的方法有PCR技术、从基因文库中获取、人工合成。（2）采用PCR扩增目的基因的原理是DNA半保留复制，由图2可知，DNA复制只能从5'端到3'端，因此构建前利用PCR技术扩增基因时，A、B、C、D四种单链DNA片段中应选取B和C作为引物。（3）DNA的基本骨架由脱氧核糖与磷酸交替连接而成，A正确；其结构中G—C碱基对越多，分子结构越稳定，B错误；PCR技术利用高温解开氢键，不需要解旋酶，C错误；由图3可知，目的基因碱基A有2个，复制6次需要碱基A的数量为26×2－2＝126个，D错误。（4）在构建目的基因表达载体时，用PstⅠ、EcoRⅠ两种酶同时切割目的基因和质粒，是为了防止一种酶切割时产生目的基因与载体反向连接。限制酶破坏的是磷酸二酯键，图中目的基因切割需要破坏4个磷酸二酯键，因此需要消耗4个水分子。由图可知，不选用限制酶PstⅠ和Hind Ⅲ同时对质粒和目的基因进行切割的原因是会破坏标记基因。
16.图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（TetR）和氨苄青霉素抗性基因（AmpR）。请回答下列问题：
（1）EcoR Ⅴ酶切位点为…GAT↓ATC…，EcoR Ⅴ酶切出来的线性载体P1为平末端。
（2）用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为胸腺嘧啶（T）的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在 DNA连接酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“＋”代表生长，“－”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是B（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是A类菌落含有P0、C类菌落未转入质粒。
菌落类型 平板类型 A B C
无抗生素 ＋ ＋ ＋
氨苄青霉素 ＋ ＋ －
四环素 ＋ － －
氨苄青霉素＋四环素 ＋ － －
（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是乙、丙。某学生尝试用图中另外一对引物，结果从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp片段，原因是目的基因反向连接。
解析：（1）从图中可以看出，EcoR Ⅴ酶切出来的载体质粒为平末端。（2）从图中可以看出，目的基因的两端各有一个游离的腺嘌呤脱氧核苷酸，由于载体P1为平末端，所以载体P1的两端应该各添加一个胸腺嘧啶脱氧核苷酸，这样在DNA连接酶的作用下才能把目的基因和载体P1连接起来。（3）由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选B类菌落。A类菌落能在表中条件下存活，说明导入的是P0质粒。C类菌落只能在无抗生素的培养基中存活，说明C类菌落没有导入质粒。（4）据图分析，目的基因的外侧链只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的基因是否插入正确，都能通过PCR扩增大量目的基因，如果用乙、丙作为引物，当目的基因插入不正确（反向插入）时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR不能正常进行，因此选用乙、丙作为引物可以进行PCR鉴定。若扩增出的DNA片段为400 bp，则正好是目的基因反向连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
17.（2024·盐城实验高级中学高二期中）金属硫蛋白（MT）是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过聚合酶链式反应（PCR）扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。如图是PCR扩增过程的示意图，请回答下列问题：
（1）从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得DNA用于PCR扩增。
（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性内切核酸酶（或限制酶）切割位点。设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对，从而造成引物自连。
（3）图中步骤1代表变性，步骤2代表复性，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
（4）PCR扩增时，复性温度的设定是成败的关键。复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但G—C含量高的引物需要设定更高的复性温度。
（5）如果PCR得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有②③（填序号）。
①升高复性温度 ②降低复性温度 ③重新设计引物
解析：（1）PCR是在体外进行DNA扩增，提取的mRNA不能用于PCR扩增，需要经过逆转录获得DNA后才可用于PCR扩增。（2）设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2），需要在引物中增加适当的限制性内切核酸酶（限制酶）的识别序列，便于构建重组质粒。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。（3）根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为复性，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。（4）复性温度的设定与引物长度、碱基组成有关，复性温度过高会破坏引物与模板的碱基配对。因G、C之间氢键数多于A、T之间氢键数，故在使用G—C含量高的引物时需要设定更高的复性温度。（5）如果PCR得不到任何扩增产物，可能的原因是复性温度过高使扩增效率降低；也可能是未按照目的基因两端的核苷酸序列来设计引物，需要重新设计。因此可采取的措施有降低复性温度、重新设计引物等。
18 / 18第3节 基因工程的应用
导学 聚焦 1.基于基因工程在农牧业、医药卫生和食品工业应用的实例说明基因工程给社会带来的巨大进步。 2.用基因工程培育优良品种或细胞产品，造福人类
知识点（一） 基因工程在农牧业方面的应用
1.基因工程在植物方面的应用
2.基因工程在动物方面的应用
3.判断下列有关表述的正误
（1）农业害虫不会对转基因抗虫作物产生抗性。（ × ）
提示：害虫仍会对抗虫作物产生抗性。
（2）培育转基因抗病植物的目的基因主要来源于病毒、真菌。（ √ ）
（3）基因工程中，要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。（ × ）
提示：培育转基因动物时，所选用的受体细胞一般是受精卵；培育转基因植物时，所选用的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
（4）基因工程育种比传统育种所需的时间短，并且可以解决远缘亲本难以杂交的问题。（ √ ）
探讨 分析转基因植物的培育
下图为通过基因工程培育抗虫棉的过程，请回答：
（1）抗虫棉能抗病毒、细菌和真菌吗？为什么？
提示：不能。抗虫基因具有专一性。
（2）对于基因工程生产的抗虫棉是否取得最后的成功，最简单的检测方法是什么？
提示：让害虫去吃转基因棉花的植株，观察害虫的生存状况。
（3）从环境保护角度出发，分析转基因抗虫棉与普通棉相比在害虫防治方面的优越性有哪些？
提示：减少了化学农药的使用量，降低了环境污染。
（4）种植转基因抗虫棉若干年后，害虫会不会对转基因抗虫棉产生抗性？为什么？
提示：会。害虫会因遗传物质发生改变产生对转基因抗虫棉的抗性。
转基因抗虫植物与转基因抗病植物的比较
项目 转基因抗虫植物 转基因抗病植物
方法 从某些生物中分离出具有抗虫功能的基因，将其导入植物中 将抗病基因导入植物中
基因 种类 Bt抗虫蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等 ①抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因；②抗真菌基因：几丁质酶基因和抗毒素合成基因
成果 转基因抗虫棉、转基因抗虫水稻等 抗烟草花叶病毒的转基因烟草和抗病毒的转基因小麦、甜椒、番茄等
意义 减少化学农药的使用，降低生产成本，减轻环境污染，降低了对人体健康的损害
1.下列有关目的基因的操作能够改善产品品质的是（ ）
A.将草鱼的生长激素基因导入鲤鱼体内
B.将肠乳糖酶的基因导入奶牛的基因组
C.将降解或抵抗某种除草剂的基因导入玉米
D.将Bt抗虫蛋白基因整合到烟草或棉花的基因组并实现表达
解析：B 将草鱼的生长激素基因导入鲤鱼体内可以提高鲤鱼的生长速率，A不符合题意；导入肠乳糖酶基因的奶牛乳汁中乳糖含量降低，改善了牛奶的品质，B符合题意；将降解或抵抗某种除草剂的基因导入玉米是转基因抗除草剂植物的应用，C不符合题意；Bt抗虫蛋白基因是抗虫基因，能够提高植物的抗虫能力，D不符合题意。
2.（2024·哈尔滨三中高二检测）八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜素脱饱和酶（其基因用crtI表示）参与β-胡萝卜素合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。下列有关叙述错误的是（ ）
A.psy和crtI基因是该项研究中的目的基因
B.以pmi基因作为标记基因便于筛选出导入目的基因的受体细胞
C.检测出水稻中含八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶，即表明转基因水稻培育成功
D.可设法将重组载体导入水稻细胞
解析：C 科学家将psy和crtI基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，显然psy和crtI是该项研究中的目的基因，A正确；由题干信息可知，pmi编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长，因此构建基因表达载体时可用pmi基因作为标记基因，B正确；检测出水稻胚乳细胞中含有β-胡萝卜素，才能说明“黄金大米”培育成功，仅含有八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶不能说明转基因水稻培育成功，C错误；在培育“黄金大米”的转基因操作中可将水稻细胞作为受体细胞，然后通过植物组织培养获得转基因植株，因此，可设法将重组载体导入水稻细胞，D正确。
知识点（二） 基因工程在医药卫生领域及食品工业方面的应用
1.基因工程在医药卫生领域的应用
应用 基因来源或处理 成果
转基因微生物或动植物细胞生产药物 对微生物或动植物的细胞进行 基因 改造 生产包括细胞因子、抗体、疫苗和激素等的药物
乳腺（房）生物反应器生产药物 药用蛋白 基因＋乳腺中特异表达的基因的 启动子 生产抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素和α-抗胰蛋白酶等
转基因动物作器官移植的供体 抑制 抗原决定 基因的表达或除去 抗原决定 基因 结合克隆技术培育出不会引起 免疫排斥 反应的转基因克隆器官
2.基因工程在食品工业方面的应用
3.判断下列有关表述的正误
（1）将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，能获得产生人干扰素的菌株。（ √ ）
（2）用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌。（ √ ）
（3）利用工程菌可生产人的胰岛素等某些激素。（ √ ）
（4）乳腺生物反应器就是把药用蛋白基因导入动物的乳腺细胞中。（ × ）
提示：应是把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中。
探讨 基因工程在医药卫生领域的应用及分析
1.利用基因工程生产人胰岛素有两种方法：
方法一：将胰岛素基因转入细菌细胞，进行微生物培养，提取胰岛素；
方法二：将胰岛素基因转入高等哺乳动物的受精卵，培养成转基因动物并从其乳汁中提取胰岛素。
阅读上述材料，回答问题：
（1）方法一中，为使胰岛素基因能顺利进入细菌细胞，应用 Ca2＋ 处理细菌细胞，目的是使细胞处于一种 能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 。
（2）方法二中，将目的基因导入受体细胞常用的方法是 显微注射法 。要确保人胰岛素基因只在牛的乳腺细胞中表达，应该采取的措施是将人胰岛素基因与 乳腺中特异表达的基因的启动子 等调控元件重组在一起。
（3）大肠杆菌和酵母菌均可作为生产胰岛素的工程菌，该类工程菌的优点是 单细胞、繁殖快 （至少答出两点）。
（4）上述两种方法中，哪种方法得到的胰岛素需要进一步加工和修饰以使其获得生物活性？试解释其原因。
提示：方法一；方法一中的受体细胞是细菌，其细胞内无内质网和高尔基体，无法对胰岛素进行加工和修饰。
2.继哺乳动物乳腺生物反应器研发成功后，膀胱生物反应器的研究也取得了成功。科学家培育出一种转基因小鼠，其膀胱上皮细胞可以合成人的生长激素并分泌到尿液中。在研制膀胱生物反应器时，应使药用蛋白基因在什么细胞中特异表达？它与乳腺生物反应器有什么相同点和不同点？
提示：应使药用蛋白基因在膀胱上皮细胞中特异表达。相同点是收集药用蛋白较容易，且不会对动物造成伤害。不同点是乳腺生物反应器必须是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何发育时期的雌雄动物均可生产。
乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较
1.下列有关基因工程在食品工业方面应用的叙述，错误的是（ ）
A.阿斯巴甜是一种普遍使用的甜味剂，可以通过基因工程实现大规模生产
B.可将编码牛凝乳酶的基因导入黑曲霉基因组中，再通过工业发酵批量生产凝乳酶
C.用基因工程方法，使外源基因得到高效表达的菌类一般称为基因工程菌
D.淀粉酶、脂酶等大量生产过程中所用到的工程技术包括基因工程技术和发酵工程技术等
解析：A 阿斯巴甜主要由天冬氨酸和苯丙氨酸形成，这两种氨基酸可以通过基因工程实现大规模生产，不是阿斯巴甜。
2.动物乳腺生物反应器是一项利用转基因动物的乳腺代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。科学家已在牛和羊等动物乳腺生物反应器中表达出了抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素等重要药品，其大致过程如图所示。下列有关说法错误的是（ ）
A.通过③形成的重组质粒具有人的药用蛋白基因、启动子、终止子和标记基因即可
B.④通常采用显微注射技术
C.在转基因母牛的乳腺细胞中人的药用蛋白基因才会得以表达，因此可以从乳汁中提取药物
D.该技术生产药物的优点是产量高、质量好、易提取
解析：A 要让药用蛋白基因在乳腺细胞内表达并分泌含药物的乳汁，重组质粒上必须具有乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件，还需复制原点，A错误；④通常采用显微注射技术，B正确；只有母牛到达泌乳期，乳腺细胞才会表达相应的药用蛋白基因，乳汁中含有药物，C正确；从乳汁里提取药物，优点突出，使动物本身成为“批量生产药物的工厂”，D正确。
（1）乳腺生物反应器是指 将所需目的基因导入到动物的受精卵，使转基因动物分泌的乳汁中含有所需要的药物蛋白 。
（2）基因工程菌是指 用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类 。
1.基因工程应用广泛，成果丰硕。下列成果属于基因工程应用的是（ ）
A.腺病毒载体重组冠状病毒疫苗的制备
B.白菜与甘蓝体细胞杂交得到白菜—甘蓝
C.人工诱变获得高产青霉素的青霉菌株
D.用单个细胞培养出可供移植的皮肤
解析：A 腺病毒载体重组冠状病毒疫苗的制备，属于基因工程的应用，A符合题意；白菜与甘蓝体细胞杂交得到白菜—甘蓝，属于细胞工程的应用，B不符合题意；人工诱变获得高产青霉素的青霉菌株，属于诱变育种，不属于基因工程的应用，C不符合题意；用单个细胞培养出可供移植的皮肤，属于细胞工程的应用，D不符合题意。
2.（2024·吉林白城高二诊断）在应用农杆菌侵染植物叶片获得耐旱基因植株的实验步骤中，不需要的是（ ）
A.将转基因细胞进行脱分化和再分化
B.用PEG诱导转基因细胞的原生质体融合
C.将转基因幼苗栽培在干旱环境中以检验植株的耐旱性
D.将耐旱基因插入农杆菌T-DNA并通过农杆菌侵染植物叶片细胞
解析：B 转基因细胞是将目的基因导入受体细胞，不需要用PEG诱导转基因细胞的原生质体融合。
3.下列有关转基因植物的说法，错误的是（ ）
A.科学家可以利用一些调节细胞渗透压的基因，来提高农作物的抗盐碱和抗旱的能力
B.因为转基因抗虫棉可以抵抗一切危害棉花植株的害虫，所以转基因抗虫棉已经推广应用
C.科学家往往将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，以提高农作物的营养价值
D.利用基因工程技术可以改良农作物的品质
解析：B 因为盐碱和干旱对农作物的危害与细胞渗透压的调节有关，所以科学家可以利用一些调节细胞渗透压的基因来提高农作物的抗盐碱和抗旱的能力，A正确；转基因抗虫棉只是对棉铃虫有较强的抗性，并不能抵抗所有害虫，B错误；将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物中，可以提高农作物的营养价值，C正确；利用基因工程技术可以改良农作物的品质，D正确。
4.转基因抗虫植物含有 Bt 毒蛋白，对人体无毒，但是鳞翅目昆虫幼虫的肠道细胞含有Bt 蛋白的受体，Bt 蛋白与受体结合导致肠道壁穿孔，使幼虫死亡。下列叙述错误的是（ ）
A.促进 Bt 蛋白的合成有助于提高植物的抗虫效果
B.通过 DNA 分子杂交技术可以检测 Bt 蛋白基因是否表达
C.将 Bt 蛋白基因导入植物细胞的方法可以使用花粉管通道法或农杆菌转化法
D.将植物材料和农杆菌共同培养之前，需要对植物材料进行消毒处理
解析：B Bt蛋白与受体结合导致肠道壁穿孔，使幼虫死亡，因此促进Bt蛋白的合成有助于提高植物的抗虫效果，A正确；可通过DNA分子杂交技术检测Bt蛋白基因是否插入受体细胞的染色体DNA上，而检测目的基因是否表达应该采用抗原—抗体杂交技术，B错误。
5.上海医学遗传研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药用蛋白含量提高了30多倍。以下与此有关的叙述，不正确的是（ ）
A.“转基因动物”是指体细胞中出现了外源基因的动物
B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因
C.只在转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中特异性表达
D.转基因牛的肌肉细胞中也有人白蛋白基因，但不发生转录、翻译，故不能合成人白蛋白
解析：B “转基因动物”是指体细胞中出现了外源基因的动物，A正确；“提高基因表达水平”是指设法提高牛的乳腺细胞合成人白蛋白的能力，B错误；转基因牛的各个细胞中都含有人白蛋白基因，但只在转基因牛的乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中选择性表达，C、D正确。
6.酵母菌细胞壁的主要成分是几丁质。酿酒酵母产酒精能力强，但没有合成淀粉酶的能力；糖化酵母能合成淀粉酶，但酒精发酵能力弱。科研人员通过两种途径改良酵母菌种，实现以淀粉为底物高效生产酒精的目的。下列叙述正确的是（ ）
A.途径Ⅰ需用纤维素酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合
B.途径Ⅱ需要以淀粉酶基因作为目的基因构建基因表达载体
C.途径Ⅰ和途径Ⅱ最终获得的目的酵母菌染色体数目相同
D.以淀粉转化为还原糖的效率作为最终鉴定目的菌的指标
解析：B 途径Ⅰ需用几丁质酶处理酵母菌，再利用PEG诱导融合，A错误；根据题意，途径Ⅱ是将糖化酵母的淀粉酶基因提取出来，作为目的基因构建基因表达载体，从而获得目的酵母菌，B正确；途径Ⅰ获得的目的菌株为多倍体，是原来两种酵母菌染色体数目之和，途径Ⅱ获得的目的酵母菌染色体数目与原来酵母菌染色体数目相同，C错误；鉴定目的菌株的依据是酵母菌合成淀粉酶的能力和酒精发酵的能力，D错误。
知识点一 基因工程在农牧业方面的应用
1.下列有关基因工程在农牧业方面应用的叙述，错误的是（ ）
A.将来源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入植物，可培育出转基因抗病植物
B.将降解或抵抗某种除草剂的基因导入作物，可培育出转基因抗除草剂作物
C.将某种必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因导入植物，可能会提高植物的营养价值
D.将基因工程生产的肠乳糖酶作为药物添加在牛奶中，可解决人的乳糖不耐受问题
解析：D 肠乳糖酶属于蛋白质，口服会被胃蛋白酶消化而失效，D错误。
2.科学家利用基因工程培育出了耐盐的转基因棉花新品系，下列相关叙述错误的是（ ）
A.可通过农杆菌转化法将重组质粒导入受体细胞
B.含耐盐基因的棉花细胞可经植物组织培养获得完整植株
C.可用较高浓度的盐水浇灌来鉴定棉花植株的耐盐性
D.如果目的基因的核苷酸序列是全部未知的，可用PCR技术得到大量目的基因
解析：D 利用PCR技术获得大量目的基因时，需要提供DNA的模板和引物，设计引物需要一段已知目的基因的核苷酸序列，D错误。
3.（2024·辽宁沈阳高二期末）SOD是一种抗氧化酶，它能将转化成H2O2，增强植物的抗逆性。如图为培育农作物新品种的一种方式。下列有关叙述正确的是（ ）
A.过程①可以用动物病毒作为载体
B.从该农作物新品种的细胞中检测出了SOD基因，说明该基因工程成功了
C.新品种的获得属于可遗传的变异，可能将抗逆性状遗传给子代
D.基因工程又叫重组DNA技术，所用工具酶有限制酶、DNA连接酶和载体
解析：C 病毒的寄生具有专一性，所以过程①不能用动物病毒作为载体，A错误；从该农作物新品种的细胞中检测出具有活性的SOD，才能说明该基因工程成功了，B错误；载体不属于工具酶，D错误。
4.科学家在河南华溪蟹中找到了金属硫蛋白基因，并以质粒为载体，采用转基因方法培育出了硫吸收能力极强的转基因烟草。下列有关该烟草培育的说法正确的是（ ）
A.金属硫蛋白基因需插入到质粒上，才能转移到受体细胞中
B.需用特定的限制酶切割烟草的核酸
C.同种限制酶既可以切割含目的基因的DNA片段又可以切割质粒，因此不具有专一性
D.转基因烟草与原烟草相比基因组成发生了变化，导致两者出现生殖隔离
解析：A 在基因工程中，需用特定的限制酶切割目的基因和载体，而不是切割烟草的核酸，B错误；限制酶具有专一性，能识别特定的脱氧核苷酸序列，C错误；转基因烟草与原烟草之间一般不会出现生殖隔离，D错误。
知识点二 基因工程在医药卫生领域及食品工业方面的应用
5.（2024·吉林长春检测）下列关于用转基因动物作器官移植供体研究的叙述，错误的是（ ）
A.人体移植器官短缺和免疫排斥是目前制约人体器官移植的两大难题
B.猪的内脏构造、大小和血管分布与人的极为相似
C.灵长类动物体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒少于猪
D.无论以哪种动物作为供体，都需要在其基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因
解析：C 目前，人体移植器官短缺和免疫排斥是制约人体器官移植的两大难题，A正确；猪的内脏构造、大小和血管分布与人的极为相似，且猪体内隐藏的、可导致人类疾病的病毒远少于灵长类动物，B正确，C错误；无论以哪种动物作为供体，都需要在其基因组中导入某种调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出不会引起免疫排斥反应的转基因克隆器官，D正确。
6.（2024·湖南长沙高二期末）接种疫苗是预防传染病的重要措施。如图为一种以人复制缺陷腺病毒（缺失EI基因）为载体的埃博拉病毒疫苗研制流程。下列有关叙述错误的是（ ）
A.构建含GP基因的质粒时，需要使用限制酶和DNA连接酶
B.在重组腺病毒中，GP基因上游必须有启动子以驱动其复制和表达
C.疫苗在人体内发挥作用的过程中，腺病毒起载体作用
D.疫苗中的重组腺病毒在人体内不能复制，对接种者比较安全
解析：B GP基因的启动子只能启动基因的转录，而不能启动复制，B错误。
7.从转基因牛、羊乳汁中提取药物工艺简单，甚至可直接饮用治病。如果将药用蛋白基因转入动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，从转基因牛、羊尿液中提取药物比从乳汁中提取药物的更大优越性在于（ ）
A.技术简单
B.膀胱上皮细胞容易表达药用蛋白
C.膀胱上皮细胞全能性较高
D.无论是雌性还是雄性个体，在任何发育时期都可以产生所需药物
解析：D 利用动物乳腺生物反应器生产药物要受动物性别和发育期的限制，若从尿液中获取药物，则无论是雌性还是雄性个体，在任何发育期都可以产生所需药物，D正确。
8.（多选）（2024·吉林四平高二期中）戊型肝炎病毒是一种RNA病毒，其基因组中pORF2基因编码的pORF2蛋白是戊型肝炎病毒的表面抗原。我国科研人员利用基因工程，将编码pORF2的DNA导入大肠杆菌细胞，最终从大肠杆菌中提取pORF2蛋白并制成疫苗。下列相关分析不正确的是（ ）
A.利用特定引物对病毒RNA进行PCR扩增即可获得目的基因
B.戊型肝炎病毒与大肠杆菌遗传物质相同，所以能实现基因的重组
C.构建基因表达载体时，需将编码pORF2的DNA与启动子连接
D.利用该方法获得的疫苗会诱发体液免疫和细胞免疫并可以产生记忆细胞
解析：ABD 需先将病毒的RNA逆转录成DNA，再根据DNA序列设计出特异性的引物进行PCR扩增目的基因，A错误；戊型肝炎病毒的遗传物质是RNA，大肠杆菌的遗传物质是DNA，B错误；该蛋白疫苗不会侵染细胞，不产生细胞免疫，但疫苗属于抗原，会刺激机体产生体液免疫，可以产生记忆细胞（记忆B细胞），D错误。
9.（多选）（2024·辽宁大连高二月考）如图是科研人员利用乙烯形成酶的反义基因，通过转基因技术获得耐储存的转基因番茄的过程。下列相关叙述正确的是（ ）
A.该转基因技术所用的目的基因是乙烯形成酶基因
B.乙烯形成酶的反义基因与乙烯形成酶基因的区别是转录的模板链不同
C.由图可知，过程⑤依据的原理是碱基互补配对原则
D.转基因番茄中乙烯含量低的原因可能是乙烯形成酶基因的翻译过程受阻
解析：BCD 该转基因技术所用的目的基因是乙烯形成酶的反义基因，A错误；乙烯形成酶的反义基因与乙烯形成酶基因都是由α链和β链组成的，区别是转录的模板链相反，使转录出的mRNA能互补配对，形成双链RNA，B正确；过程⑤依据的原理是碱基互补配对原则，乙烯形成酶基因的反义拷贝转录出的反义mRNA与乙烯形成酶基因转录出的mRNA结合，可能会使乙烯形成酶基因的翻译过程受阻，C、D正确。
10.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答下列问题：
（1）在基因工程中，A表示目的基因，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶是限制酶；B表示构建的基因表达载体，其组成除了目的基因外，还必须有启动子、终止子、复制原点以及标记基因等，其中启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位。
（2）B→C为转基因绵羊的培育过程，其中②过程常用的方法是显微注射技术，使用的绵羊受体细胞为受精卵，④过程用到的生物技术主要有动物细胞培养和胚胎移植。若转基因绵羊可通过分泌的乳汁来生产人类蛋白质，在基因表达载体中，目的基因的首端必须含有乳腺中特异表达的基因的启动子，这种转基因动物被称为乳腺（或乳房）生物反应器。
（3）B→D为转基因抗虫棉的培育过程，其中③过程常用的方法是农杆菌转化法，若使用的棉花受体细胞为体细胞，⑤表示的生物技术是植物组织培养。要确定目的基因（抗虫基因）导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，检测目的基因是否转录出了mRNA的方法是PCR等技术（合理即可）。
11 / 11第1节 重组DNA技术的基本工具
导学 聚焦 1.运用结构与功能观，分析基因工程过程中三种基本工具的作用。 2.关注基因工程的诞生和发展历程， 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。 3.明确DNA的粗提取与鉴定的原理，进行相关实验操作
知识点（一） 基因工程及其操作的工具酶
1.基因工程及其诞生与发展
（1）基因工程的概念
（2）基因工程的诞生和发展
基础理论 技术支持
①DNA是遗传物质的证明 ② DNA双螺旋结构 的提出和半保留复制的证明 ③中心法则的确立 ④遗传密码的破译 ①基因转移载体和工具酶的发现 ② DNA 体外重组的实现 ③重组DNA表达实验的成功 ④DNA测序和合成技术的发明 ⑤ PCR 技术的发明
2.基因工程的工具酶
（1）限制性内切核酸酶（简称限制酶）——“分子手术刀”
①来源：主要来自 原核生物 。
②功能：能够识别双链DNA分子的特定 核苷酸序列 ，并使每一条链中特定部位的 磷酸二酯键 断开。
③结果：产生 黏性末端 或 平末端 。
（2）DNA连接酶——“分子缝合针”
①作用：将 两个DNA片段 连接起来，恢复被 限制酶 切开的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键 。
②种类及特点：
在基因工程操作中，DNA连接酶主要有两类：一类是从大肠杆菌中分离得到的，称为E.coli DNA连接酶；另一类是从T4噬菌体中分离出来的，称为T4 DNA连接酶。这两类酶都能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，但E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶。
3.判断下列有关表述的正误
（1）基因工程的原理是基因重组，不过在这里这种变异是定向的。（ √ ）
（2）DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。（ × ）
提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体，没有DNA聚合酶。
（3）限制酶在原来的原核细胞内对细胞自身有害。（ × ）
提示：限制酶在原来的原核细胞内用于切割外源DNA，使之失效，从而保护自身。
（4）不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。（ √ ）
（5）DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端。（ × ）
提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
探讨 探究基因工程的工具酶
1.已知限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列和酶切位点分别为
和 ，分析回答下列问题：
（1）在图中画出两种限制酶切割DNA后产生的末端。
（2）限制酶EcoRⅠ和SmaⅠ识别的碱基序列不同，切割位点 不同 （填“相同”或“不同”），说明限制酶具有 专一性 。
（3）要将限制酶SmaⅠ切割后产生的末端连接起来，需要 T4 DNA连接酶 。
（4）请结合下图，推断限制酶切割一次可断开几个磷酸二酯键？产生多少游离的磷酸基团？产生几个黏性末端？消耗几分子水？
提示：断开2个磷酸二酯键；产生2个游离的磷酸基团；产生2个黏性末端；消耗2分子水。
2.（1）DNA连接酶与DNA聚合酶是同类酶吗？在下面的箭头上标注相应的酶。
（2）两种酶作用的相同点是：都能形成 磷酸二酯 键。
（3）两种酶作用的不同点是：DNA聚合酶的作用是 ，DNA连接酶的作用是 。
提示：将单个的脱氧核苷酸连接到已经形成的脱氧核苷酸链上 连接DNA分子的两个片段
（4）请判断：DNA片段经限制酶处理后产生的相同黏性末端，再经过DNA连接酶处理后，形成的新的识别序列，能否再被所用的限制酶识别。
①若两个相同黏性末端都是由同种限制酶（EcoRⅠ）切割后所得， 能 （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
②若两个相同黏性末端是由不同限制酶切割所得， 不能 （填“能”或“不能”）再被所用的限制酶识别（如图）。
1.基因工程的理论基础
2.限制酶与DNA连接酶的比较
（1）区别
项目 作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA 连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于基因表达载体的构建
（2）两者的关系可表示为
1.（2024·江苏淮安期末）基因工程中需使用多种工具酶，几种限制酶的切割位点如图所示。下列说法正确的是（ ）
A.限制酶Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割形成的末端，可以通过E.coli DNA连接酶相互连接
B.DNA连接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯键的形成
C.限制酶EcoR Ⅰ进行一次切割，会切断2个磷酸二酯键，形成1个游离的5'末端
D.若两种限制酶的识别序列相同，则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接
解析：B 限制酶EcoR Ⅰ和PstⅠ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，而T4 DNA连接酶可连接黏性末端和平末端，但连接效率较低，A错误。DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键；DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键；RNA聚合酶将单个核糖核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键，B正确。一个限制酶切割一次，使DNA双链断开，会有两个磷酸二酯键断裂，形成2个黏性末端或平末端，形成2个游离的5'末端，C错误。若两种限制酶的识别序列相同，但由于识别的位点不同，切割形成的末端不同，故不一定能通过DNA连接酶相互连接，D错误。
2.DNA连接酶是基因工程的必需工具。下列有关DNA连接酶的叙述，错误的是（ ）
A.DNA连接酶可以将任意的两个DNA片段连接成一个重组DNA分子
B.DNA连接酶发挥作用时不需要识别特定的脱氧核苷酸序列
C.DNA连接酶可以催化两个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
D.有些DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端
解析：A DNA连接酶可以连接平末端或互补配对的黏性末端，而非任意的两个DNA片段，A错误。
知识点（二） 基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.种类：质粒、 噬菌体 、动植物病毒等。
2.常用载体——质粒
（1）化学本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的 环状双链DNA 分子。
（2）质粒作为载体所具备的条件及原因
条件 原因
能在细胞中进行 自我复制或整合到受体DNA上 ，随受体DNA同步复制 能使目的基因稳定存在且数量可扩增
有一个至多个 限制酶切割位点 供外源DNA片段（基因）插入其中
常有特殊的 标记基因 便于重组DNA分子的 筛选
无毒害作用 对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
（3）功能
①相当于一种运输工具，将外源基因送入 受体细胞 。
②携带 外源基因 在受体细胞内大量复制。
3.判断下列有关表述的正误
（1）作为载体的质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因。（ × ）
提示：作为载体的质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选标记基因。
（2）质粒是环状双链DNA分子，是基因工程常用的载体。（ √ ）
（3）载体（如质粒）和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。（ × ）
提示：质粒是DNA，细胞膜中的载体是蛋白质。
（4）载体的种类有质粒、噬菌体、动植物病毒等。（ √ ）
探讨 探究载体需具备的条件和载体的选择
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图思考：
（1）所有载体都是质粒吗？为什么？
提示：不是；除了质粒外，载体还有动植物病毒和噬菌体等。
（2）将外源基因直接导入受体细胞可行吗？为什么？
提示：不可行；因为如果没有载体导入受体细胞，目的基因无法进行自我复制和稳定存在以及表达。
（3）根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？并说明理由。
提示：合理；因为仅导入载体的和导入目的基因的受体细胞均能在该培养基中存活。
（4）若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用噬菌体作为载体，其原因是什么？
提示：噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。
1.载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
2.基因工程中的载体与细胞膜上的载体蛋白的区别
1.（2024·山东枣庄高二联考）质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是（ ）
A.质粒是只存在于细菌细胞质中能自我复制的小型环状双链DNA分子
B.在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C.携带目的基因的重组质粒只有整合到受体细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D.质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的筛选
解析：D 质粒不只分布于原核生物中，在真核生物（如酵母菌）细胞内也有分布，A错误；并不是所有的质粒上都能找到限制酶的切割位点而成为适合运载目的基因的工具，B错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，或整合到受体染色体DNA上后复制，C错误。
2.下面是四种不同质粒的结构模式图，其中ori为复制必需的序列，AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是（ ）
A.基因AmpR和TetR是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因
B.质粒指细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和动植物病毒的DNA
C.限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D.用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长
解析：D 基因AmpR和TetR在同一个DNA分子上，不是一对等位基因，A错误；质粒是指一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子，动植物病毒的DNA不属于质粒，B错误；限制酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，C错误；重组质粒④中，氨苄青霉素抗性基因完好，四环素抗性基因被破坏，因此用质粒④将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长，D正确。
知识点（三） DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理
2.实验步骤
3.判断下列有关表述的正误
（1）DNA不溶于酒精，但一些蛋白质溶于酒精，可利用这一原理初步分离DNA与蛋白质。（ √ ）
（2）研磨之后，通过过滤或离心，DNA会保留在沉淀物中。（ × ）
提示：研磨之后，通过过滤或离心，DNA在上清液中。
（3）DNA能与二苯胺试剂在常温下反应生成蓝色沉淀。（ × ）
提示：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
探讨 探究DNA的粗提取与鉴定
1.实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到白色丝状物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
2.上清液中加入预冷的酒精溶液有何作用？
提示：DNA不溶于酒精，加入预冷的酒精溶液有利于DNA的析出。预冷的酒精溶液具有以下优点：一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。玻璃棒沿着一个方向搅拌可防止丝状DNA破碎，可以完整地缠在玻璃棒上。
3.实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
提示：搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，搅拌要轻缓，并向一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
4.该实验进行了几次静置或离心，目的是什么？DNA是在上清液中还是在沉淀中？
提示：2次静置或离心，目的是将DNA和杂质分子分开，第1次操作后，DNA存在于上清液中；第2次操作后DNA存在于析出的白色丝状物或离心管沉淀中。
1.DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核（无DNA），可选用鸡血细胞作材料。
（2）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
（3）提取植物细胞的DNA，在研磨时加入NaCl的目的是溶解DNA。
（4）在DNA进一步提纯时，选用冷却的体积分数为95％的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
2.DNA与蛋白质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同
项目 溶解规律 物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液 物质的量浓度为 0.14 mol/L的NaCl溶液
DNA 溶解 析出
蛋白质 部分发生盐析沉淀 溶解
1.（2022·山东高考13题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（ ）
A.过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解
B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀
C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色
D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质
解析：B 低温时，DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4 ℃冰箱中进行是为了防止DNA降解，A正确；离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；粗提取的DNA中可能含有RNA、脂质、少量蛋白质，D正确。
2.（2024·江苏启东中学检测）如图是“DNA的粗提取与鉴定”实验中的两个操作步骤示意图，下列相关叙述错误的是（ ）
A.图1中的溶液a是上清液
B.图1所示操作的原理是蛋白质等杂质能溶于酒精，而DNA不溶
C.图2所示实验操作中有一处明显错误，可能导致试管2中蓝色变化不明显
D.图2中试管1的作用是证明2 mol/L的NaCl溶液遇二苯胺出现蓝色
解析：D 图1所示操作为析出DNA，溶液a是研磨液过滤静置后得到的上清液，A正确；加入预冷的酒精的目的是析出DNA、去除溶于酒精的蛋白质等杂质，原理是DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质能溶于酒精，B正确；图2所示操作中的错误是试管中的液面高于水浴的液面，导致试管受热不均匀，C正确；图2中试管1的作用是作为对照，排除NaCl溶液对实验结果的干扰，D错误。
（1）限制性内切核酸酶的作用是 能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开 。
（2）E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶的作用不同点是 E.coli DNA连接酶只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，而T4 DNA连接酶既能连接黏性末端也能连接平末端 。
（3）质粒作为基因工程的载体需具备的条件是 能在宿主细胞进行自我复制，或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制；具有一个至多个限制酶切割位点；具有标记基因 。
1.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端
解析：C DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，A错误；DNA聚合酶能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键，B错误；有些DNA连接酶既能连接双链DNA片段互补的黏性末端，又能连接DNA片段的平末端，D错误。
2.（2024·安徽宣城高二检测）下列关于转基因技术的叙述，错误的是（ ）
A.能将不同物种优良性状集中到一起，定向地改造生物的遗传性状
B.所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提
C.艾弗里等人通过实验证明遗传物质是DNA可以说是基因工程的先导
D.沃森、克里克解开了DNA复制、转录和翻译过程之谜，阐明了遗传信息流动的方向
解析：D 梅塞尔森和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制，克里克提出中心法则，D错误。
3.（2024·天津蓟州高二期中）下表列举了几种限制酶的识别序列及其切割位点（箭头表示相关酶的切割位点）。下图是酶切后产生的几种末端。下列说法正确的是（ ）
限制酶 AluⅠ BamHⅠ SmaⅠ Sau3AⅠ
识别序列及 切割位点 ↓ AGCT TCGA ↑ ↓ GGATCC CCTAGG ↑ ↓ CCCGGG GGGCCC ↑ ↓ GATC CTAG ↑
A.BamHⅠ切割的是氢键，AluⅠ切割的是磷酸二酯键
B.Sau3AⅠ和BamHⅠ切割的序列产生的黏性末端能够相连，连接后的片段还能被Sau3AⅠ切割
C.DNA连接酶能连接②⑤，不能连接②④
D.E.coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶都能连接①③，且连接效率低
解析：B 限制酶BamH Ⅰ与Alu Ⅰ切割的均是磷酸二酯键，A错误；BamH Ⅰ切割
，Sau3AⅠ切割，故二者切割后产生的黏性末端是相同的，因此二者切割后产生的黏性末端能够相连，连接后的片段能被Sau3AⅠ切割，但是不能被BamHⅠ切割，B正确；②⑤的黏性末端相同，②④的黏性末端也相同，因此DNA连接酶能连接②⑤，也能连接②④，C错误；E.coli DNA连接酶是从大肠杆菌中获得的，只能连接黏性末端，T4 DNA连接酶既可以连接黏性末端，也可以连接平末端，而图中①③属于平末端，只能用T4 DNA连接酶连接，D错误。
4.（2024·重庆一中期末）下列关于质粒的叙述，正确的是（ ）
A.细菌质粒和真核细胞DNA的基本组成单位不同
B.细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行的
C.质粒是存在于所有细胞中的蛋白质合成的场所
D.质粒是细胞质中能够自我复制的环状DNA分子
解析：D 细菌质粒是环状DNA分子，和真核细胞DNA的基本组成单位相同，都是脱氧核苷酸，A错误；细菌质粒的复制过程可在受体细胞内进行，B错误；细胞中蛋白质合成的场所是核糖体，C错误。
5.（2024·北京东城高二期末）利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时（ ）
A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来
B.离心后上清液中加入75％冷酒精，出现的白色丝状物就是纯净的DNA
C.将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象
D.可利用DNA在低温下遇二苯胺试剂呈现蓝色反应的特性对其进行鉴定
解析：C 洋葱是植物细胞，其细胞壁有保护和支撑的作用，不会吸水涨破，A错误；在上清液中加入等体积的95％的冷酒精，白色丝状物是粗提取的DNA，B错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较大，所以将晾干的白色丝状物置于2 mol/L的NaCl溶液中，会发生溶解现象，C正确；DNA在沸水浴条件下遇二苯胺试剂呈现蓝色反应，D错误。
知识点一 基因工程及其诞生与发展
1.科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是（ ）
A.定向提取生物体的DNA分子
B.定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C.在生物体外对DNA分子进行改造
D.定向地改造生物体的遗传性状
解析：D 基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物体的遗传性状，D正确。
2.玉米的PEPC酶固定CO2的能力较水稻的强60倍。我国科学家正致力于将玉米的PEPC基因导入水稻中，以提高水稻产量。下列有关该应用技术的叙述，不正确的是（ ）
A.该技术是在DNA水平上进行设计和施工的
B.该技术的操作环境是生物体内
C.该技术的原理是基因重组
D.该技术的优点是定向产生人类需要的生物类型
解析：B 由题意可知，该技术为基因工程，是在生物体外进行的操作。
3.科学家把兔子血红蛋白基因导入大肠杆菌细胞中，在大肠杆菌细胞中合成了兔子的血红蛋白。下列关于这一先进技术的理论依据，不正确的是（ ）
A.所有生物共用一套遗传密码
B.基因能控制蛋白质的合成
C.兔子血红蛋白基因与大肠杆菌的DNA都是由四种脱氧核苷酸构成，都遵循相同的碱基互补配对原则
D.兔子与大肠杆菌有共同的原始祖先
解析：D 题干表述的是目的基因导入受体细胞并得以表达的过程，目的基因在不同生物细胞中能够表达出相同的蛋白质，说明控制其合成的mRNA上的密码子是共用的，相同的密码子决定相同的氨基酸，A正确；基因通过转录获得mRNA，进而控制蛋白质的合成，B正确；基因通常是有遗传效应的DNA片段，只要是双链DNA都遵循碱基互补配对原则，其组成原料都是四种脱氧核苷酸，C正确；生物之间是否有共同的原始祖先与转基因技术之间没有必然关系，D错误。
知识点二 重组DNA技术的基本工具
4.限制酶和DNA连接酶是基因工程的工具酶，以下说法正确的是（ ）
A.DNA连接酶能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯键
B.限制酶只能切割双链DNA片段，不能切割烟草花叶病毒的核酸
C.E.coli DNA连接酶既能连接黏性末端，也能连接平末端
D.限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，所以也能剪切自身的DNA
解析：B DNA连接酶连接的是两个DNA片段，A错误；限制酶只能切割DNA分子，烟草花叶病毒的核酸是RNA，不能切割，B正确；E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，不能连接平末端，C错误；限制酶主要从原核生物中分离纯化而来，但是不会剪切自身的DNA，D错误。
5.（2024·河南开封高二期末）以下是几种不同限制性内切核酸酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列叙述错误的是（ ）
A.以上DNA片段是由5种限制酶切割后产生的
B.若要把相应片段连接起来，应选用DNA连接酶
C.上述能进行连接的两个黏性末端，其连接后形成的DNA序列是
D.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
解析：A 从黏性末端是否相同可以看出，①④是由同一种限制酶切割的，其他片段是由不同的限制酶切割的，因此以上DNA片段是由4种限制酶切割后产生的，A错误；DNA相应片段的连接应用DNA连接酶，B正确；①④黏性末端相同，连接后形成的DNA序列是，C正确；DNA连接酶能将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，D正确。
6.（2024·天津静海高二阶段练习）有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是（ ）
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲与丙的黏性末端不互补
C.DNA连接酶的作用位点是a处
D.切割产生甲的限制酶识别的核苷酸序列是“CAATTG”
解析：D 切割产生甲的限制酶的识别序列为GAATTC∥CTTAAG，切割产生乙的限制酶的识别序列为CAATTG∥GTTAAC，切割产生丙的限制酶的识别序列为CTTAAG∥GAATTC。三者的识别序列和切割位点不同，由此可见，甲、乙、丙的黏性末端是由三种限制酶切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端相同，因此可在DNA连接酶的作用下形成重组DNA分子；但甲、丙的黏性末端不同，它们之间不能形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成磷酸二酯键，a处是磷酸二酯键，C正确。切割产生甲的限制酶的识别序列为“GAATTC”，D错误。
7.（2024·湖北孝感期末）20世纪60年代末美国微生物学家哈密尔顿·史密斯发现第一种限制性内切核酸酶，获得了开启DNA宝藏的钥匙，目前已发现的限制酶超过了四千种，极大地推动了对DNA分子的研究和操作。表中列出了几种限制酶的识别序列和切割位点。下列叙述正确的是（ ）
限制酶 识别序列和切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATCC-3'
Sau3A Ⅰ 5'-↓GATC-3'
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
Bgl Ⅱ 5'-A↓GATCT-3'
Kpn Ⅰ 5'-GGTAC↓C-3'
Acc65 Ⅰ 5'-G↓GTACC-3'
A.表中的6种限制酶切割形成的末端中，既有黏性末端又有平末端
B.BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端相互连接后，不能再被Sau3AⅠ切割
C.Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的末端相互连接后，可以重新被Acc65Ⅰ或KpnⅠ切割
D.分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA，前者得到的片段长度明显短于后者
解析：D 表中的6种限制酶切割形成的末端中，均为黏性末端，A错误；BamHⅠ和Sau3AⅠ切割形成的末端，可以相互连接，连接形成的DNA序列中还存在Sau3AⅠ的识别序列和切割位点，故能再被Sau3AⅠ切割，B错误；Acc65Ⅰ和KpnⅠ切割形成的黏性末端序列无法配对，而且磷酸端（5'端）也不能与磷酸端（5'端）连接，既然不能连接也就不存在重新切割，C错误；Sau3A Ⅰ识别序列为4个碱基，而BglⅡ识别序列为6个碱基，因此分别用Sau3AⅠ和BglⅡ切割随机序列DNA，前者得到的片段长度明显短于后者，D正确。
8.下图为不同限制酶识别的序列及切割位置（箭头所指），下列叙述错误的是（ ）
A.若DNA上的碱基随机排列，理论上每4 096个碱基对会有一个BamH Ⅰ限制酶的切割位点
B.若DNA上的碱基随机排列，Not Ⅰ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低
C.作为基因工程的通用载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位点
D.BamHⅠ限制酶切割的DNA无法连接到用Bgl Ⅱ切割的载体DNA中
解析：D BamH Ⅰ限制酶的识别序列具有6个碱基对，若DNA上的碱基随机排列，理论上每46＝4 096个碱基对会有一个BamHⅠ限制酶的切割位点，A正确；NotⅠ限制酶的识别序列具有8个碱基对，而其他三种限制酶的识别序列均为6个碱基对，故若DNA上的碱基随机排列，NotⅠ限制酶切割位点出现频率较其他三种限制酶低，B正确；作为基因工程的最常用的载体，质粒上通常会有多种限制酶的切割位点，C正确；BamHⅠ限制酶切割的DNA产生的黏性末端和用BglⅡ切割的载体DNA产生的黏性末端可以互补配对，故BamHⅠ限制酶切割的DNA可以连接到用BglⅡ切割的载体DNA中，D错误。
知识点三 DNA的粗提取与鉴定
9.以菜花为材料进行“DNA粗提取与鉴定”的实验，下列操作与其目的错误的是（ ）
选项 A B C D
加入试剂 蒸馏水 2 mol/LNaCl溶液 研磨液 95％的冷酒精
目的 使细胞破裂 溶解DNA 裂解细胞膜 析出DNA
解析：A 植物细胞具有细胞壁，加入蒸馏水不会使细胞吸水涨破，A错误；DNA可溶于2 mol/L NaCl溶液，加入2 mol/L NaCl溶液是为了溶解DNA，B正确；加入研磨液的作用是裂解细胞膜，有利于DNA释放，C正确；DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精，故加入95％的冷酒精可析出DNA，D正确。
10.（2024·广东珠海高二期中）下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是（ ）
A.用蒸馏水使家兔的红细胞涨破，可获取富含DNA的滤液
B.DNA不溶于95％的冷酒精，但可溶于2 mol/L的NaCl溶液
C.新鲜的洋葱和猪肝可作为实验材料提取DNA，而菠菜不能用于提取DNA
D.鉴定DNA时，应将丝状物直接加入到二苯胺试剂中并进行沸水浴
解析：B 家兔属于哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核，不能用于DNA的粗提取，A错误；DNA含量高，并且材料易得的生物都可以作为提取DNA的材料，所以菠菜也可以作为提取DNA的材料，C错误；鉴定DNA时，应先将丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液后，再加入二苯胺试剂，进行沸水浴，冷却后溶液呈蓝色，D错误。
11.（2024·山东聊城期末）“SDS法”是提取DNA的常用方法，其提取液成分中的SDS能使蛋白质变性，EDTA是DNA酶抑制剂，Tris作为缓冲剂。下列说法错误的是（ ）
A.SDS能破坏蛋白质空间结构，从而促进DNA和蛋白质分离
B.EDTA能减少DNA水解，提高DNA的完整性
C.Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定，保证DNA结构正常
D.提取到的DNA可在常温下用二苯胺试剂进行鉴定
解析：D 由题干可知，SDS能使蛋白质变性，破坏蛋白质空间结构，从而促进DNA和蛋白质分离，A正确；EDTA是DNA酶抑制剂，能减少DNA水解，提高DNA的完整性和总量，B正确；Tris作为缓冲剂能维持pH的稳定，可以防止DNA结构被破坏，保证DNA结构正常，C正确；鉴定DNA的方法是沸水浴下用二苯胺试剂鉴定，D错误。
12.某线性DNA分子含有5 000个碱基对（bp），先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如表所示。限制酶a、b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是（ ）
酶a切割产物长度/bp 酶b再次切割产物长度/bp
2 100；1 400；1 000；500 1 900；200；800；600；1 000； 500
A.酶a与酶b切断的化学键不相同
B.酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接
C.该DNA分子中酶a与酶b的识别序列分别有 3个和2个
D.若酶a完全切割与该DNA序列相同的质粒，得到的切割产物有4种
解析：C 酶a与酶b切断的化学键均为磷酸二酯键，A错误。酶a与酶b切出的黏性末端相同，用DNA连接酶可以将它们连接起来，B错误。由题表可知，限制酶a可以把DNA分子切成4段，说明该DNA分子上限制酶a的切割位点有3个；限制酶b把长度为2 100 bp的DNA片段切割成长度分别为1 900 bp和200 bp的两个DNA片段，把长度为1 400 bp的DNA片段切割成长度分别为800 bp和600 bp的两个DNA片段，说明限制酶b在该DNA分子上有2个切割位点，所以酶a与酶b的识别序列分别有3个和2个，C正确。用酶a切割与该DNA序列相同的质粒（环状的），可得到3种大小不同的切割产物，D错误。
13.（多选）（2024·河北衡水冀州一中期中）酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。下列叙述正确的是（ ）
A.多个片段乙与多个片段丁混合在一起，可用DNA连接酶拼接得到环状DNA
B.多个片段乙与多个片段丁混合，只由两个DNA片段连接成的DNA共有4种
C.一种限制性内切核酸酶只能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列
D.若酶M特异性剪切的DNA片段是，则酶N特异性剪切的DNA片段是
解析：ACD 多个片段乙和多个片段丁混合在一起，用DNA连接酶拼接可得到环状DNA，A正确；多个片段乙和多个片段丁混合，只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有3种，即片段乙自身连接、片段丁自身连接，片段乙和片段丁连接，B错误；限制酶具有特异性，一种限制酶只能识别双链DNA中某种特定的核苷酸序列，C正确；根据图中酶M和酶N切割后的结果，若酶M特异性剪切的DNA片段是，则酶N特异性剪切的DNA片段是，D正确。
14.（多选）（2024·山东枣庄高二期末）如表为常用的限制性内切核酸酶（限制酶）及其识别序列和切割位点，由此推断以下说法，错误的是（ ）
限制酶名称 识别序列和 切割位点 限制酶名称 识别序列和 切割位点
BamHⅠ ↓ GGATCC KpnⅠ ↓ GGATCC
EcoRⅠ ↓ CAATTC Sau3AⅠ ↓ GATC
HindⅡ ↓ GTYRAC SmaⅠ ↓ CCCGGG
注：Y＝C或T，R＝A或G。
A.限制酶SmaⅠ切割后形成的末端可用E.coli DNA连接酶连接
B.Sau3AⅠ限制酶的切割位点在识别序列的外部
C.BamHⅠ和Sau3AⅠ两种限制酶切割后形成相同的黏性末端
D.一种限制酶一定只能识别一种核苷酸序列
解析：AD 限制酶SmaⅠ的切割位点在中轴线上，切割后形成平末端，E.coli DNA连接酶只能连接黏性末端，A错误；一种限制酶只能识别特定的脱氧核苷酸序列，并在特定位点切割DNA分子，并非只能识别一种核苷酸序列，如表格中限制酶HindⅡ识别的核苷酸序列不止一种，D错误。
15.图中甲、乙分别表示质粒和含目的基因的DNA片段，几种可供选择使用的限制酶识别序列及其切割位点如下：
注：TetR表示四环素抗性基因；AmpR表示氨苄青霉素抗性基因。
回答下列问题。
（1）限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶，切割相应DNA片段后能产生黏性末端的有EcoRⅠ、BamHⅠ、BclⅠ、Sau3AⅠ。
（2）经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与上述其余限制酶中的BamHⅠ、BclⅠ （填限制酶名称）切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒经Sau3AⅠ完全切割后可得到3种DNA片段。
（3）图甲中的TetR和AmpR在载体上可作为标记基因，用于重组DNA的筛选。
解析：（1）限制酶的作用是识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。题中可供使用的限制酶切割相应片段后都会产生黏性末端。（2）经限制酶Sau3AⅠ切割后得到的DNA片段可以与BamHⅠ、BclⅠ切割后得到的DNA片段连接，理由是它们切割后产生的片段具有相同的黏性末端。图中甲质粒有3个Sau3AⅠ的切割位点（TetR上有1个，AmpR上有2个），所以经Sau3A Ⅰ完全切割后可得到3种DNA片段。（3）图甲中的TetR和AmpR都是抗性基因，在载体上可以作为标记基因，用于重组DNA的筛选。
16.目前基因工程所用的质粒载体主要是以天然细菌质粒的各种元件为基础重新组建的人工质粒，pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。
（1）构建人工质粒时要有抗性基因，以便于筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞。
（2）pBR322分子中有单个EcoRⅠ限制酶作用位点，EcoRⅠ只能识别序列—GAATTC—，并只能在G和A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoRⅠ的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。
答案：如下所示：
目的基因
—G AATTC—…… —G AATTC—
—CTTAA G—…… —CTTAA G—
（3）pBR322分子中另有单个的BamHⅠ限制酶作用位点，现将经BamHⅠ处理后的质粒与用另一种限制酶BglⅡ处理得到的目的基因，通过DNA连接酶作用恢复磷酸二酯键，成功获得了重组质粒，说明两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的黏性末端相同。
（4）为了检测上述重组质粒是否导入原本无AmpR和TetR的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面蘸上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果（空圈表示与图二对照无菌落的位置）。与图三空圈相对应的图二中的菌落表型是能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
解析：（1）质粒作为基因表达载体的条件之一是要有抗性基因，以便于筛选（鉴别）目的基因是否导入受体细胞。（2）同一种限制酶切割DNA分子产生的黏性末端相同，根据题意可知：该目的基因两侧被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端为见答案。（3）DNA连接酶催化两个DNA片段形成磷酸二酯键；而通过DNA连接酶作用能将两个DNA分子片段连接，表明经两种限制酶（BamHⅠ和BglⅡ）切割得到的DNA片段，其黏性末端相同。（4）由题意知：由于与图三空圈相对应的大肠杆菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长，而不能在含四环素的培养基上生长，故可推知与图三空圈相对应的图二中的菌落能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素。由图二、图三结果显示，多数大肠杆菌都能抗氨苄青霉素，而经限制酶BamHⅠ作用后，标记基因TetR被破坏，故导入目的基因的大肠杆菌不能抗四环素，即多数大肠杆菌导入的是pBR322质粒。
17.用DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4种限制性内切核酸酶的切割位点如图所示。
↓ ↓ ↓ ↓
GAATTC CCCGGG CTGCAG GATATC
CTTAAG GGGCCC GACGTC CTATAG
↑ ↑ ↑ ↑
限制酶：EcoRⅠ SmaⅠ PstⅠ EcoRⅤ
回答下列问题：
（1）常用的DNA连接酶有E.coli DNA连接酶和 T4 DNA 连接酶。上图中EcoRⅠ、PstⅠ酶切割后的DNA片段可以用E.coli DNA连接酶连接。上图中EcoRⅠ、SmaⅠ、PstⅠ、EcoR Ⅴ 酶切割后的DNA片段可以用T4 DNA连接酶连接。
（2）DNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是磷酸二酯键。
（3）DNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征。如质粒DNA分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能复制；质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，便于外源DNA插入；质粒DNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是选择性培养。
解析：（1）由题图可以看出，EcoR Ⅰ、Sma Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅴ切割后分别形成黏性末端、平末端、黏性末端和平末端，E.coli DNA连接酶可用于连接黏性末端，T4 DNA连接酶可用于连接黏性末端和平末端。（2）DNA连接酶催化DNA链的5'端与另一DNA链的3'端生成磷酸二酯键。（3）复制原点是在基因组上复制起始的一段序列，可以保证质粒在宿主细胞中进行复制。质粒上有一个至多个限制酶切割位点，该位点可被限制酶切开并使外源目的基因插入其中。在含有特定抗生素的培养基上进行选择性培养可以将含质粒载体的细胞筛选出来。
12 / 18第4节 蛋白质工程的原理和应用
导学 聚焦 1.运用结构与功能观等观念，说明蛋白质工程设计的原理。 2.基于蛋白质工程的实例，运用模型与建模、归纳与概括等方法，用文字、图示或模型的形式表示蛋白质工程的基本思路
知识点（一） 蛋白质工程崛起的缘由及基本原理
1.蛋白质工程的概念
2.蛋白质工程崛起的缘由
（1）崛起缘由
①基因工程的实质：将一种生物的 基因 转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的 蛋白质 ，进而表现出 新的性状 。
②基因工程的不足：基因工程原则上只能生产自然界中 已存在 的蛋白质。
③天然蛋白质的不足：天然蛋白质的结构和功能符合 特定物种 生存的需要，却不一定完全符合 人类生产和生活 的需要。
（2）实例：提高玉米赖氨酸含量
改造后玉米叶片和种子中游离赖氨酸含量分别提高5倍和2倍。
3.蛋白质工程的基本原理
4.判断下列有关表述的正误
（1）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。（ × ）
提示：蛋白质工程中直接改造的是基因，不是蛋白质。
（2）蛋白质工程能产生自然界中不存在的新型蛋白质分子。（ √ ）
（3）实施蛋白质工程的前提条件是了解蛋白质结构和功能的关系。（ √ ）
（4）基因工程遵循中心法则，而蛋白质工程不遵循。（ × ）
提示：蛋白质工程的基本思路是按照中心法则相反的过程进行的。
（5）根据某多肽链的一段氨基酸序列，可以很容易地确定控制该肽链合成的基因的脱氧核苷酸序列。（ × ）
提示：由于密码子的简并性，根据某多肽链的一段氨基酸序列，不能确定基因的脱氧核苷酸序列。
探讨 基因工程和蛋白质工程的比较
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质。蛋白质工程的目标是生产出符合人类生产和生活需要的蛋白质，甚至是自然界不存在的蛋白质。结合图示回答有关问题：
（1）写出流程图中字母代表的含义：
A. 预期功能 ；B. 氨基酸序列 ；C. 改造或合成 ；D. 转录 ；E. 翻译 。
（2）上图字母中属于中心法则的过程有 D、E ，属于蛋白质工程的过程有 A、C 。
（3）对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？原因是什么？
提示：应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。主要原因是①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传。
（4）蛋白质工程和基因工程的操作对象以及得到的蛋白质相同吗？分别体现在哪些方面？
提示：不同。体现：①操作对象不同：蛋白质工程的操作对象是天然基因改造后的基因；基因工程的操作对象是天然基因。②得到的蛋白质不同：蛋白质工程可以得到自然界没有的新的蛋白质；基因工程得到的是自然界原有的蛋白质。
蛋白质工程与基因工程的区别和联系
1.下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述中，正确的是（ ）
A.蛋白质工程难度很大是因为对蛋白质的高级结构了解不够
B.基因工程和蛋白质工程都可以生产自然界不存在的蛋白质
C.不同来源的DNA分子能够拼接，其原因是所有生物共用一套遗传密码
D.基因工程的直接操作对象是基因，蛋白质工程的直接操作对象是蛋白质
解析：A 蛋白质的空间结构复杂，蛋白质工程难度很大是因为对蛋白质的高级结构了解不够，A正确；基因工程生产自然界已有的蛋白质，蛋白质工程生产自然界中不存在的蛋白质，B错误；不同来源的DNA分子能够拼接，其原因是不同来源的DNA分子具有相同的结构及遵循碱基互补配对原则，C错误；蛋白质工程需要进行基因修饰或合成，蛋白质工程的直接操作对象仍然是基因，D错误。
2.为心梗患者注射大剂量的t-PA（一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，主要由血管内皮细胞合成、分泌并释放进血液）会诱发颅内出血。研究证实，将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，能显著降低出血等副作用，据此分析错误的是（ ）
A.若利用大肠杆菌来生产t-PA，需要对其合成的t-PA进行后期改造
B.改造t-PA的技术属于蛋白质工程
C.欲将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应直接对蛋白质（t-PA）进行改造
D.可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t-PA
解析：C 由于大肠杆菌只有核糖体一种细胞器，不含内质网和高尔基体，无法对t-PA进行加工，故若利用大肠杆菌来生产t-PA，需要对其合成的t-PA进行后期改造，A正确；分析题意，本技术是将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，属于蛋白质工程，B正确；欲将t-PA第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，应对相应的基因进行改造，C错误；t-PA是一种能高效降解血栓的单链糖蛋白，由于抗原与抗体的结合具有特异性，故可利用抗原—抗体杂交技术来检测转基因的大肠杆菌是否分泌了t-PA，D正确。
规律方法
“二看法”判断基因工程和蛋白质工程
知识点（二） 蛋白质工程的应用
1.在医药工业方面的应用
2.在其他方面的应用
3.判断下列有关表述的正误
（1）蛋白质工程不能改变蛋白质的活性。（ × ）
提示：通过蛋白质工程可以改变蛋白质的活性。
（2）蛋白质工程是一项难度很大的工程，主要是因为人们对蛋白质复杂的高级结构没有完全认识。（ √ ）
（3）科学家利用蛋白质工程的思路来设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治害虫的效果增强。（ √ ）
探讨 分析蛋白质工程的应用
1.研究人员试图将人胰岛素的B链的第28位氨基酸由脯氨酸替换为天冬氨酸，从而有效抑制胰岛素的聚合，获得速效胰岛素类似物，应该如何操作？
提示：应将基因相应位置上的碱基进行替换，从而使其指导合成的胰岛素相应位置上的氨基酸发生改变。
2.为什么改变一个氨基酸就可以改变蛋白质的稳定性甚至某种蛋白酶的活性？
提示：蛋白质的结构是由其氨基酸组成决定的，个别氨基酸的改变就会导致其结构的改变，从而影响到其性质和功能。
3.如果已经推测出多肽中的氨基酸序列，那么推测出的基因中的碱基序列是否唯一呢？并说明理由。
提示：不唯一；因为一个氨基酸是由一个或多个密码子决定的，因此获得的基因中的碱基序列有多种。
1.科研人员利用相关技术改变了胰岛素B链的某区域氨基酸的组成，从而避免了胰岛素结合成无活性的二聚体形式。下列相关叙述，不正确的是（ ）
A.该过程的操作对象是胰岛素分子
B.可通过测定DNA序列确定突变是否成功
C.对胰岛素结构的改造属于蛋白质工程
D.胰岛素的本质是蛋白质，不宜口服使用
解析：A 蛋白质工程的直接操作对象是基因，而不是蛋白质，A错误；可通过测定DNA序列确定突变是否成功，B正确；胰岛素是蛋白质，对蛋白质结构的改造属于蛋白质工程，C正确；胰岛素为蛋白质，若口服会被消化酶分解，因此胰岛素不宜口服使用，D正确。
2.某病毒通过表面刺突蛋白（S蛋白）的活性域（RBD）与人体细胞表面的ACE2受体相互作用感染细胞。科学家设计了一种自然界中不存在的蛋白质LCB1，可与S蛋白的RBD紧密结合，以干扰该病毒的感染。下列说法不合理的是（ ）
A.LCB1的结构可能与抗S蛋白的抗体有相似之处
B.S蛋白的RBD结构可以为设计LCB1提供信息
C.生产LCB1用到了基因工程的操作技术
D.可直接从细胞中获取基因用于LCB1的生产
解析：D 抗S蛋白的抗体能与S蛋白的RBD特异性结合，而LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，说明LCB1的结构可能与抗S蛋白的抗体类似，A正确；由于LCB1可与S蛋白RBD紧密结合，故LCB1可依据S蛋白的RBD结构进行设计，B正确；生产LCB1用到了蛋白质工程，其中一些步骤用到了基因工程的操作技术，例如人工合成DNA，C正确；由题意可知蛋白质LCB1是一种自然界中不存在的蛋白质，故不能从细胞中获取相应的基因，D错误。
（1）蛋白质工程是指 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求 。
（2）基因工程原则上只能生产 自然界中已存在 的蛋白质。
（3）蛋白质工程的基本思路是 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 。
1.（2024·江苏连云港高二期中）下列各项与蛋白质工程没有直接关系的是（ ）
A.利用各种高科技手段分析蛋白质的分子结构
B.研究并改变某种蛋白质相关基因的碱基序列
C.设计和制造自然界中没有的人工蛋白质
D.将编码牛凝乳酶的基因导入酵母菌的基因组中获得凝乳酶
解析：D 将编码牛凝乳酶的基因导入酵母菌的基因组中获得凝乳酶是基因工程的成果，与蛋白质工程没有直接关系，D符合题意。
2.（2024·北京丰台期中）蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的基础上进行的，它最终要达到的目的是（ ）
A.分析蛋白质的三维结构
B.研究蛋白质的氨基酸组成
C.获取编码蛋白质的基因序列信息
D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质
解析：D 分析蛋白质的三维结构是蛋白质工程的准备工作，A不符合题意；研究蛋白质的氨基酸组成是为了设计或改造相关基因，这不是蛋白质工程的最终目的，B不符合题意；获取编码蛋白质的基因序列信息可以实现对基因的修饰或合成，但不是蛋白质工程要达到的最终目的，C不符合题意；改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，从而满足人类的需求，这是蛋白质工程的最终目的，D符合题意。
3.（2024·安徽淮南期末）如图所示是利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素（一种糖蛋白）的核心流程，下列叙述正确的是（ ）
A.该过程得到的干扰素与自然界中的干扰素相同
B.图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往是唯一的
C.蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系
D.蛋白质工程是通过对蛋白质的结构进行修饰或合成来操作的
解析：C 题图所示是利用蛋白质工程生产保存时间更久的干扰素，该过程得到的干扰素是经过改造的，与自然界中的干扰素不完全相同，A错误；由于密码子的简并，图中③过程得到的脱氧核苷酸序列往往不是唯一的，B错误；结构与功能相适应，因此，蛋白质工程的基础是蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系，C正确；蛋白质工程是通过对基因进行修饰或合成来操作的，D错误。
4.（2024·广东揭阳期末）神经科学家设计了一种合成蛋白质LIMK1（结合ATP并磷酸化其靶标的蛋白质），能改善老年认知退化人群的记忆功能。下列叙述不正确的是（ ）
A.设计蛋白质LIMK1时，先设计其基因的碱基序列再推测其功能
B.通过基因定点突变技术可对LIMK1蛋白基因进行碱基的替换
C.设计蛋白质LIMK1利用的技术是蛋白质工程，其可制造新的蛋白质
D.蛋白质的高级结构十分复杂，故蛋白质工程是一项难度很大的工程
解析：A 蛋白质工程的基本途径是：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），A错误。
知识点一 蛋白质工程崛起的缘由及基本原理
1.下列关于蛋白质工程的说法，错误的是（ ）
A.蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构，使之更加符合人类需要
B.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构
C.蛋白质工程能产生自然界中不曾存在的新型蛋白质分子
D.蛋白质工程的操作起点是从预期的蛋白质功能出发，设计出相应的基因，并借助基因工程实现
解析：B 基因的结构决定蛋白质的结构，对蛋白质的结构进行设计改造是通过改造或合成基因来完成的，而不是直接对蛋白质分子进行操作，B错误。
2.蛋白质工程的基本工作思路是（ ）
①合成DNA ②预计蛋白质的功能 ③推测DNA序列 ④设计蛋白质的结构 ⑤推测氨基酸的序列 ⑥将合成的DNA导入受体细胞并表达
A.②④⑤③①⑥ B.④②⑥③⑤①
C.④①②③⑤⑥ D.③④⑤①②⑥
解析：A 蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因，最后按照基因工程的一般步骤进行，获得所需要的蛋白质。因此，正确的顺序是②④⑤③①⑥。
3.（2024·山东济南高二期末）科学家将胰岛素的第28和29位的氨基酸调换顺序，成功获得了速效胰岛素，生产速效胰岛素时需要定向改造的对象是（ ）
A.胰岛素 B.胰岛素mRNA
C.胰岛素基因 D.胰岛B细胞
解析：C 对天然蛋白质进行改造，是通过对基因的操作来实现的。
4.T4溶菌酶在高温时易失去活性。研究人员对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成一个二硫键，提高了酶的耐热性。下列相关叙述正确的是（ ）
A.T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸数量发生了改变
B.T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，自然界中的酶都可通过蛋白质工程进行改造
C.蛋白质工程与中心法则的流动方向一致，即DNA→mRNA→蛋白质
D.若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响
解析：D 由题意可知，T4溶菌酶耐热性提高的原因是组成该酶的氨基酸种类及空间结构发生了改变，A错误；T4溶菌酶的改造属于蛋白质工程，大多数酶是蛋白质，少数酶是RNA，蛋白质工程只能用于改造蛋白质，B错误；蛋白质工程与中心法则的流动方向相反，C错误；结构与功能相适应，若高温使蛋白质分子的空间结构发生改变，蛋白质的功能也会受到影响，D正确。
知识点二 蛋白质工程的应用
5.L-天冬酰胺酶对于治疗小儿白血病特别有效，但在临床应用中经常出现过敏反应。科研人员预期在L-天冬酰胺酶的基础上研发药效强但免疫性弱的蛋白质药物，下一步要做的是（ ）
A.合成编码L-天冬酰胺酶的DNA片段
B.构建含L-天冬酰胺酶基因片段的表达载体
C.设计出药效强但免疫性弱的蛋白质结构
D.利用抗原—抗体杂交等方法对表达产物进行检测
解析：C 合成编码L-天冬酰胺酶的DNA片段的上一步骤应该是根据L-天冬酰胺酶氨基酸序列推断编码L-天冬酰胺酶的DNA序列，A错误；构建含L-天冬酰胺酶基因片段的表达载体的上一步骤应该是合成编码L-天冬酰胺酶的DNA片段，B错误；设计出药效强但免疫性弱的蛋白质结构的上一步骤是确定预期蛋白质功能，C正确；利用抗原—抗体杂交等方法对表达产物进行检测是已经表达出相应产物以后的操作，D错误。
6.已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。下列叙述正确的是（ ）
A.从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的氨基酸序列（或结构）进行改造
B.直接对蛋白质的氨基酸序列（或结构）进行修饰改造，是蛋白质工程的范畴
C.改变后的蛋白质（P1）与蛋白质（P）的结构相同，功能不同
D.蛋白质工程已被广泛发展应用，极大地满足了人类生产生活的需要
解析：A 蛋白质工程通过改造或合成基因来完成对蛋白质的改造，而不是直接对蛋白质的氨基酸序列（或结构）进行修饰改造，B错误；改变后的蛋白质（P1）与蛋白质（P）的结构不相同，功能不同，C错误；由于人们对蛋白质的空间结构了解较少，因此蛋白质工程还没有被广泛发展应用，D错误。
7.（2024·湖南衡阳高二质检）下列不属于蛋白质工程的成果的是（ ）
A.改造蛋白质类酶的结构，提高其热稳定性
B.生产鼠—人嵌合抗体
C.将干扰素分子中的半胱氨酸替换为丝氨酸
D.将人的胰岛素基因整合到大肠杆菌体内生产胰岛素
解析：D 将人的胰岛素基因整合到大肠杆菌体内生产胰岛素是基因工程的成果。
8.干扰素是动物体内的一种蛋白质，可以用于治疗病毒的感染和癌症，但在体外保存相当困难。如图是利用蛋白质工程设计干扰素的生产流程图。据图分析，下列叙述错误的是（ ）
A.图中构建新的干扰素模型的主要依据是预期的蛋白质功能
B.图中新的干扰素基因必须加上启动子和终止子才能表达
C.图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构
D.图中各项技术并没有涉及基因工程技术
解析：D 由题干可知，构建新的干扰素模型要利用蛋白质工程，而蛋白质工程的主要依据就是预期的蛋白质功能，A正确；新的干扰素基因合成之后，要在受体细胞中表达，必须构建基因表达载体，基因表达载体的组成包括启动子和终止子等，B正确；蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，因此题图中改造干扰素结构的实质是改造干扰素基因的结构，C正确；题图中，合成新的干扰素基因后，要构建基因表达载体，并将其导入受体细胞中才能表达，这属于基因工程技术，D错误。
9.如图是科学家对鼠源杂交瘤抗体进行改造，生产出效果更好的鼠—人嵌合抗体的过程。下列说法正确的是（ ）
A.生产鼠—人嵌合抗体的过程属于基因工程
B.对鼠源杂交瘤抗体进行改造的难点是设计嵌合抗体的空间结构
C.对鼠源杂交瘤抗体进行改造，是通过基因定点诱变技术改造基因实现的
D.鼠—人嵌合抗体的使用对人体不会产生任何不良反应
解析：B 生产鼠—人嵌合抗体的过程属于蛋白质工程，A错误；对鼠源杂交瘤抗体进行改造，首先要根据预期嵌合抗体功能（或蛋白质功能），设计嵌合抗体结构，然后通过基因拼接，将鼠源抗体基因改造成鼠—人嵌合抗体基因，最后导入鼠淋巴细胞中表达，而不是通过基因定点诱变技术改造基因实现的，C错误；从免疫的角度考虑，对人体来说鼠源抗体为抗原，若利用人的抗体与之嵌合，则排斥作用会减轻，对人体的副作用会减少，而不是不会产生任何不良反应，D错误。
10.（多选）水蛭素（EH）具有较好的抗凝血活性，临床上被用作抗血栓药物。利用酵母菌工业化生产EH时，生产周期长、目标蛋白表达效率较低；利用大肠杆菌进行生产时，基因的转录和翻译都正常，但多肽链错误折叠，产生的无活性的EH会聚集形成水不溶性的包涵体。研究人员通过改造EH基因，以期获得能在大肠杆菌中表达的可溶性EH。下列有关叙述，正确的是（ ）
A.大肠杆菌在细胞增殖和代谢速率上较快，可用来改进酵母菌生产EH时的缺点
B.包涵体中错误折叠的EH与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上有较大差异
C.要得到能表达可溶性EH的大肠杆菌，需要用Ca2＋处理大肠杆菌
D.判断转基因大肠杆菌是否成功，需要对可溶性EH的抗凝血活性进行测定
解析：ACD 大肠杆菌是原核生物中的细菌类，繁殖速度和代谢速率都较快，可以用来改进酵母菌生产EH时生产周期长、目标蛋白表达效率较低的缺点，A正确；利用大肠杆菌进行生产时，基因的转录和翻译都正常，说明在核糖体上合成的多肽正常，与酵母菌生产的EH在氨基酸序列上应该相同，B错误；在基因工程操作中，受体细胞是原核生物（如大肠杆菌）时，为提高转化效率，可Ca2＋处理大肠杆菌，使细胞处于一种更容易吸收周围DNA分子的生理状态，促进重组质粒的转入， C正确；转基因大肠杆菌是否成功，还需要在个体水平进行检测，即对可溶性EH的抗凝血活性进行测定，D正确。
11.（2022·湖南高考22题）水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
（1）蛋白质工程流程如图所示，物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子具有简并性。
（2）蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取目的基因、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是DNA复制。
（3）将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类 （填“种类”或“含量”）有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度的破坏。
（4）若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：取3支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物（如家兔）血液，立即将等量的血液分别加入3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间。
解析：（1）天然蛋白质合成的过程是按照中心法则进行的，即基因→表达（转录和翻译）→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→行使生物功能，而蛋白质工程却与之相反，它的基本思路是从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因），因此题图中的物质a是氨基酸序列多肽链，物质b是mRNA，在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象相同的原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。（3）由题图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且差别不大；而水解产物中抗凝血活性有差异，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度的破坏。（4）该实验的目的是比较三种物质抗凝血活性差异，实验设计思路为将等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别与同一种动物的等量血液混合，观察并记录血液凝固时间即可。
11 / 11第2课时 将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定
导学 聚焦 1.基于抗虫棉的培育实例，构建模型分析基因工程的基本操作程序。 2.明确DNA片段的扩增及电泳鉴定原理，进行相关操作
知识点（一） 将目的基因导入受体细胞
1.转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内 维持稳定 和 表达 的过程。
2.目的基因导入受体细胞的方法
（1）目的基因导入植物细胞
①花粉管通道法
a.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入 子房 中。
b.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助 花粉管通道 进入胚囊。
②农杆菌转化法
（2）目的基因导入动物细胞
（3）目的基因导入微生物细胞
3.判断下列有关表述的正误
（1）花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法，主要适用于双子叶植物和裸子植物。（ × ）
提示：农杆菌转化法主要适用于双子叶植物和裸子植物。
（2）农杆菌侵入植物细胞后，其Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。（ √ ）
（3）培育转基因动物时，常选择受精卵作为受体细胞，利用显微注射法将目的基因直接注入受精卵中。（ √ ）
（4）将目的基因导入原核细胞时，通常用大肠杆菌作为受体细胞，并需要用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的状态。（ √ ）
探讨 分析将目的基因导入受体细胞
下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：
（1）在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上的原因是什么？
提示：原因是农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上。
（2）将基因表达载体导入农杆菌细胞时，应怎样处理农杆菌细胞？
提示：基因表达载体（重组质粒）导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。
（3）目的基因导入受体细胞时，不同生物常用的受体细胞分别是什么？
提示：①对于植物来说，受体细胞可以是受精卵或体细胞，因为植物细胞具有且容易表现全能性。
②对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵表现全能性相对容易，而高度分化的动物体细胞的全能性不易表现。
③大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞（具有多种细胞器），所以酵母菌在用于生产需要加工和分泌的蛋白质时比大肠杆菌有优势。
1.目的基因导入不同受体细胞的方法
2.农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
（1）第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上，第二次拼接（非人工直接操作）是指插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。
（2）第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌（Ca2＋处理法），第二次导入（非人工直接操作）是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞（农杆菌转化法）。
1.我国科学家在进行抗虫棉的培育过程中独创了“花粉管通道法”，该方法有多种操作方式。如图表示花粉管通道法介导植物基因转移。下列相关说法错误的是（ ）
A.随着转化方法的突破，用农杆菌侵染水稻、玉米等多种单子叶植物也取得了成功
B.相比于基因枪法和农杆菌转化法，花粉管通道法避免了植物组织培养这一操作
C.必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法
D.外源DNA不需要构建基因表达载体，就能借助花粉管通道进入受体细胞并表达
解析：D 相比于基因枪法和农杆菌转化法，花粉管通道法直接将目的基因导入受精卵，避免了植物组织培养这一操作，B正确；必须在雌蕊成熟时才能进行图中所示的处理方法，C正确；利用花粉管通道法时，也要先构建基因表达载体，然后再借助花粉管通道进入受体细胞并表达，D错误。
2.如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是（ ）
A.过程A需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶的参与
B.过程B通常需要用CaCl2溶液处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C.过程C需要采用植物组织培养技术
D.抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
解析：C 图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，而不需要DNA聚合酶，A错误；CaCl2溶液处理只能提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，B错误；过程C为由一个植物细胞得到一个完整植株的过程，一般要采用植物组织培养技术，C正确；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，D错误。
知识点（二） 目的基因的检测与鉴定
1.分子水平的检测
2.个体生物学水平的鉴定
小提醒：转录水平的检测与复制水平的检测原理都是分子杂交；翻译水平的检测，则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
3.判断下列有关表述的正误
（1）常使用PCR等技术，从分子水平上检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA。（ √ ）
（2）从分子水平上检测目的基因是否翻译出相关蛋白质的方法之一是利用抗原—抗体杂交技术。（ √ ）
（3）转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定必须通过分子检测才能达到目的。（ × ）
提示：抗虫效果的鉴定要在个体生物学水平上做抗虫接种实验来鉴定。
探讨 分析目的基因的检测与鉴定
抗虫棉中的“杀虫基因”就是培育转基因抗虫棉的目的基因——Bt抗虫蛋白基因。Bt基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道，这是检查转基因抗虫棉是否培育成功的重要一步。
（1）实际操作中只有部分Bt基因能够进入受体细胞并表达出抗虫蛋白。用什么方法检测棉花的染色体DNA上是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA？请提出你的思路。
提示：利用PCR等技术检测棉花的染色体DNA中是否插入了Bt基因或检测Bt基因是否转录出了mRNA。
（2）如果棉花中插入的Bt基因转录成功是否一定能够翻译出相应的蛋白质呢？如何从分子水平进行检测？
提示：不一定成功翻译。可从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交，检测Bt基因是否翻译出Bt抗虫蛋白等。用Bt抗虫蛋白做抗原制备出相应的抗体，然后用该种抗体与从转基因棉花中提取的蛋白质（抗原）反应，检测是否发生抗原与抗体的特异性结合，如果出现特异性结合，说明翻译成功。
（3）检测棉花中导入的抗虫基因是否表达的最简便的方法是什么？
提示：用导入抗虫基因的棉花叶片饲养棉铃虫，观察棉铃虫是否死亡。
1.分子水平上目的基因的检测
2.个体水平上鉴定转基因生物的方法举例
转基因生物 鉴定方法 观察目标
抗虫植物 害虫吞食 害虫是否死亡
抗病植物 病毒（菌）感染 是否出现病斑
抗盐植物 盐水浇灌 是否正常生长
抗除草剂植物 喷洒除草剂 是否正常生长
获取目的基因产物的转基因生物 提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较 细胞产物功能活性是否正常
1.下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达（ ）
A.在显微镜下直接观察受体细胞中是否含有目的基因
B.通过PCR等技术检测受体细胞的DNA分子上是否含有目的基因
C.提取受体细胞合成的相应蛋白质，利用抗原—抗体特异性反应进行检测
D.抗虫基因导入植物细胞后，检测植物是否具有抗虫特性
解析：A 检测目的基因是否成功导入或表达的方法有多种。①分子水平上的检测：通过PCR等技术检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出了mRNA；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原—抗体杂交技术。②个体生物学水平的鉴定：检测是否具有特定的遗传特性及抗性程度。在显微镜下无法观察到受体细胞中是否含有目的基因，故选A。
2.（2024·山东济宁高二调研）科学家将苏云金杆菌中的Bt抗虫蛋白基因（抗虫基因）导入棉花的愈伤组织细胞并进行组织培养获得棉花植株。经棉铃虫饲喂实验，发现棉花植株并无抗虫性状，科学家提取棉花叶片细胞中的有关成分进行了如下操作。下列有关分析错误的是（ ）
A.提取细胞中的蛋白质，采用抗原—抗体杂交技术进行检测，若检测到细胞中无Bt抗虫蛋白，则说明抗虫基因不能表达
B.若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则说明抗虫基因能正常转录和翻译
C.若经B检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白的mRNA，可采用PCR等技术检测细胞中的DNA，若能检测到抗虫基因，则可能是抗虫基因反向插入载体中或抗虫基因不能正常转录
D.若经C检测确定细胞中无抗虫基因，则可能是将没有目的基因的载体DNA分子导入了受体细胞
解析：B 若经A检测确定细胞中无Bt抗虫蛋白，可采用PCR等技术检测细胞中的RNA，若能检测到Bt抗虫蛋白的mRNA，则可能是抗虫基因能转录，但不能正常翻译出蛋白质，B错误。
知识点（三） DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA片段的扩增
2.PCR扩增产物的电泳鉴定
（1）实验原理
（2）实验步骤
3.判断下列有关表述的正误
（1）利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用90 ℃以上的高温处理反应液5 min进行预变性。（ √ ）
（2）PCR中离心的目的是让反应组分在离心管中分层分布。（ × ）
（3）电泳鉴定PCR产物时，应在每个加样孔中加入等量的PCR产物与凝胶载样缓冲液的混合液。（ × ）
探讨 探究DNA片段的扩增及电泳鉴定
（1）PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行严格灭菌，为什么？
提示：避免污染使外源性DNA大量扩增，造成假阳性反应。
（2）将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应，程序应该怎样设定？
提示：变性（90 ℃以上）→复性（50 ℃）→延伸（72 ℃）。
（3）判断是否成功扩增出DNA片段的依据是什么？如果没有成功应该从哪些方面分析？
提示：一次成功的DNA片段扩增应该产生与预期大小一致的DNA片段。若出现与预期不一致的结果，可尝试从以下几个方面进行分析：模板DNA的制备、引物的质量与特异性、酶的质量以及PCR循环的条件。
（4）如果没有出现扩增条带，可能的原因有哪些？
提示：模板DNA含有蛋白或含有Taq DNA聚合酶的抑制剂（如蛋白酶K、苯酚、EDTA）； Taq DNA聚合酶失活；引物出现质量问题，浓度不合适；Mg2＋浓度过低；变性温度低，变性时间短；目的序列变异等。
1.（2024·河北沧州高二月考）关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”实验，下列相关叙述正确的是（ ）
A.PCR仪实质上就是一台能自动调控温度的仪器，但在使用时需根据扩增的DNA片段以及引物的情况人工设定合适的温度
B.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程中起作用
C.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理
D.电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流出
解析：A PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，B错误；为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高压灭菌，C错误；电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。
2.用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电泳图谱，其中1号为DNA标准样液（Marker），10号为蒸馏水，PCR时加入的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是（ ）
A.PCR产物的分子大小在250～500 bp之间
B.3号样品为不含目的基因的载体DNA
C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株
D.10号确定反应体系等对结果没有干扰
解析：B PCR过程中，可以通过设计特定的引物来扩增特定的DNA片段，4～9号是转基因植株，理论上应包含目的基因，结合2号野生型和10号蒸馏水组的结果，推测包含目的基因的片段大小应为250～500 bp，A正确；3号PCR结果包含250～500 bp片段，应包含目的基因，B错误；9号PCR结果不包含250～500 bp片段，所以不是所需转基因植株，C正确；10号放入蒸馏水，可排除反应体系等对结果的干扰，D正确。
（1）转化是指 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程 。
（2）在培育转基因微生物时一般先用Ca2＋处理受体细胞的目的是 使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 。
（3）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因或目的基因是否转录出了mRNA常用 PCR等技术 ，检测目的基因是否翻译成蛋白质常用 抗原—抗体杂交技术 。
1.利用苏云金杆菌的抗虫基因培育出的抗虫棉是否成功，需要检测（ ）
A.是否能分离到目的基因
B.是否有抗虫的性状出现
C.是否有抗生素产生
D.目的基因是否得到表达
解析：B 能否分离出目的基因为基因导入是否成功的检测指标，A不符合题意；抗虫棉培育成功的标志是目的基因成功表达，且表现出抗虫性状，B符合题意，D不符合题意；抗虫棉是否表现抗虫性状与抗生素产生与否无关，C不符合题意。
2.（2024·浙江宁波检测）自然状态下农杆菌能感染双子叶植物而通常不感染单子叶植物，是因为受伤的双子叶植物能分泌某些酚类物质诱导Ti质粒中的Vir基因区段表达，该表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子。此单链分子可进入植物细胞并整合到染色体上。下列相关叙述错误的是（ ）
A.可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物
B.农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似
C.使用农杆菌转化法时，目的基因应插入Ti质粒的T-DNA中
D.合成新的T-DNA单链需要DNA连接酶与限制酶
解析：D 在自然条件下，农杆菌易感染双子叶植物和裸子植物，通常对单子叶植物没有感染力，原因是多数单子叶植物细胞不能分泌某些酚类物质，可以通过在伤口施加相关酚类物质而使单子叶植物也成为农杆菌易感植物，A正确；农杆菌感染宿主细胞的原理与肺炎链球菌转化实验的原理类似，实质都是基因重组，B正确；Ti质粒的T-DNA可转移到植物细胞中，并能整合到染色体DNA上，因此，目的基因应插入Ti质粒的T-DNA中，C正确；Ti质粒中的Vir基因区段的表达产物能诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子，而合成新的T-DNA单链不需要限制酶，一般需要DNA聚合酶、DNA连接酶等，D错误。
3.如图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。下列相关说法不正确的是（ ）
A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达
解析：B 题图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；题图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；基因的表达具有一定的独立性，剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。
4.（2024·江苏盐城高二期中）某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带（引物与模板完全配对）外，还有2条非特异条带（引物和模板不完全配对）。为了减少非特异条带的产生，以下措施中有效的是（ ）
A.增加模板DNA的量 B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间 D.提高复性的温度
解析：D 增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带的产生，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少产生非特异性条带，B、C错误；非特异性条带增加的原因可能是复性温度过低而造成引物与模板的错配，故可通过提高复性的温度来减少非特异性条带的产生，D正确。
5.为优化目的基因（700 bp）的PCR条件，研究者设计不同的复性温度进行实验，产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图。据图分析，下列有关说法错误的是（ ）
A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度
D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
解析：B 实验设计应遵循对照原则与单一变量原则，故对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同，A正确；PCR技术中，反应最终的电泳条带的宽度、亮度与 PCR 起始状态的模板DNA（或者模板）含量呈正相关，B错误；据图可知，58 ℃条件下条带宽度最大，故该温度是本实验中扩增该基因的最佳复性温度，D正确。
知识点一 将目的基因导入受体细胞
1.下列关于将目的基因导入受体细胞的叙述，错误的是（ ）
A.可利用花粉管通道法培育转基因植物
B.用Ca2＋处理大肠杆菌，以改变大肠杆菌细胞的生理状态
C.对于动物来说，受体细胞一般是受精卵
D.将目的基因转入微生物细胞常用显微注射法
解析：D 用Ca2＋处理大肠杆菌，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B正确；对于动物来说，受体细胞一般是受精卵，因为受精卵的全能性易于表现，C正确；将目的基因转入动物细胞常用显微注射法，将目的基因转入微生物细胞常用Ca2＋处理法，D错误。
2.我国科学家独创的花粉管通道法，可以使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞，是一种十分简便经济的方法，对此认识正确的是（ ）
A.不必构建表达载体就可以直接导入 B.此方法可用于转基因动物
C.受体细胞只能是植物的卵细胞 D.有时可以取代农杆菌转化法
解析：D 要让目的基因进入受体细胞后能稳定存在并得到复制和表达，不管采用什么导入方法，都需要构建表达载体才能实现，A错误；花粉管通道法只适用于转基因植物的培育，B错误；采用花粉管通道法时，植物受体细胞一般是植物体细胞或受精卵，通常不选卵细胞，C错误。
3.土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是（ ）
A.目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA
B.用Ca2＋处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞
C.Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNA
D.T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上
解析：D 在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T-DNA片段上，A错误；农杆菌转化法中应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌拟核DNA之外的DNA，C错误。
知识点二 目的基因的检测与鉴定
4.下列用于判断目的基因是否转移成功的方法，不属于分子水平的检测的是（ ）
A.通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B.通过PCR检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因
C.检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA
D.从转基因生物中提取的蛋白质利用抗原—抗体杂交检测是否翻译成功
解析：A 通过观察害虫吃棉叶是否死亡，属于个体生物学水平的鉴定，A符合题意；通过PCR等技术检测棉花的染色体DNA上是否插入抗虫基因，属于分子水平的检测，B不符合题意；检测转基因生物中是否转录出相应的mRNA，属于分子水平的检测，C不符合题意；采用抗原—抗体杂交检测目的基因是否翻译成蛋白质，属于分子水平的检测，D不符合题意。
5.科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie—J，Hobbie—J比普通老鼠更加聪明，大脑运转更加迅速，它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie－J产生过程的描述，错误的是（ ）
A.NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B.改变后的NR2B基因作为目的基因，可直接注入小鼠受精卵内
C.通常采用显微注射技术将改变后的NR2B基因重组质粒导入小鼠受精卵内
D.可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否插入小鼠染色体DNA上
解析：B 改变后的NR2B基因作为目的基因，需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内，B错误。
知识点三 DNA片段的扩增及电泳鉴定
6.下列有关电泳的叙述，不正确的是（ ）
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电泳中的迁移速率
C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
解析：C 由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，C错误。
7.使用PCR仪的正确实验操作顺序应为（ ）
①设置好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管的底部
A.②⑤③④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
解析：C PCR反应的操作步骤一般为准备（包括配制试剂及将各试剂放于实验台上）→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种能自动调控温度的仪器，设置好循环程序就可以进行反应。
8.科学家将人的生长激素基因与某种细菌（不含抗生素抗性基因）的DNA分子进行重组，并成功地在该细菌中得以表达（如图）。下列相关叙述错误的是（ ）
A.过程①合成人生长激素基因的过程需要用到逆转录酶
B.过程③是将重组质粒溶于缓冲液后与经Ca2＋处理的细菌B混合
C.成功导入了重组质粒的细菌B在含有氨苄青霉素的培养基上不能生长
D.可采用抗原—抗体杂交技术检测工程菌中生长激素基因是否成功表达
解析：C 成功导入了重组质粒的细菌B，因目的基因插入质粒后，破坏了四环素抗性基因，所以在含有四环素的培养基上不能生长，C错误。
9.（多选）（2024·山东日照高二期中）如图是利用转基因技术培育新品种植物的部分操作程序，下列相关叙述错误的是（ ）
A.过程①需使用不同的限制酶切割
B.过程②需用E.coli DNA连接酶连接
C.过程③需采用农杆菌转化法介导
D.过程④需采用选择性培养基进行筛选
解析：BC 过程②是目的基因表达载体的构建过程，由题图可知，该过程既要连接黏性末端又要连接平末端，因此该过程中需用T4 DNA连接酶连接，B错误；过程③是将重组质粒导入农杆菌的过程，该过程可以用钙离子处理使农杆菌处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。
10.（多选）番茄叶片受害虫的损伤后，叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂，抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米，以对付猖獗的玉米螟。如图为培育转基因抗虫玉米的流程图，下列有关叙述错误的是（ ）
A.用限制性内切核酸酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B.用Ca2＋处理玉米受体细胞，有利于含目的基因的重组质粒导入
C.重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位，以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D.若将目的基因导入玉米花粉细胞，通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米
解析：ABD 目的基因是用限制性内切核酸酶将DNA酶切后得到的，需筛选，A错误；Ca2＋用于处理细菌细胞，B错误；基因成功表达的前提是能转录和翻译，转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动，C正确；花药离体培养得到的是玉米的单倍体，需再用秋水仙素处理单倍体，使染色体数目加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米，D错误。
11.血栓调节蛋白（TM）只能在血管内皮细胞中合成，具有调节凝血的功能。为了解决异种器官移植时引起凝血紊乱的问题，科研人员研究制备了猪血管内皮特异性表达人血栓调节蛋白（hTM）的转基因猪。下图表示部分研究过程，请回答问题：
注：Ori为复制原点，T为终止子，Puro为嘌呤霉素抗性基因，pTM为猪血栓调节蛋白，相关限制酶识别序列及切割位点如表：
限制酶 XhoⅠ claⅠ EcoRⅤ
识别序列及 切割位点 C↓TCGAG AT↓CGAT GAT↓ATC
（1）步骤①使用的限制酶是XhoⅠ、claⅠ，质粒中插入pTM启动子的目的是使人血栓调节蛋白基因能在猪血管内皮细胞中特异性表达。
（2）步骤②中研究人员设计并合成了以下引物。合成这些引物的原料是4种脱氧核苷酸，引物设计的依据有hTM基因编码区两端的核苷酸序列及claⅠ、EcoRⅤ两种限制酶的识别序列。
引物1：ATCGATATGCTTGGGGTCCTGGTCCTTGGC
引物2：GATATCTCAGAGTCTCTCCGCCGTCCGCTC
（3）将步骤③获得的质粒3经XhoⅠ、 EcoRⅤ酶切后电泳，结果如下图，据结果可判断目的基因成功插入（填“成功插入”或“未插入”）质粒。
（4）质粒3经电泳导入猪胎儿成纤维细胞并接种至培养皿中培养48 h后经适宜的酶处理分散成单细胞，再按每孔一个细胞接种至96孔板中，加入嘌呤霉素筛选获得抗性细胞，再提取抗性细胞的DNA进行PCR鉴定，将呈阳（填“阳”或“阴”）性的细胞留存待用。
（5）取留存细胞的细胞核，显微注射到MⅡ时期的去核卵母细胞中，再经过早期胚胎培养、胚胎移植等技术获得能表达人血栓调节蛋白的转基因猪。
解析：（1）据题图可知，步骤①是在质粒1中插入pTM的启动子，得到质粒2，使用的限制酶是XhoⅠ、claⅠ，其目的是使人的血栓调节蛋白基因能在猪血管内皮细胞中特异性表达。（2）步骤②是将逆转录得到的hTM cDNA进行PCR扩增，需要引物诱导，合成这些引物的原料是4种脱氧核苷酸。根据提供的2种引物的脱氧核苷酸序列以及表格判断，设计引物的依据有hTM基因编码区两端的核苷酸序列以及claⅠ和EcoRⅤ的识别序列。（3）将步骤③获得的质粒3经XhoⅠ、EcoRⅤ酶切后电泳应当得到2种长度的片段，其中应该含有pTM的启动子＋hTM编码区＝0.6＋1.7＝2.3，结合图中实际电泳结果得到了5.6 kb和2.3 kb的2种片段，这说明hTM目的基因已经成功地插入到质粒3。（4）由图可知，质粒3中的标记基因为嘌呤霉素抗性基因，因此加入嘌呤霉素筛选可获得抗性细胞，即含有质粒3或重组质粒的细胞，再提取抗性细胞的DNA进行PCR鉴定，将呈阳性的细胞留存待用。（5）细胞核通过显微注射到去核的MⅡ期卵母细胞中，得到重组细胞，再经过早期胚胎培养、胚胎移植技术获得能表达人血栓调节蛋白的转基因猪。
14 / 14章末质量检测（三） 基因工程
（满分：100分）
一、单项选择题（本题共14小题，每小题2分，共28分。在每小题给出的四个选项中，只有一项是符合题目要求的）
1.下列有关重组DNA技术基本工具的叙述正确的是（ ）
A.DNA聚合酶是构建重组DNA分子必需的工具酶
B.不同的限制酶切割产生的黏性末端可能相同
C.相同黏性末端连接形成的DNA片段，一定会被原限制酶识别
D.载体质粒常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因
解析：B DNA连接酶是构建重组DNA分子必需的工具酶，A错误；如假设限制酶甲识别GAATTC碱基序列，并在G与A之间切割，限制酶乙识别CAATTG碱基序列，在C与A之间切割，形成的黏性末端是相同的，限制酶甲与限制酶乙形成的黏性末端连接后，形成的碱基序列为CAATTC，另一条链为GAATTG，不能被限制酶甲和乙识别，C错误；载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因，D错误。
2.（2024·河南濮阳期末）下图是几种不同限制酶切割 DNA 分子后形成的部分片段。下列叙述正确的是（ ）
A.限制酶和DNA连接酶作用的部位都是磷酸二酯键
B.①～④DNA片段是由4种限制酶切割后产生的
C.①和④两个片段在DNA聚合酶的作用下能形成重组DNA分子
D.②片段是限制酶在它识别序列的中轴线两侧切开形成的平末端
解析：A 限制酶和DNA连接酶作用部位都是两个核苷酸之间的磷酸二酯键，前者是让磷酸二酯键断裂，后者是催化磷酸二酯键形成，A正确；题图中①④是由同一种限制酶切割形成的，因此题中DNA片段是由3种限制酶切割后产生的，B错误；①④连接形成DNA分子需要的是DNA连接酶，C错误；②片段是在酶切位点为的限制酶作用下形成的，切出的是黏性末端，D错误。
3.T4 DNA连接酶可将任意2个具有相同黏性末端的DNA片段连接在一起。该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连，随后AMP转移至DNA片段，进而完成连接反应。下列叙述正确的是（ ）
A.T4 DNA连接酶的底物种类较多，故其无专一性
B.T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分已改变
C.ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键
D.T4 DNA连接酶需保存于最适温度和pH条件下
解析：C T4 DNA连接酶有专一性，A错误；酶在催化反应前后性质不变，故T4 DNA连接酶催化反应后，其组成成分不变，B错误；ATP水解产生AMP需要打开两个特殊的化学键，结合题干“该反应过程需消耗ATP，其水解产生的腺苷一磷酸（AMP）通过共价键与酶相连”可推测ATP在该反应过程中可能打开两个特殊的化学键，C正确；T4 DNA连接酶需在低温和最适pH条件下保存，D错误。
4.科研人员利用农杆菌转化法将抗病基因C导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜，Ti质粒结构模式图如图所示。下列叙述正确的是（ ）
A.农杆菌的T-DNA与番木瓜基因发生重组
B.质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞和促进目的基因的表达
C.含重组Ti质粒的农杆菌具有四环素抗性
D.转基因抗病番木瓜不具有卡那霉素抗性
解析：A 质粒上的抗性基因有利于筛选含目的基因的细胞，但不会促进目的基因的表达，B错误；抗病基因C的插入位点位于四环素抗性基因内部，插入抗病基因C后，重组Ti质粒的四环素抗性基因被破坏，含重组Ti质粒的农杆菌不具有四环素抗性，C错误；转基因抗病番木瓜含有卡那霉素抗性基因，故转基因抗病番木瓜具有卡那霉素抗性，D错误。
5.下图表示不同的限制酶在目的基因的提取和基因表达载体的构建中的作用，下列有关叙述错误的是（ ）
A.限制酶沿识别序列的中轴线两侧将DNA两条链切开
B.在图1和图2中将分别产生4个和2个黏性末端
C.限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键和氢键
D.图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶
解析：C 由图可知，产生的是黏性末端，所以可知限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA的两条链分别切开，A正确；由图可知，图1中含有酶1和酶2，能产生4个黏性末端，图2中含有酶3，能产生2个黏性末端，B正确；限制酶切割的是特定核苷酸序列之间的磷酸二酯键，不会切割氢键，C错误；限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，图示中酶1、酶2和酶3可以为不同种类的限制酶，D正确。
6.进行DNA粗提取时，某同学将洋葱鳞茎充分研磨后进行过滤，滤液4 ℃保存5分钟后取上清液进行离心处理，得到上清液和沉淀物。下列相关叙述正确的是（ ）
A.研磨时加入洗涤剂是为了溶解细胞膜，使核DNA能够充分释放
B.上清液加入2 mol/L的NaCl溶液，搅拌后逐渐析出白色丝状物DNA
C.上清液中加入预冷的酒精溶液，再次离心后从上清液分离出DNA
D.取沉淀物加入二苯胺试剂混匀后即可观察到试管中的溶液呈现蓝色
解析：A 洋葱鳞茎研磨后取上清液进行离心处理后，得到上清液和沉淀物，上清液中含有DNA，DNA能溶解在2 mol/L的NaCl溶液中，B错误；在上清液中加入体积分数为95％的冷却酒精，经离心后，可在沉淀物中分离获得白色絮状物DNA，C错误；取沉淀物加入二苯胺试剂混匀后，沸水浴加热一段时间，待试管冷却后，溶液会出现蓝色，D错误。
7.（2024·山东聊城期末）大肠杆菌经溶菌酶和洗涤剂处理后，拟核DNA就会缠绕在细胞壁碎片上，静置一段时间，质粒分布在上清液中，利用上述原理可初步获得质粒DNA。用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取的产物，电泳结果如图所示。下列关于质粒的粗提取和鉴定的叙述错误的是（ ）
A.提取DNA时可加入酒精，使不溶于酒精的DNA析出
B.将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂进行鉴定
C.分别用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取产物的电泳结果说明未提取到质粒
D.溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，但对DNA没有影响
解析：C DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精，提取DNA时加入酒精，是为了让DNA析出，A正确；将提取的DNA溶于2 mol/L NaCl溶液后，可用二苯胺试剂经沸水浴后进行鉴定，B正确；分别用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ处理提取的产物，均只得到一条大小相同的条带，说明提取物是环状DNA，即提取物为质粒，C错误；溶菌酶能溶解大肠杆菌细胞壁，但对DNA没有影响，D正确。
8.已知生物体内有一种转运蛋白Y，由300个氨基酸组成。如果将Y中157位的L-异亮氨酸变成亮氨酸，261位的酪氨酸变成丝氨酸，改变后的蛋白质Y1不但保留了原有Y的功能，且具备了催化活性。下列说法正确的是（ ）
A.蛋白质工程和基因工程的根本区别是操作对象的差异
B.可以通过对Y蛋白基因进行修饰或人工合成获得Y1蛋白基因
C.蛋白质工程操作过程中，不需要酶和载体作为工具
D.细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相反的
解析：B 蛋白质工程和基因工程的根本区别是蛋白质工程可产生自然界没有的蛋白质，A错误；蛋白质工程操作过程中，需要酶和载体作为工具，C错误；细胞内合成Y1蛋白与Y蛋白的过程中，遗传信息的流向是相同的，D错误。
9.（2024·山东济宁期中）一种双链DNA分子被三种不同的限制酶切割，切割产物通过电泳分离，用长度已知的DNA片段的电泳结果作为分子量标记（图中左边第一列）。关于该双链DNA，下列说法错误的是（ ）
A.呈环状结构
B.长度为10 kb
C.有一个限制酶NotⅠ和两个限制酶EcoRⅠ切割位点
D.其限制酶NotⅠ切割位点与限制酶EcoRⅠ切割位点的最短距离为2 kb
解析：D 单用限制酶EcoRⅠ处理和利用限制酶EcoRⅠ和NotⅠ双酶切时产生的结果不同，说明该DNA序列中含有限制酶NotⅠ的切割位点，用限制酶NotⅠ处理只产生了一个10 kb的片段，所以说明该分子一定是环状的，且长度一定是10 kb，A、B正确；用限制酶NotⅠ处理只产生了一个10 kb的片段，说明该环状DNA上含有一个限制酶NotⅠ的切割位点，单用限制酶EcoRⅠ处理产生了4 kb和6 kb两个片段，说明该环状DNA上含有2个限制酶EcoRⅠ的切割位点，C正确；用限制酶EcoRⅠ处理后产生的4 kb的片段，进一步被限制酶NotⅠ切割成为3 kb和1 kb的两个片段，可知限制酶NotⅠ切割位点与限制酶EcoRⅠ切割点的最短距离为1 kb，D错误。
10.（2024·江苏徐州期中）基因疫苗是将编码外源性抗原的基因插入质粒，然后将重组质粒直接导入机体内，使其在宿主细胞中表达抗原蛋白，进而诱导机体产生免疫应答。下列叙述正确的是（ ）
A.接种基因疫苗只能预防特定微生物的感染
B.疫苗经注射进入人体后，可被人体的浆细胞识别
C.利用蛋白质工程生产的蛋白质疫苗就是基因疫苗
D.基因疫苗的机理是机体能识别特定的基因，从而产生免疫反应
解析：A 基因疫苗的机理是使机体受到刺激进而产生抗体作用于相应的抗原，属于特异性免疫，因此接种基因疫苗只能预防特定微生物的感染，A正确，D错误；浆细胞无识别抗原的功能，B错误；结合题意分析可知，基因疫苗是通过基因工程生产的，利用蛋白质工程生产的蛋白质疫苗不是基因疫苗，C错误。
11.下列关于PCR反应体系中所加物质作用的叙述，错误的是（ ）
A.耐高温的DNA聚合酶用于催化DNA子链的合成
B.引物使Taq DNA聚合酶能从引物的5'端延伸DNA链
C.目标DNA的双链用作合成DNA复制的模板
D.四种脱氧核苷酸为PCR提供原料
解析：B 通过PCR技术扩增目的基因时，需要用耐高温的DNA聚合酶催化单个脱氧核苷酸聚合形成DNA长链，以获得DNA子链，A正确；在复制时，引物与DNA母链通过碱基配对结合后，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸DNA链，因此DNA合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，B错误；PCR技术的原理是DNA复制，DNA复制时两条链均作为复制的模板，C正确；四种游离的脱氧核苷酸为PCR提供原料，D正确。
12.（2024·山东青岛期末）PCR技术在生物工程中应用广泛，PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列有关叙述错误的是（ ）
A.PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2＋用于激活DNA聚合酶
B.用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割后，可通过电泳检测质粒是否被切开
C.PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
D.采用PCR技术对一个DNA进行扩增，第n次循环共需要引物2n个
解析：C PCR反应的缓冲液中需添加Mg2＋，然后依次加入引物、Taq DNA聚合酶、模板，其中Mg2＋用于激活DNA聚合酶，A正确；用于构建基因表达载体的质粒用限制酶切割后，因为质粒被切开后可能成为多个DNA片段，相对分子质量彼此不同，因而可通过电泳检测，B正确；PCR通过90 ℃以上的高温解旋，50 ℃左右的温度下模板与引物结合，72 ℃左右时合成新的DNA链，因此，PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程中起作用，催化子链合成过程，C错误；PCR技术大量扩增目的基因时，第n次复制形成2n个DNA，相当于新合成2n－1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n－1×2＝2n，D正确。
13.如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，下列有关说法错误的是（ ）
A.a→b过程中一般用4种脱氧核苷酸为原料，并加入两种引物
B.b→c为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是受精卵
C.a→b过程利用了DNA半保留复制的原理，需要使用RNA聚合酶
D.b→d为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
解析：C a→b过程是聚合酶链式反应扩增DNA片段的过程，利用了DNA半保留复制的原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶，C错误。
14.某研究小组为了研制预防禽流感病毒的疫苗，开展了前期研究工作。其简要的操作流程如图所示。下列有关叙述错误的是（ ）
A.步骤①所代表的过程是逆转录
B.步骤②需使用限制性内切核酸酶和DNA连接酶
C.步骤③可用Ca2＋处理大肠杆菌，使细胞从一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态恢复到常态
D.检验Q蛋白的免疫反应特性，可用Q蛋白与患禽流感康复的鸡的血清进行抗原—抗体杂交
解析：C 步骤③可用Ca2＋处理大肠杆菌，使其从常态转化为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C错误。
二、多项选择题（本题共5小题，每小题3分，共15分。在每小题给出的四个选项中，有两个或两个以上选项符合题目要求，全部选对得3分，选对但不全的得1分，有选错的得0分）
15.如图为利用基因工程培育抗虫植株的示意图。下列相关叙述不正确的是（ ）
A.②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶参与
B.③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上
C.④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状
D.⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
解析：BC 构建重组质粒需要用到限制性内切核酸酶和DNA连接酶，A正确；含重组Ti质粒的农杆菌侵染植物细胞后，重组Ti质粒的T-DNA整合到受体细胞的染色体DNA上，B错误；导入受体细胞的目的基因表达后，转基因植株方能表现出相应性状，若目的基因在受体细胞中不表达，转基因植株不能表现出相应性状，C错误；⑤表现出抗虫性状，则表明该植株细胞发生了基因重组，基因重组是可遗传变异，D正确。
16.利用基因工程技术生产羧酸酯酶（CarE）制剂的流程如图所示，下列叙述正确的是（ ）
A.过程①表示逆转录过程，需要解旋酶和DNA聚合酶
B.通过过程②从cDNA中获得的CarE基因无启动子和内含子
C.过程③一般用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
D.通过过程④得到的工程菌是指能使CarE基因得到高效表达的菌株
解析：BCD 过程①表示逆转录过程，需要逆转录酶，A错误；cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，其中不含启动子和内含子，因此通过过程②从cDNA中获得的CarE基因无启动子和内含子，B正确；过程③表示将目的基因导入大肠杆菌细胞，一般用Ca2＋处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C正确；通过过程④得到的工程菌是指能使CarE基因得到高效表达的菌株，D正确。
17.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图示中被浸染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列说法正确的是（ ）
注：子链从引物的3'端开始延伸。
A.PCR扩增利用的是DNA热变性的原理
B.进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶
C.利用图中的引物②、③组合可扩增出两侧的未知序列
D.通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置
解析：ABD PCR扩增利用的是DNA热变性的原理，是体外扩增DNA的一种方式，A正确；PCR技术需要在高温条件下进行变性，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶，B正确；由于DNA的两条链反向平行，且子链从引物的3'端开始延伸，故利用图中的引物①、④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T-DNA的插入位置，D正确。
18.（2024·江苏南京期末）科研人员将酿酒酵母质粒上的丙酮酸脱氢酶基因（PD）替换为植物乳杆菌中的乳酸脱氢酶基因（L-PG），可获得乳酸乙酯（白酒香味的主要来源）高产菌株，过程如图。下列分析合理的是（ ）
A.转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母的活性
B.L-PG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段
C.标记基因AmpR可检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株
D.可以利用PCR技术筛选含有L-PG基因的受体细胞
解析：ABD 目的基因表达产物不能影响受体细胞的生存和活性，因此转入的L-PG基因表达产物不能影响酿酒酵母活性，A正确；L-PG基因替换质粒上的PD基因需要两端携带相同基因片段，即相同的黏性末端，B正确；标记基因AmpR可筛选含有目的基因的受体细胞，但不能检测是否成功构建乳酸乙酯高产菌株，C错误；PCR技术是一项体外扩增基因的技术，依据碱基互补配对原则，可以用于筛选含有L-PG基因的受体细胞，D正确。
19.（2024·河北保定高二联考）亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880 kb至～903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，扩增后电泳结果如图所示。下列有关说法正确的是（ ）
A.提取该突变体和野生型亚洲棉的8号染色体上的DNA进行PCR扩增
B.图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的
C.据图分析可知，相对分子质量较大的扩增产物与点样处的距离较近
D.该突变体出现的根本原因是引物6对应区间发生了碱基对的替换
解析：ABC 由于8号染色体的～880 kb至～903 kb区间与突变体的光籽表型相关，故提取突变体和野生型的8号染色体上的DNA进行PCR扩增，A正确；题图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的，相对分子质量较大的扩增产物迁移速率较慢，与点样处的距离较近，B、C正确；根据题图所示，野生型和突变体经引物6扩增的产物不同，其中突变体的相应扩增产物较大，故可推知8号染色体上的引物6对应的区间发生碱基对的插入是该突变体光籽性状出现的根本原因，D错误。
三、非选择题（本题共4小题，共57分）
20.（14分）RT-PCR是将mRNA逆转录（过程Ⅰ）和cDNA（mRNA逆转录产生的互补DNA）聚合酶链式反应（过程Ⅱ）相结合的技术，具体过程如图1所示，图2为某兴趣小组设计的引物。请分析回答下列问题：
（1）过程Ⅰ主要涉及的酶是逆转录酶，进行过程Ⅱ的反应体系中常用的酶是Taq DNA聚合酶（或耐高温的DNA聚合酶），二者都能催化磷酸二酯键的形成。
（2）该兴趣小组实验后发现几乎不能得到扩增产物，据图2分析，其原因是引物B自身会出现局部碱基互补配对（或自身折叠）而失效。改正后，过程Ⅱ中拟对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，理论上至少需要m×2n－1个引物B。
解析：（1）图1中过程Ⅰ表示逆转录，需逆转录酶的催化，过程Ⅱ是PCR技术，常用的酶是Taq DNA聚合酶，这两种酶都能催化磷酸二酯键的形成。（2）观察图2可发现，引物B自身会出现局部碱基互补配对从而环化，无法与模板链结合成双链结构。对m个单链cDNA进行n次循环的扩增，则最终得到的双链DNA分子有m×2n－1个，说明至少需要引物B的数量为m×2n－1个。
21.（14分）（2024·湖南长郡中学测试）苏云金杆菌可通过产生苏云金杆菌伴孢晶体蛋白（Bt抗虫蛋白），破坏鳞翅目昆虫的消化系统来杀死棉铃虫。科学家将该细菌的“杀虫基因”转移到棉花里，培育出了抗虫棉，让棉花也能产生Bt抗虫蛋白抵抗虫害。回答下列问题：
（1）可利用PCR技术获取并扩增Bt基因，前提是要有一段Bt基因的核苷酸序列，这是因为利用PCR技术扩增目的基因需要两种引物，合成引物的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列。
（2）PCR与体内DNA复制相比，其特殊之处有PCR过程中要变换温度、利用的DNA聚合酶为耐高温的DNA聚合酶、DNA解旋在90 ℃以上的高温下进行等（写出两点即可） （写出两点）。
（3）Bt基因两端的酶切位点如图1所示，图2中质粒上的AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR为四环素抗性基因，P为启动子，箭头表示酶切位点。
实际操作中，一般采用限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ两种酶进行切割，与只采用限制酶EcoRⅠ切割相比，用两种酶切的优势之一是避免目的基因和质粒自身环化，二是避免造成反向连接。反向连接会导致目的基因表达出不同的蛋白质，原因是目的基因与启动子相接的一端为转录的起始端，如果反向连接，则转录得到的mRNA序列与正向连接相比是不同的。
解析：（1）PCR技术扩增的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列以便合成引物。（2）PCR与体内DNA复制相比，其特殊之处在于PCR过程中要变换温度、利用的DNA聚合酶为耐高温的DNA聚合酶、DNA解旋在90 ℃以上的高温下进行等。（3）构建重组质粒时，选用EcoRⅠ、BamHⅠ酶对目的基因所在DNA和质粒进行切割，这样可以防止含目的基因的DNA片段自身环化，也可以防止质粒自身环化，还可以防止目的基因反向连接。转录是从启动子开始，到终止子结束，若反向连接则转录得到的mRNA序列与正向连接相比是不同的。
22.（14分）（2024·山东德州高二月考）科学家通过利用PCR定点突变技术改造Rubisco酶基因，提高了光合作用过程中Rubisco酶对CO2的亲和力，从而显著提高了植物的光合作用速率。请回答下列问题：
（1）PCR过程所依据的原理是DNA半保留复制，该过程需要加入的酶是耐高温的DNA聚合酶（或Taq DNA聚合酶）。利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有目的基因的一段已知核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
（2）可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞，将该细胞经植物组织培养技术培育成幼苗，从细胞水平分析所依据的原理是植物细胞具有全能性。
23.（15分）（2024·广东韶关统考）日常生活中产生的厨余垃圾含有大量有机物，极易腐败发酸发臭、滋生有害生物，若收集转运过程中发生泄漏则会污染空气、土壤及水源。科研人员从绿色木霉中获得了纤维素内切葡聚糖酶基因EGⅢ，并将其导入毕赤酵母中，构建出了基因工程菌（流程如图所示），实现了高效降解厨余垃圾中纤维素的目的。请据图回答下列问题。
注：图中BamHⅠ、EcoRⅠ、SalⅠ为限制酶。
（1）为了构建基因表达载体，应该选择BamHⅠ、SalⅠ（限制酶）切割目的基因和质粒DNA。当EGⅢ基因与质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
（2）图中步骤1将重组质粒导入大肠杆菌的目的是大量扩增含目的基因的重组质粒，不直接利用大肠杆菌生产纤维素内切葡聚糖酶的原因可能是目的基因是真核生物基因，需要在真核生物体内表达。
（3）为了确认转化是否成功，将转化毕赤酵母接种在含有纤维素的培养基中培养，一段时间后获得的单菌落即为含有EGⅢ基因的基因工程菌。
解析：（1）为避免自身环化和反向连接，在构建基因表达载体时，最好选择两种酶，图中EcoR Ⅰ会破坏目的基因，BamHⅠ、SalⅠ刚好可以切割目的基因两端，且载体上也有这两个限制酶的切割位点，故应该用BamHⅠ、SalⅠ切割。DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。（2）图中步骤1将重组质粒导入大肠杆菌后，就会在大肠杆菌体内复制，产生大量重组质粒，即大量扩增重组质粒。由于目的基因是真核生物基因，需要在真核生物体内表达，而大肠杆菌是原核生物，所以还需要转化到酵母菌细胞内。（3）确认目的基因是否转化成功，就是检验一下毕赤酵母能不能表达出降解纤维素的物质，即将其接种在含有纤维素的鉴别培养基上鉴定。如果成功了，就会出现一些单菌落。
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