3.1重组DNA技术的基本工具 课件(共47张PPT)- -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3
文档属性
| 名称 | 3.1重组DNA技术的基本工具 课件(共47张PPT)- -2025-2026学年高二下《生物》（人教版）选择性必修3 |
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| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 30.0MB | ||
| 资源类型 | 课件 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-06-05 00:00:00 | ||
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文档简介
(共47张PPT)
第三章 第1节 重组DNA技术的基本工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
大肠杆菌
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。
大量施用农药会严重污染环境！能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？
从社会中来
基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1.原理：
2.操作对象：
3.操作水平：
4.结果：
5.意义：
重组DNA技术
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
过渡
DNA
DNA切割
DNA拼接
害虫死亡
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微
小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
DNA导入
目 录
重组DNA技术的基本工具
1
限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
2
DNA连接酶——“分子缝合针”
3
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
一
一、限制性内切核酸酶（限制酶）—“分子手术刀”
1.限制酶的作用特点有哪些
2.两种限制酶切割DNA片段后产生的末端有什么不同
3.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
任务一
【自主学习】
阅读教材“限制性内切核酸酶 “分子手术刀” 的内容：
主要是从原核生物中分离纯化来的
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(1)来源：
(2)作用：
1. 限制酶的来源及作用
磷酸二酯键
(3)结果：
产生黏性末端或平末端
EcoR I
识别序列为 GAATTC
切割部位为 GA之间
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
2. 限制酶的来作用结果
(1)产生黏性末端
G
C
A
A
T
T
T
A
T
A
C
G
5'
3'
3'
5'
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
黏性末端
错位切
Sma I
识别序列为 CCCGGG
切割部位为 CG之间
平末端
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
2. 限制酶的来作用结果
(2)产生平末端
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
5'
3'
3'
5'
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
平切
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
旁栏思考题
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制酶名字的由来
资料卡
核心归纳
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，能够切割特定序列中的特定位点。
2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系
(1)区别
作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
(2)两者的关系
3．限制酶的选择技巧
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
图甲 图乙
3．限制酶的选择技巧
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
DNA连接酶的作用
DNA连接酶的种类？
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
任务二
【自主学习】
阅读教材“ DNA连接酶——分子缝合针” 的内容：
DNA连接酶
DNA连接酶
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
1.DNA连接酶的作用
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
1DNA连接酶的种类
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
比较与DNA相关的几种酶
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
模板 不需要 需要
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
任务三
【自主学习】
阅读教材“基因进入受体细胞的载体——分子运输车” 的内容：
大肠杆菌
质粒
载体要与外源基因连接，需要具备什么条件
要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，
载体需要具备什么条件
我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
(1)作用：
动植物病毒
噬菌体
(2)种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
1.载体的作用及种类
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
供外源DNA片段（基因）插入其中
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
2.载体需具备的条件
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
(1)稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
(2)有一个至多个限制酶切割位点
(3)具有特殊的标记基因
(4)对受体细胞无害、易分离
说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
标记基因标记的原理
(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
知识拓展
1．不同生物的DNA分子能拼接起来的原因
(1)不同生物的DNA分子的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸。
(2)不同生物的双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)不同生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。
2．外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状的原因
(1)基因是控制生物体性状的结构和功能的基本单位，具有相对独立性。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
重组DNA分子
思考 讨论
任务四
【动手实践】
请利用两张纸，按照P73页，思考讨论”重组DNA”
的要求完成操作，并完成讨论题：
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
重组DNA分子
思考 讨论
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
本节小结
分子手术刀:限制性内切核酸酶
重组DNA技术的基本工具
分子缝合针:DNA连接酶
分子运输车:基因进入受体细胞的载体
作用部位
磷酸二酯键
质粒
动植物病毒
噬菌体
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、提取的基本思路
二、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，
能溶于2mol/L NaCl溶液。
3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现
蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意：
1.选材：
三、材料用具
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂：
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
三、材料用具
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
试剂 作用
研磨液
体积分数为95%的酒精
2mol/L 的NaCl溶液
二苯胺试剂
蒸馏水
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
研磨洋葱
四、方法步骤：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
低温放置几分钟的作用：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
方法一：
方法二：
思考:
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
方法一：
用冷却的酒精析出DNA
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
酒精预冷的作用：
低温抑制核酸水解酶活性，抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
思考
方法二：
组别 试剂 处理 结果
对照组
实验组
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
2mol/L的NaCl溶液5mL
2mol/L的NaCl溶液5mL
4mL的二苯胺试剂
4mL的二苯胺试剂
丝状物或沉淀物
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
核心归纳
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
教材课后习题·概念检测
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
教材课后习题·概念检测
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
教材课后习题·拓展应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
XbaⅠ 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
教材课后习题·拓展应用
谢谢观看
Thank you
第三章 第1节 重组DNA技术的基本工具
分子手术刀
分子缝合针
分子运输车
大肠杆菌
我国是棉花的生产和消费大国，棉花在种植过程中，常会受到一些虫害的侵袭，其中以棉铃虫最为常见，它可以使棉花产量减少三分之一，甚至绝收。
大量施用农药会严重污染环境！能不能导入“杀虫基因”到棉花细胞，使棉花自身产生抗虫蛋白来抵抗棉铃虫呢？
从社会中来
基因工程
是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫 重组DNA技术。
基因
分子水平
基因重组
赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品
定向改造生物性状；克服远缘杂交不亲和障碍
1.原理：
2.操作对象：
3.操作水平：
4.结果：
5.意义：
重组DNA技术
那么，科学家究竟用到了哪些“分子工具”？
这些“分子工具”各具有什么特征呢？
从社会中来
过渡
DNA
DNA切割
DNA拼接
害虫死亡
DNA双螺旋的直径只有2nm,对如此微
小的分子进行操作，是一项非常精细的工作，更需要专门的“分子工具”。
DNA导入
目 录
重组DNA技术的基本工具
1
限制性内切核酸酶（限制酶）——“分子手术刀”
2
DNA连接酶——“分子缝合针”
3
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
限制性内切核酸酶(限制酶)——“分子手术刀”
一
一、限制性内切核酸酶（限制酶）—“分子手术刀”
1.限制酶的作用特点有哪些
2.两种限制酶切割DNA片段后产生的末端有什么不同
3.你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
任务一
【自主学习】
阅读教材“限制性内切核酸酶 “分子手术刀” 的内容：
主要是从原核生物中分离纯化来的
能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(1)来源：
(2)作用：
1. 限制酶的来源及作用
磷酸二酯键
(3)结果：
产生黏性末端或平末端
EcoR I
识别序列为 GAATTC
切割部位为 GA之间
当限制酶在它识别序列的中轴线两侧将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是黏性末端。
2. 限制酶的来作用结果
(1)产生黏性末端
G
C
A
A
T
T
T
A
T
A
C
G
5'
3'
3'
5'
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
黏性末端
错位切
Sma I
识别序列为 CCCGGG
切割部位为 CG之间
平末端
当限制酶在它识别序列的中轴线处将DNA分子的两条链分别切开时，产生的是平末端。
2. 限制酶的来作用结果
(2)产生平末端
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
5'
3'
3'
5'
C
G
C
C
G
G
G
C
G
C
G
C
平切
你能根据所掌握的知识，推测限制酶存在于原核生物中的主要作用是什么吗？
原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，所以它在长期的进化过程中形成了套完善的防御机制。限制酶就是它的一种防御性工具。当外源DNA入侵时，它会利用限制酶来切割外源DNA，使之失效，以保证自身的安全。
旁栏思考题
EcoRⅠ
属名Escherichia首字母
种名coli 前两个字母
R型菌株
从中分离的第一个限制酶
例如：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)d株中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
Hind I
Hind II
Hind III
限制酶名字的由来
资料卡
核心归纳
1．限制性内切核酸酶
(1)作用特点：具有专一性，能够识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列，能够切割特定序列中的特定位点。
2．限制性内切核酸酶与DNA连接酶的关系
(1)区别
作用 应用
限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体
DNA连接酶 在DNA片段之间重新形成磷酸二酯键 用于目的基因和载体的连接
(2)两者的关系
3．限制酶的选择技巧
图甲 图乙
根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类 ①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ；
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ；
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)
根据质粒的特点确定限制酶的种类 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏性末端；
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切割位点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制
图甲 图乙
3．限制酶的选择技巧
DNA连接酶——“分子缝合针”
二
DNA连接酶的作用
DNA连接酶的种类？
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
任务二
【自主学习】
阅读教材“ DNA连接酶——分子缝合针” 的内容：
DNA连接酶
DNA连接酶
将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
用DNA连接酶连接两个片段之间的磷酸二酯键
1.DNA连接酶的作用
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
G
C
T
T
A
A
A
A
T
T
C
G
种类
来源 大肠杆菌 T4噬菌体
作用 差别 只连接____________ 缝合___________和____________
E.coli
DNA连接酶
T4
DNA连接酶
黏性末端
黏性末端
平末端（效率较低）
都能将双链DNA片段“缝合“起来，
恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。
1DNA连接酶的种类
DNA连接酶 DNA聚合酶
相同 作用实质 化学本质 不 同 点 模板
作用对象
作用结果
用途
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质
不需要
需要DNA的一条链作模板
形成完整的重组DNA分子
形成DNA的一条链
基因工程
DNA复制
在两个DNA片段间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸连接到已有DNA片段，形成磷酸二酯键
DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？
旁栏思考题
比较与DNA相关的几种酶
项目 DNA连接酶 限制酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 氢键
作用对象 DNA片段 DNA 单个的脱氧核苷酸 DNA
作用结果 将两个DNA片段连接成重组DNA分子 切割DNA分子形成黏性末端或平末端 将单个的脱氧核苷酸连接到DNA单链末端 将双链DNA分子局部解旋为单链
模板 不需要 需要
基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
三
三、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
任务三
【自主学习】
阅读教材“基因进入受体细胞的载体——分子运输车” 的内容：
大肠杆菌
质粒
载体要与外源基因连接，需要具备什么条件
要使携带的外源基因在受体细胞中稳定存在，
载体需要具备什么条件
我们用肉眼看不到载体是否进入受体细胞，为了便于筛选重组DNA分子，载体需要具备什么条件
质粒
将外源基因送入受体细胞, 在受体细胞内对目的基因进行大量复制
(1)作用：
动植物病毒
噬菌体
(2)种类：
质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
1.载体的作用及种类
能使目的基因稳定存在且数量可扩增
供外源DNA片段（基因）插入其中
便于重组DNA分子的筛选
对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤
2.载体需具备的条件
拟核
质粒
大肠杆菌
氨苄青霉素抗性基因
目的基因
复制起点
(1)稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上
(2)有一个至多个限制酶切割位点
(3)具有特殊的标记基因
(4)对受体细胞无害、易分离
说明：一般来说，天然载体不能同时满足所有条件，要对其进行人工改造才可以使用。
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质，如质粒(DNA)，也可能是生物，如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”，把目的基因导入受体细胞。
标记基因标记的原理
(1)前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
(2)过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性，因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
(3)结果：在培养基上，被抗生素杀死的是没有抗性的受体细胞，没被杀死的具有抗性的受体细胞得以筛选。
知识拓展
1．不同生物的DNA分子能拼接起来的原因
(1)不同生物的DNA分子的基本组成单位都是4种脱氧核苷酸。
(2)不同生物的双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构。
(3)不同生物的DNA碱基对均遵循严格的“碱基互补配对原则”。
2．外源基因能够在受体内表达，并使受体表现出相应的性状的原因
(1)基因是控制生物体性状的结构和功能的基本单位，具有相对独立性。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
重组DNA分子
思考 讨论
任务四
【动手实践】
请利用两张纸，按照P73页，思考讨论”重组DNA”
的要求完成操作，并完成讨论题：
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
根据学生实际操作的情况进行指导。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。
不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。
剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。
重组DNA分子
思考 讨论
剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具” ？
你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？
你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？
本节小结
分子手术刀:限制性内切核酸酶
重组DNA技术的基本工具
分子缝合针:DNA连接酶
分子运输车:基因进入受体细胞的载体
作用部位
磷酸二酯键
质粒
动植物病毒
噬菌体
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、提取的基本思路
二、实验原理：
1.DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。
2.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，
能溶于2mol/L NaCl溶液。
3.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现
蓝色。
0
DNA溶解度
NaCl浓度
0.14mol/L
2mol/L
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等
注意：
1.选材：
三、材料用具
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA
2.试剂：
析出DNA
溶解DNA
鉴定DNA，要现配现用
三、材料用具
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
试剂 作用
研磨液
体积分数为95%的酒精
2mol/L 的NaCl溶液
二苯胺试剂
蒸馏水
1.取材、研磨：
称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL 研磨液，充分研磨
研磨的目的：
破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中
研磨洋葱
四、方法步骤：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
2.过滤或离心取上清液：
在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。
直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。
上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？
可能含有核蛋白、多糖等杂质
低温放置几分钟的作用：
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
方法一：
方法二：
思考:
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液(体积分数为95%)，静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
方法一：
用冷却的酒精析出DNA
3.预冷酒精析出DNA或离心收集沉淀中的DNA
将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物(粗提取的DNA)晾干。
搅拌时应轻缓、并沿一个方向：
减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子
酒精预冷的作用：
低温抑制核酸水解酶活性，抑制DNA降解；
低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；
低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
思考
方法二：
组别 试剂 处理 结果
对照组
实验组
4.NaCl溶液溶解DNA并鉴定
实验组
对照组
水浴加热
溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
四、方法步骤：
2mol/L的NaCl溶液5mL
2mol/L的NaCl溶液5mL
4mL的二苯胺试剂
4mL的二苯胺试剂
丝状物或沉淀物
1.如果选用鸡血细胞进行实验，如何快速破碎细胞？
2.有时会在DNA滤液中添加嫩肉粉（木瓜蛋白酶），这样有什么好处？
3.有时还会反复利用不同浓度的NaCl溶液来溶解、析出DNA，试猜想该操作的目的？
将鸡血细胞置于蒸馏水中，待细胞涨破后，收集滤液。
利用蛋白酶分解杂质蛋白，不分解DNA，有利于DNA与蛋白质分开。
进一步纯化DNA——用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质；用低盐溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
—— DNA的粗提取与鉴定
探究实践
核心归纳
DNA粗提取与鉴定实验成功的关键
(1)破碎细胞应彻底充分。
(2)对提取的含杂质较多的DNA进行提纯时，所用的酒精必须经过充分预冷后才能使用。
(3)实验过程中搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，并沿一个方向搅拌以便获得较完整的DNA分子。
(4)由于玻璃表面带电荷，DNA易被吸附于玻璃表面，故实验中应尽量不使用或少使用玻璃器皿，这样可以提取到较多的DNA。
(5)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
1. DNA连接酶是重组DNA技术常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是
（ ）
A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键
B. 能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
C. 能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键
D. 只能连接双链DNA片段互补的黏性末端，不能连接双链DNA片段的平末端
C
教材课后习题·概念检测
2.在重组DNA技术中，将外源基因送入受体细胞的载体可以是（ ）
A.大肠杆菌的质粒
B. 切割DNA分子的酶
C. DNA片段的黏性末端
D. 用来识别特定基因的DNA探针
A
教材课后习题·概念检测
1.想一想，为什么限制酶不切割细菌本身的DNA分子？
迄今为止，在基因工程操作中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们可以识别DNA上特定的碱基序列并使特定部位的磷酸二酯键断开。微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解。细菌中限制酶之所以不切割自身的DNA，是因为含有某种限制酶的细胞的DNA分子或者不具备这种限制酶的识别序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到了限制酶所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶，也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA入侵。
教材课后习题·拓展应用
2. 有2个不同来源的DNA片段A和B，A片段用限制酶切speⅠ进行切割，B片段分别用限制酶HindⅢ , XbaⅠ、EcoRⅤ和XhoⅠ进行切割。各限制酶的识别序列和切割位点如下。
(1)哪种限制酶切割B片段产生的DNA片段能与限制酶speⅠ切割A片段产生的DNA片段相连接？为什么？
(2)不同的限制酶切割可能产生相同的黏性末端，这在基因工程操作中有什么意义？
XbaⅠ 因为XbaⅠ与SpeⅠ切割产生了相同的黏性末端。
识别DNA分子中不同核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶被称为同尾酶。同尾酶使构建载体时，切割位点的选择范围扩大。例如，我们选择了用某种限制酶切割载体，如果目的基因的核苷酸序列中恰好含有该限制酶的识别序列，那么用该限制酶切割含有目的基因的DNA片段时，目的基因就很可能被切断；这时可以考虑用合适的同尾酶(目的基因的核苷酸序列中不能有它的识别序列)来获取目的基因。
教材课后习题·拓展应用
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