第一部分 微生物的利用
梳理知识 构建纲要
整合重点 提升技能
突破1 划线分离法和涂布分离法的比较
项目 划线分离法 涂布分离法
操作 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面(也是分离纯化的方法)。每一次划线都从上次划线末端开始，目的是获得由单个细菌形成的标准菌落 将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 (1)吸收量较少，较麻烦(2)平板不干燥，效果不好，容易蔓延
用途 多用于菌种的纯化 (1)多用于筛选菌株(2)用于平板培养基的回收率计数
易错提醒 两种分离法的易错点拨
(1)在稀释涂布平板操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)每一稀释倍数菌液都至少要涂布三个平板，作为实验重复，求平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊者，应舍弃该实验数据，不进行统计、计算。
(3)平板冷凝后，皿盖上会凝结成水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。
突破体验
1.微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。下图甲、乙、丙是大肠杆菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图，请据图回答有关问题：
(1)上图甲所示的是制备固体培养基时的实验操作步骤之一，它称为 。
(2)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是 。
(3)上图乙是平板划线法接种操作示意图，正确的操作顺序是A→B→
(用字母和箭头表示)；
找出图乙中两处错误的操作： 、 (用字母表示)。
(4)上图丙是某同学用平板划线法接种后的培养基培养12 h后的实验结果，如果培养基上
，则说明无菌操作基本符合要求。
答案 (1)倒平板 (2)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 (3)G→F→E→C→D→H C D (4)生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点
突破2 培养基的配制和无菌技术
1.培养基的制备(以LB固体培养基为例)
计算→称量→融化→灭菌→倒平板。
2.无菌技术
(1)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等，常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法等，对不同的对象需采用不同的消毒或灭菌方法。
(2)微生物培养时获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下内容：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料、用具与周围的物品相接触。
3.倒平板操作
待培养基冷却至60 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，严格遵循教材上的操作步骤。
4.划线分离法
划线分离法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
5.涂布分离法
先将菌液进行系列稀释，然后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分解成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。
突破体验
2.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答下列相关问题：
(1)图甲是利用 法进行微生物接种，图乙是利用 法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是 和 ；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是 和酒精消毒。
(2)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？
。
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
。
(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是 (填“图甲”或“图乙”)。
答案 (1)划线分离 涂布分离 接种环 玻璃刮刀 灼烧灭菌 (2)火焰附近存在着无菌区域 (3)避免培养过程产生的水分影响微生物的生长 (4)图乙
解析 图甲和图乙分别是划线分离法和涂布分离法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和玻璃刮刀。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。
突破3 微生物的分离技术
1.微生物的代谢类型
(1)根据能否将CO2合成有机物可分为：自养型微生物与异养型微生物。
营养类型 碳源 氮源 生长因子
自养型微生物 CO2、NaHCO3等含碳无机物 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要
异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些微生物需要
(2)划分依据：自养型微生物与异养型微生物类型划分的主要依据是能否以无机碳作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。自养型微生物以CO2或碳酸盐为主要或唯一碳源进行代谢生长；异养型微生物必须以现成有机物作为碳源进行代谢生长。
2.选择培养基在微生物培养中的应用
(1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。在配制选择培养基时，往往要在培养基中加入某种化学物质。例如，当需要酵母菌和霉菌时，可以在培养基中加入青霉素，以抑制细菌和放线菌的生长，从而分离出酵母菌和霉菌；在培养基中加入高浓度的食盐溶液可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，可以将金黄色葡萄球菌分离出来。
(2)分离某种目的菌株，应根据它对营养和环境的特殊要求，设计合理的选择培养基。
突破体验
3.在农业生产中发现一种广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行 处理。
(2)要在长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是 。
(3)在划线培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是
或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是 ，有透明带菌落利用的氮源主要是 ，据此可筛选目的菌。
(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：
接种的菌种 一般培养基 实验处理及结果
A 不生长 添加营养物质甲，能生长
B 不生长 添加营养物质乙，能生长
A＋B 能生长 不添加营养物质甲、乙就能生长
突变株A不能在一般培养基上生长的原因是
。
突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能的原因是 。
答案 (1)稀释 (2)在无氮固体培养基中添加了该除草剂 (3)培养基中缺少这些细菌可利用的氮源 (4)氮气
该除草剂 (5)突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶 突变株A生长需要的营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要的营养物质乙，突变株A可以提供(共25张PPT)
章末整合提升
第一部分 微生物的利用
梳理知识 构建纲要
整合重点 提升技能
内容索引
梳理知识 构建纲要
整合重点 提升技能
突破1 划线分离法和涂布分离法的比较
项目 划线分离法 涂布分离法
操作 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面(也是分离纯化的方法)。每一次划线都从上次划线末端开始，目的是获得由单个细菌形成的标准菌落 将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 (1)吸收量较少，较麻烦
(2)平板不干燥，效果不好，容易蔓延
用途 多用于菌种的纯化 (1)多用于筛选菌株
(2)用于平板培养基的回收率计数
易错提醒
两种分离法的易错点拨
(1)在稀释涂布平板操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2)每一稀释倍数菌液都至少要涂布三个平板，作为实验重复，求平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊者，应舍弃该实验数据，不进行统计、计算。
(3)平板冷凝后，皿盖上会凝结成水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基中造成污染。
突破体验
1.微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。下图甲、乙、丙是大肠杆菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图，请据图回答有关问题：
(1)下图甲所示的是制备固体培养基时的实验操作步骤之一，它称为 。
(2)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_____________________________________________
___________________________。
答案
倒平板
将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，
观察培养基上是否有菌落产生
(3)下图乙是平板划线法接种操作示意图，正确的操作顺序是A→B→______
(用字母和箭头表示)；
找出图乙中两处错误的操作： 、 (用字母表示)。
答案
G→F
→E→C→D→H
C D
(4)下图丙是某同学用平板划线法接种后的培养基培养12 h后的实验结果，如果培养基上_____________________________________________________
_________，则说明无菌操作基本符合要求。
答案
生长的菌落颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌
落的特点
突破2 培养基的配制和无菌技术
1.培养基的制备(以LB固体培养基为例)
计算→称量→融化→灭菌→倒平板。
2.无菌技术
(1)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌等，常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法等，对不同的对象需采用不同的消毒或灭菌方法。
(2)微生物培养时获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵。无菌技术围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下内容：
①对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。
②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。
③为避免周围环境中微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料、用具与周围的物品相接触。
3.倒平板操作
待培养基冷却至60 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板，严格遵循教材上的操作步骤。
4.划线分离法
划线分离法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
5.涂布分离法
先将菌液进行系列稀释，然后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分解成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落。
突破体验
2.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答下列相关问题：
(1)图甲是利用 法进行微生物接种，图乙是利用 法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是 和 ；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是 和酒精消毒。
答案
解析
划线分离
涂布分离
接种环
玻璃刮刀
灼烧灭菌
解析 图甲和图乙分别是划线分离法和涂布分离法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和玻璃刮刀。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。
(2)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？
。
(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？
。
答案
火焰附近存在着无菌区域
避免培养过程产生的水分影响微生物的生长
答案
(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是______
(填“图甲”或“图乙”)。
图乙
突破3 微生物的分离技术
1.微生物的代谢类型
(1)根据能否将CO2合成有机物可分为：自养型微生物与异养型微生物。
营养类型 碳源 氮源 生长因子
自养型微生物 CO2、NaHCO3等含碳无机物 NH3、铵盐、硝酸盐等 一般不需要
异养型微生物 糖类、脂肪酸等 铵盐、硝酸盐、蛋白质等 有些微生物需要
(2)划分依据：自养型微生物与异养型微生物类型划分的主要依据是能否以无机碳作为生长的主要或唯一碳源，而与氮源无关。自养型微生物以CO2或碳酸盐为主要或唯一碳源进行代谢生长；异养型微生物必须以现成有机物作为碳源进行代谢生长。
2.选择培养基在微生物培养中的应用
(1)在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。在配制选择培养基时，往往要在培养基中加入某种化学物质。例如，当需要酵母菌和霉菌时，可以在培养基中加入青霉素，以抑制细菌和放线菌的生长，从而分离出酵母菌和霉菌；在培养基中加入高浓度的食盐溶液可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，可以将金黄色葡萄球菌分离出来。
(2)分离某种目的菌株，应根据它对营养和环境的特殊要求，设计合理的选择培养基。
突破体验
3.在农业生产中发现一种广泛使用的除草剂(含氮有机化合物)在土壤中不易降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行 处理。
答案
稀释
(2)要在长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是 。
(3)在划线培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是 或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是 ，有透明带菌落利用的氮源主要是 ，据此可筛选目的菌。
答案
在无氮固体培养基中添加了该除草剂
培养基中缺少这些细菌可利用的氮源
氮气
该除草剂
(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：
答案
接种的菌种 一般培养基 实验处理及结果
A 不生长 添加营养物质甲，能生长
B 不生长 添加营养物质乙，能生长
A＋B 能生长 不添加营养物质甲、乙就能生长
突变株A不能在一般培养基上生长的原因是___________________________
。突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能的原因是______________________________________________________
。
突变株A缺乏合成营养物质甲
所需要的酶
突变株A生长需要的营养物质甲，突变株B可以提供；突变株
B生长需要的营养物质乙，突变株A可以提供第1课时 大肠杆菌的培养和分离
考试要求
知识内容 考试属性及要求 考情解读
大肠杆菌的培养和分离 加试 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的画线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
一、微生物培养的基本条件
1.微生物基础知识
(1)微生物的特点：结构简单，形体微小。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。体内一般不含叶绿素，不能进行光合作用。
(2)细菌的外形与大小
①外形分类
②大小：单细胞不分枝的原核微生物，细胞微小而透明。通常用适当染料染色后，再显微镜观察。
(3)细菌的繁殖：细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。
(4)菌落
①概念：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。(如图)
②作用：细菌的菌落特征因种而异，菌落是鉴定菌种的重要依据。
2.培养基的种类
(1)按物理性质分类
种类 是否含凝固剂 用途
固体培养基 是 主要用于微生物的分离与鉴定等
液体培养基 否 主要用于扩大培养或工业生产
(2)按培养基的用途分类
种类 制备方法 用途
选择培养基 加入某种化学物质 从众多的微生物中分离所需微生物
鉴别培养基 加入某种试剂 鉴别不同种类的微生物
3.无菌技术
(1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。
(2)无菌操作
①对实验空间、操作台可用紫外线或酒精消毒，操作者的手用酒精消毒。
②实验用的培养器皿和培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
1.结合所学知识，完成下图横线上大肠杆菌的结构名称，然后思考：
(1)大肠杆菌与酵母菌相比，在结构上最主要的区别是什么？
答案 大肠杆菌是原核生物，与酵母菌相比，最主要的区别是没有由核被膜包被的细胞核。
(2)大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭肠黏膜并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。
(3)应用：大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。
2.判断下面培养基的各种成分能提供的营养物质类别
成分 FeSO4 蔗糖 (NH4)2SO4 维生素
提供的营养 无机盐 碳源 氮源 生长因子
小贴士 1碳源的种类是判断微生物同化作用类型的依据，能利用无机碳源的生物是自养型的，只能利用有机碳源的生物是异养型的。含氮的有机物如蛋白质既可作为氮源，也可作为碳源。“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁。2其他条件：在提供几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将培养基的pH调至中性偏酸；培养细菌时需要将pH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物时需要提供无氧的条件。
3.比较消毒和灭菌的不同之处
比较项目 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒 较为温和 部分对人体有害的生活状态的微生物 不能
灭菌 强烈 全部微生物 能
小贴士 1每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。2孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。
4.几种消毒和灭菌方法及其适用范围
类型 适用范围 操作方法
消毒方法 煮沸消毒法 日常生活 100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法 不耐高温的液体 70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min
化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
紫外线 房间、仪器设备 紫外线照射30 min
灭菌方法 灼烧 接种工具、接种时用的试管口或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌 耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱，160～170 ℃加热1～2 h
高压蒸汽灭菌 培养基、培养皿等，生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，温度121 ℃，15～30 min
过滤 不耐高温的物质，如尿素、酶等 G6玻璃砂漏斗过滤
1.下列关于大肠杆菌的表述，不正确的是( )
A.其细胞质中只有一种细胞器——核糖体
B.在有氧条件下进行需氧呼吸，无氧条件下进行厌氧呼吸
C.除拟核外，在细胞质中还有许多小的环状DNA分子
D.常作为基因工程目的基因的受体菌
答案 D
2.连线无菌技术的方法、类型及对象
二、大肠杆菌的培养与分离操作
1.培养基的配制
我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体培养基上划线进行分离。以下为本实验中培养基配制步骤，请完成：
(1)称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化钠0.5 g，加水50 mL。
(2)融化：加热融化，用蒸馏水定容到 50 mL。配制LB固体培养基时还需加1 g琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
(3)调pH：用1 mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。
(4)灭菌：在两个250 mL的三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅内，1 kg压力灭菌15 min。
(5)倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60 ℃左右时在酒精灯火焰附近进行操作。其过程(如下图)是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
2.细菌的分离方法
(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸取菌液在固体培养基上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线最后部分的细菌间的距离加大。将接种后的固体培养基培养10～20 h后，可由一个细菌产生单菌落。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。
(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL稀释度不同的稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。在适当的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为适合。
(3)两种分离法的比较：划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。
3.大肠杆菌的培养和分离
(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。
(2)实验步骤
培养基灭菌↓倒平板↓接种↓划线分离↓培养观察 50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌
将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿
培养皿倒置(盖在下面)，放在37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落
1.固体培养基经高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却到60 ℃时，需搁置斜面(图甲)或倒平板(图乙)，请回答：
(1)如何确定制备的培养基灭菌是否合格？
答案 将未接种的培养基在适宜的温度下放置一定时间，观察培养基上是否有菌产生。
(2)在固体培养基凝固前搁置斜面的目的是什么？
答案 增大接种面积。
(3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2.某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
答案 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
3.以下接种、分离操作中，正确的是( )
A.接种前，在火焰上烧红了的接种环，应先冷却再取菌体
B.划线分离时，应间断式划线
C.接种环可在菌液中多次蘸液
D.菌体放入三角瓶的液体培养基中后，三角瓶的封口膜需重新制作
答案 A
解析 划线分离时的划线一定要是连续的；接种时，接种环只能在菌液中蘸取一次，否则会污染菌液；三角瓶的封口膜不需要重新制作，用刚取下的即可。
4.请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题：
(1)稀释
用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL 的大试管中，充分混匀，稀释 倍；按照同样的方法依次进行稀释制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
(2)划线或涂布
①划线分离法
a.操作：在 旁，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。
b.划线方法： 划线和 划线。
c.平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接种环，目的分别是什么？
②涂布分离法
a.将 浸在盛有酒精的烧杯中。
b.取不超过0.1 mL的 ，滴加到培养基表面。
c.将蘸有少量酒精的玻璃刮刀在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s。
d.用玻璃刮刀将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
(3)培养：将接种的平板 于培养箱或温室中37 ℃培养12～24 h。
答案 (1)无菌水 10 (2)①a.酒精灯火焰 b.平行 连续
c.如表所示
第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束时灼烧
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
②a.玻璃刮刀 b.菌液 (3)倒置
一题多变
判断正误：
(1)大肠杆菌是革兰氏阴性菌，对人无害( )
(2)扩大培养大肠杆菌常用LB液体培养基( )
(3)利用涂布分离法分离细菌时，需要先将培养的菌液进行梯度稀释( )
(4)在“大肠杆菌的培养和分离”实验中所用棉花为脱脂棉( )
(5)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果
①每一次划线后都要将接种环灼烧( )
②除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端( )
答案 (1)× (2)√ (3)√ (4)× (5)①√ ②×
1.划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是( )
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C.涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都能在培养基表面形成单个菌落
答案 D
解析 划线分离法不需要进行梯度稀释；划线分离法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；涂布分离法需要将不同稀释度的菌液涂布到琼脂固体培养基的表面；划线分离法和涂布分离法都能在培养基表面形成单个菌落。
2.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是( )
A.①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B.步骤①中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C.步骤③中，每次划线前都需对接种环进行灼烧处理
D.划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
答案 B
解析 由图可知，步骤①是倒平板，步骤②是用接种环蘸取菌液，步骤③是进行平板划线，步骤④是培养。①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A项正确；倒完平板后应立即盖上培养皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C项正确；划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，有利于培养基表面的水分更好地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D项正确。
3.在划线分离法操作中，错误的是( )
A.将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红
B.将烧红的接种环在酒精灯火焰旁边冷却
C.接种环在平板上的划线位置是随机的
D.在蘸取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰
答案 C
解析 接种环灼烧及接种前后试管口要通过火焰，其目的是为了防止杂菌污染，将接种环先冷却再接种可以避免高温烫死菌种，因此A、B、D都是正确的；在平板上划线时，要划三至五条平行线，而不是随机划线，因此C选项错误。
4.下列关于消毒和灭菌的理解，不正确的是( )
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质上是完全相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用的灭菌方法有灼烧法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法
答案 B
解析 消毒是使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或其中一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢和孢子。灭菌则是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
5.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、 和渗透压等条件。
(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 处理(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和 ；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能 。
(3)若用涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的 。
(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 。
(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是 。
(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案 (1)温度 酸碱度
(2)灭菌 消毒 损伤DNA的结构
(3)比例合适
(4)鉴定(或分类)
(5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生
(6)灭菌
课时作业
[基础过关]
1.所有细菌都具有的特征是( )
A.都是异养生物
B.仅在有水条件下繁殖
C.仅在有氧条件下生长
D.生存温度都超过80 ℃
答案 B
解析 细菌的生长所必需的营养元素：碳源、氮源、无机盐、水、生长因子，其中碳源、氮源、无机盐、生长因子因细菌种类的不同，所需的种类也不一样，而水是所有微生物生长共同所需的物质。细菌按同化作用可分为自养型和异养型两种；按异化作用可分为需氧型和厌氧型。
2.下列说法正确的是( )
A.为微生物的生长繁殖提供营养基质的是固体培养基
B.培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落
答案 D
解析 培养基是微生物生长繁殖的营养基质，根据培养基的物理性质不同，可将培养基分成固体培养基、液体培养基和半固体培养基；液体培养基不加凝固剂。
3.平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是( )
A.接种时再拿起来方便
B.在皿底上标记日期等方便
C.正着放置容易破碎
D.防止皿盖上的冷凝水珠落入培养基造成污染
答案 D
解析 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面湿度也比较高。将平板倒置，可以使培养基表面的水分更好地挥发，防止皿盖上水珠落入培养基，造成污染。
4.下列操作与消毒灭菌无关的是( )
A.接种前用肥皂清洗双手，再用酒精擦拭双手
B.接种前用火焰灼烧接种环
C.培养基在60 ℃左右时搁置斜面
D.在酒精灯的火焰旁完成倒平板的操作
答案 C
5.防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是( )
A.实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒
B.接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
C.在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染
D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境
答案 B
解析 对接种环等金属用具进行灼烧灭菌，应放在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰处。
6.下列有关微生物培养的叙述中，不正确的是( )
A.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B.单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法
C.培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌
D.倒置平板防止培养皿盖上的冷凝水滴落
答案 C
解析 微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，A项正确；通常可以采用涂布分离法或划线分离法进行单菌落的分离，以消除污染的杂菌，B项正确；培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，但对于培养基中有高温易分解的成分，就不能用此方法，如培养基中的尿素等物质，C项错误；倒平板后需要将培养皿倒置，以防止培养基蒸发冷凝成的水滴入培养基而造成污染，D项正确。
7.获得纯净培养物的关键是( )
A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌
B.接种纯种细菌
C.适宜环境条件下培养
D.防止外来杂菌的入侵
答案 D
[能力提升]
8.牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，下列关于琼脂的说法不正确的是( )
A.不被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用
B.在微生物生长温度范围内保持固体状态
C.琼脂凝固点低，利于微生物的生长
D.琼脂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强
答案 C
解析 在液体培养基中加入凝固剂如琼脂后，制成琼脂固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一，固体培养基中可形成肉眼可见的单个细胞繁殖而来的子细胞群体，即菌落，用于微生物的分离、计数和菌种鉴定等。琼脂作为一种理想的凝固剂，是由其性质决定的，琼脂不会被微生物利用且对微生物无毒害作用，在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强。琼脂在98 ℃以上可溶解于水，在45 ℃以下凝固，所以在微生物生长温度范围内保持固体状态。
9.以下关于制备固体培养基的叙述中，错误的是( )
A.操作顺序为计算、称量、融化、倒平板、灭菌
B.灭菌前可能需要调pH
C.待培养基冷却至60 ℃左右时进行倒平板
D.待平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置
答案 A
解析 操作顺序应为计算、称量、融化、灭菌、倒平板。
10.在“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是( )
A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
答案 D
解析 A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C项错，接种环灼烧灭菌之后，应待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
11.从自然菌样中筛选较理想菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想菌种的第一步是从适宜的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养耐盐菌的菌样应从 环境中采集。
(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其在群落中的数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择 的培养基，并在 条件下培养。
(3)下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是 ，获得图B效果的接种方法是 。
(4)配制培养基时各种成分在融化后分装前必须进行 ，接种前要进行 。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在 条件下进行。
答案 (1)高盐 (2)以淀粉为唯一碳源 高温
(3)涂布分离法 划线分离法
(4)pH调整 高压蒸汽灭菌 无菌
解析 要采集菌样必须考虑该微生物的生理特性和土壤特点。培养微生物则要考虑它对营养的需要和对氧气、pH的不同要求。根据图A和B不难得出A和B的接种方法。配制培养基的步骤包括配制培养基、调节pH、分装、包扎、灭菌、搁置斜面等。
12.有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答下列问题：
(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的培养基上。从功能上讲，该培养基属于 (A.固体 B.液体 C.纯化 D.选择)培养基。
(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即 。
(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力 。
(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、 和高压蒸汽灭菌。无菌技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
答案 (1)原油 D (2)划线分离法和涂布分离法 (3)强 (4)干热灭菌 火焰
解析 (1)可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存。(2)分离纯化菌种时，接种的方法有划线分离法和涂布分离法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)和高压蒸汽灭菌(如培养基)等。无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。
[个性拓展]
13.为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌的分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用涂布分离法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空平板先行培养了一段时间，这样做的目的是 ；
然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为 。
(2)该小组采用划线分离法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过 灭菌，在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是 。
(3)示意图A和B中， 表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的 的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
答案 (1)检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107
(2)灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)B (4)溶解氧 营养物质
解析 对空白平板进行培养，目的是为了检测灭菌是否合格，若有菌落产生，则灭菌不合格。0.1 mL稀释液中平均含38个细菌，则每1 L水样中细菌数为3.8×107个。接种环需要灼烧灭菌，第二次及以后划线，不再蘸取菌液，而是从上一次的末端开始划线，目的是使菌体逐步稀释以获得单菌落。A是划线分离法接种培养结果，B是涂布分离法接种培养结果。振荡培养可以提高培养液中溶解氧的含量，还可提高营养物质利用率。(共50张PPT)
第1课时 大肠杆菌的培养和分离
第一部分 微生物的利用
考试要求
知识内容 考试属性及要求 考情解读
大肠杆菌的培养和分离 加试 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的画线培养。
3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
一、微生物培养的基本条件
二、大肠杆菌的培养与分离操作
内容索引
当堂检测
一、微生物培养的基本条件
基础梳理
1.微生物基础知识
(1)微生物的特点： 简单，形体 。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。体内一般不含叶绿素，不能进行光合作用。
结构
微小
(2)细菌的外形与大小
①外形分类
球
杆
弧
②大小： 不分枝的 微生物，细胞微小而透明。通常用适当染料 后，再显微镜观察。
(3)细菌的繁殖：细菌以 的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。
单细胞
原核
染色
分裂
(4)菌落
①概念： 或 细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有 的子细胞群体，叫做菌落。(如图)
②作用：细菌的菌落特征因种而异，菌落是 的重要依据。
单个
少数
一定形态结构
鉴定菌种
2.培养基的种类
(1)按物理性质分类
种类 是否含凝固剂 用途
培养基 是 主要用于微生物的分离与鉴定等
培养基 否 主要用于扩大培养或工业生产
固体
液体
(2)按培养基的用途分类
种类 制备方法 用途
培养基 加入某种化学物质 从众多的微生物中 所需微生物
培养基 加入某种试剂 不同种类的微生物
选择
鉴别
分离
鉴别
3.无菌技术
(1)含义：无菌技术不仅能防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，保持微生物的纯培养，而且在分离、转接时亦能防止其他微生物污染。
(2)无菌操作
①对实验空间、操作台可用 或酒精消毒，操作者的手用 消毒。
②实验用的培养器皿和培养基一般用 法灭菌，接种环用灼烧方法灭菌。
③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在 附近进行。
④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
紫外线
酒精
高压蒸汽灭菌
酒精灯火焰
问题探究
1.结合所学知识，完成下图横线上大肠杆菌的结构名称，然后思考：
答案
核糖体
荚膜
细胞壁
质膜
拟核区(DNA)
鞭毛
答案
(1)大肠杆菌与酵母菌相比，在结构上最主要的区别是什么？
答案 大肠杆菌是原核生物，与酵母菌相比，最主要的区别是没有由核被膜包被的细胞核。
(2)大肠杆菌是革兰氏 性、 的肠道杆菌，在肠道中一般对人无害，但也有一些菌株对人体是有害的，可以侵袭 并产生毒素。但是，任何大肠杆菌如果进入人的 系统，都会对人体产生危害。
(3)应用：大肠杆菌是 技术中被广泛采用的工具。
阴
兼性厌氧
肠黏膜
泌尿
基因工程
2.判断下面培养基的各种成分能提供的营养物质类别
成分 FeSO4 蔗糖 (NH4)2SO4 维生素
提供的营养 _______ _____ _____ ________
答案
无机盐
碳源
氮源
生长因子
小贴士
(1)碳源的种类是判断微生物同化作用类型的依据，能利用无机碳源的生物是自养型的，只能利用有机碳源的生物是异养型的。含氮的有机物如蛋白质既可作为氮源，也可作为碳源。“细菌喜荤，霉菌喜素”，细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制。霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁。
(2)其他条件：在提供几种主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及氧气的要求。例如：培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素；培养霉菌时需要将培养基的pH调至中性偏酸；培养细菌时需要将pH调至中性或微碱性；培养厌氧型微生物时需要提供无氧的条件。
3.比较消毒和灭菌的不同之处
答案
比较项目 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭
消毒 _________ 对人体有害的生活状态的微生物 _____
灭菌 _____ 微生物 ___
较为温和
强烈
部分
全部
不能
能
小贴士
(1)每个细菌细胞仅形成一个芽孢，故它无繁殖功能。芽孢有极强的抗热、抗辐射、抗化学药物和抗静水压的能力。芽孢的休眠能力十分惊人，可保持几年到几十年的生活力。
(2)孢子是微生物产生的一种有繁殖或休眠作用的细胞。一般是单细胞，个体微小，通常是适应于从不利环境条件中存活下来，并在条件改变时产生新的营养体，能直接发育成新个体。
4.几种消毒和灭菌方法及其适用范围
答案
类型 适用范围 操作方法
消
毒
方
法 法 日常生活 100 ℃煮沸5～6 min
法 不耐高温的液体 70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min
化学药剂 生物活体、水源等 擦拭等，如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源
_______ 房间、仪器设备 紫外线照射30 min
煮沸消毒
巴氏消毒
紫外线
灭
菌
方
法 灼烧 、接种时用的 或瓶口等 直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
_________ 、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具等 物品放入干热灭菌箱，160～170 ℃加热1～2 h
_____________ 培养基、培养皿等，生产和实验室常用 高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，温度121 ℃，15～30 min
过滤 不耐高温的物质，如尿素、酶等 G6玻璃砂漏斗过滤
答案
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
接种工具
试管口
耐高温
活学活用
1.下列关于大肠杆菌的表述，不正确的是
A.其细胞质中只有一种细胞器——核糖体
B.在有氧条件下进行需氧呼吸，无氧条件下进行厌氧呼吸
C.除拟核外，在细胞质中还有许多小的环状DNA分子
D.常作为基因工程目的基因的受体菌
答案
2.连线无菌技术的方法、类型及对象
答案
二、大肠杆菌的培养与分离操作
基础梳理
1.培养基的配制
我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体培养基上划线进行分离。以下为本实验中培养基配制步骤，请完成：
(1)称量： 。蛋白胨0.5 g，酵母提取物0.25 g，氯化钠0.5 g，加水50 mL。
(2)融化：加热融化，用 定容到50 mL。配制LB固体培养基时还需加1 g ，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是_______________________
。
(3)调pH：用1 mol/L NaOH溶液调节pH至 。
准确称取各成分
蒸馏水
琼脂
防止琼脂糊底而导致烧杯
破裂
偏碱性
(4)灭菌：在两个250 mL的三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入_____
内，1 kg压力灭菌15 min。
灭菌
锅
(5)倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至 时在 附近进行操作。其过程(如下图)是：①将灭过菌的培养皿放在 ，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶口_____
；③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基 ，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将___________
。
60 ℃左右
酒精灯火焰
火焰旁
迅速
通过火焰
倒入培养皿
平板倒过来
放置
2.细菌的分离方法
(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用 蘸取菌液在固体培养基上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐 ，因此，划线最后部分的细菌间的______
加大。将接种后的固体培养基培养10～20 h后，可由 产生 。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上 ，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于______
，将污染的 除去。
8
接种环
减少
距离
一个细菌
单菌落
划线
分离
细菌
杂菌
(2)涂布分离法：先将培养的菌液 ，通常稀释 倍，然后取
mL稀释度不同的稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用________
涂布在培养基平面上，然后进行培养。在 的稀释度下，可培养得到相互分开的菌落。通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落最为适合。
(3)两种分离法的比较： 分离法，方法简单； 分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。
10－5～10－7
0.1
玻璃刮刀
适当
20
划线
涂布
稀释
3.大肠杆菌的培养和分离
(1)实验内容：将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用 培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在 培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。
(2)实验步骤
培养基灭菌
↓
_______
↓ 50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿____
灭菌
将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面
高压
LB液体
LB固体平面
蒸汽
倒平板
在装有液体培养基的 中接种大肠杆菌，培养12 h
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上 ，盖好培养皿
培养皿倒置(盖在下面)，放在37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的_________
_____
↓
划线分离
↓
培养观察
三角瓶
连续划线
单个菌落
接种
问题探究
1.固体培养基经高压蒸汽灭菌后，待培养基冷却到60 ℃时，需搁置斜面(图甲)或倒平板(图乙)，请回答：
答案
(1)如何确定制备的培养基灭菌是否合格？
答案 将未接种的培养基在适宜的温度下放置一定时间，观察培养基上是否有菌产生。
(2)在固体培养基凝固前搁置斜面的目的是什么？
答案 增大接种面积。
(3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
答案
2.某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？
答案 最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。
答案
活学活用
3.以下接种、分离操作中，正确的是
A.接种前，在火焰上烧红了的接种环，应先冷却再取菌体
B.划线分离时，应间断式划线
C.接种环可在菌液中多次蘸液
D.菌体放入三角瓶的液体培养基中后，三角瓶的封口膜需重新制作
答案
解析
解析 划线分离时的划线一定要是连续的；接种时，接种环只能在菌液中蘸取一次，否则会污染菌液；三角瓶的封口膜不需要重新制作，用刚取下的即可。
4.请结合图示，回答下列有关大肠杆菌分离与纯化的问题：
(1)稀释
用1 mL无菌吸管吸取1 mL大肠杆菌培养液，加入到盛有9 mL 的大试管中，充分混匀，稀释 倍；按照同样的方法依次进行稀释制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6系列稀释度的大肠杆菌稀释液。
答案
无菌水
10
(2)划线或涂布
①划线分离法
a.操作：在 旁，左手拿培养皿，右手拿接种环，挑取大肠杆菌培养液在平板上划线。
b.划线方法： 划线和 划线。
答案
酒精灯火焰
平行
连续
c.平行划线时，第一次划线及每次划线之间都要灼烧接种环，划线结束后也要灼烧接种环，目的分别是什么？
答案 如表所示
第一次灼烧 每次划线之前灼烧 划线结束时灼烧
目的 杀死接种环上原有的微生物 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端，使每次划线后菌种数目减少 杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
答案
②涂布分离法
a.将 浸在盛有酒精的烧杯中。
b.取不超过0.1 mL的 ，滴加到培养基表面。
c.将蘸有少量酒精的玻璃刮刀在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s。
d.用玻璃刮刀将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀。
答案
玻璃刮刀
菌液
答案
(3)培养：将接种的平板 于培养箱或温室中37 ℃培养12～24 h。
倒置
一题多变
判断正误：
(1)大肠杆菌是革兰氏阴性菌，对人无害( )
(2)扩大培养大肠杆菌常用LB液体培养基( )
(3)利用涂布分离法分离细菌时，需要先将培养的菌液进行梯度稀释( )
(4)在“大肠杆菌的培养和分离”实验中所用棉花为脱脂棉( )
答案
×
√
√
×
答案
(5)下图中甲为划线分离法中最重要的环节，乙为操作的结果
①每一次划线后都要将接种环灼烧( )
②除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端( )
√
×
课堂小结
划线分离
涂布分离
灭菌
当堂检测
1.划线分离法和涂布分离法是接种微生物的两种常用方法，下列描述正确的是
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.划线分离法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连
续划线的操作
C.涂布分离法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都能在培养基表面形成单个菌落
√
2
3
4
5
1
答案
解析
解析 划线分离法不需要进行梯度稀释；
划线分离法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面；
涂布分离法需要将不同稀释度的菌液涂布到琼脂固体培养基的表面；
划线分离法和涂布分离法都能在培养基表面形成单个菌落。
2
3
4
5
1
2.下图为实验室培养和纯化大肠杆菌过程中的部分操作步骤，下列说法错误的是
A.①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行
B.步骤①中，待倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C.步骤③中，每次划线前都需对接种环进行灼烧处理
D.划线接种结束后，将图④平板倒置后放入培养箱中培养
答案
解析
2
3
4
1
5
√
2
3
4
1
5
解析 由图可知，步骤①是倒平板，步骤②是用接种环蘸取菌液，步骤③是进行平板划线，步骤④是培养。①②③步骤操作时需要在酒精灯火焰旁进行，防止被杂菌污染，A项正确；
倒完平板后应立即盖上培养皿盖，冷却后将平板倒过来放置，B项错误；
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落，C项正确；
划线接种结束后，将平板倒置后放入培养箱中培养，有利于培养基表面的水分更好地挥发和防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染，D项正确。
3.在划线分离法操作中，错误的是
A.将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红
B.将烧红的接种环在酒精灯火焰旁边冷却
C.接种环在平板上的划线位置是随机的
D.在蘸取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过火焰
√
答案
解析
2
3
4
1
5
解析 接种环灼烧及接种前后试管口要通过火焰，其目的是为了防止杂菌污染，将接种环先冷却再接种可以避免高温烫死菌种，因此A、B、D都是正确的；
在平板上划线时，要划三至五条平行线，而不是随机划线，因此C选项错误。
4.下列关于消毒和灭菌的理解，不正确的是
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质上是完全相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用的灭菌方法有灼烧法、干热灭菌法和高压蒸汽灭菌法
解析 消毒是使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或其中一部分对人体有害的微生物，不包括芽孢和孢子。灭菌则是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
解析
2
3
4
1
√
答案
5
5.(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑 、
和渗透压等条件。
(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 处理(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和 ；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能 。
(3)若用涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的 。
答案
2
3
4
1
5
温度
酸碱度
灭菌
消毒
损伤DNA的结构
比例合适
(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的 。
(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_________________________________________
_________________________________。
(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过 处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案
2
3
4
1
5
鉴定(或分类)
将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的
时间，观察培养基上是否有菌落产生
灭菌第2课时 分离以尿素为氮源的微生物
考试要求
知识内容 考试属性及要求 考情解读
分离以尿素为氮源的微生物 加试 1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。
一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备
1.实验目的
(1)使用专一的培养基(含有尿素)分离专一的细菌(有脲酶的细菌)。
(2)利用指示剂颜色的变化检知酶(脲酶)所催化的反应。
2.实验原理
(1)脲或称尿素，是蛋白质降解的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的氮源。
(2)(NH2)2C＝O＋H2O2NH3＋CO2
3.设备及用品
灭菌锅或高压锅、250 mL的三角瓶1个和100 mL的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、接种环和玻璃刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管(15 mm×150 mm)5支和试管架、移液器。
4.实验材料
(1)在100 mL烧杯中装入50 mL 70%酒精，将玻璃刮刀浸泡在其中。
(2)在100 mL三角瓶中配制好25 mL全营养LB固体培养基(0.25 g蛋白胨，0.12 g酵母提取物，0.25 g NaCl和0.5 g琼脂糖，水25 mL)，加上封口膜后灭菌待用。
(3)在100 mL三角瓶中配制好25 mL尿素固体培养基(0.025 g葡萄糖，0.12 g NaCl,0.12 g K2HPO4,0.25 mg酚红和0.5 g琼脂糖，水15 mL)，加上封口膜后灭菌，待冷却至60 ℃时，加入通过G6玻璃漏斗过滤(使之无菌)的10 mL尿素溶液(内含2 g脲)，摇动，混合均匀后待用。
(4)将盛有4.5 mL蒸馏水的5支有塞试管灭菌后待用。
(5)在250 mL三角瓶中装入99 mL蒸馏水，用封口膜盖上，灭菌后待用。
(6)土样1 g(从有哺乳动物排泄物的地方取得)。
1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？
答案 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量非以尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。
2.分离以尿素为氮源的微生物实验所用培养基为尿素固体培养基。在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素，琼脂糖的作用是凝固剂。
3.微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。据此该培养基对微生物具有选择作用，其选择机制是只有能够分泌脲酶从而以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。
4.有脲酶的细菌在生态系统稳态中起什么作用？
答案 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子物质如SO、CO、NO等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。
5.酸碱指示剂是用来指示反应前后的酸碱性变化的。尿素在被脲酶作用前是中性的，而作用后产生了NH3，变成了碱性，本实验使用酚红作为指示剂，在酸性情况下呈黄色，碱性情况下呈红色，变色范围是pH6.4～8.2。培养后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，培养基中的尿素分解产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色，这就表明以尿素为氮源的细菌分泌了脲酶并分解了尿素。圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )
A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.固氮细菌、霉菌、放线菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
答案 C
解析 固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。
2.下列有关叙述，不正确的是( )
A.脲是一种有机化合物，含有氮元素
B.地表土壤中含有一定量的脲
C.以尿素为氮源的细菌含有脲酶
D.在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性
答案 D
解析 根据反应式：(NH2)2C＝O＋H2O2NH3＋CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。
二、分离以尿素为氮源的微生物
1.实验中的对照设置
(1)实验组：以尿素固体培养基进行培养。
(2)对照组：以全营养LB固体培养基进行培养。
2.实验步骤
制备培养基：将已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基分别倒入两个培养皿中，摇匀，
平放至凝固
↓
制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液
↓
用涂布分离法分离细菌：将不同浓度的土壤稀释液分别加入有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布到整个平面上
↓
培养：倒置培养皿，在37 ℃恒温箱中培养24～48 h
↓
观察：培养基中菌落数
阅读教材，回答问题：
1.实验原理
(1)以尿素为氮源的微生物含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
(2)尿素固体培养基的唯一氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源生长繁殖，缺乏脲酶的微生物则由于不能分解尿素而不能生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选分离出以尿素为氮源的微生物。
(3)脲酶可使尿素分解产生氨，从而可使加入酚红指示剂的尿素固体培养基变红。
2.实验步骤
(1)在60 ℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的LB固体培养基和尿素固体培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的超净台上摇匀，平放至凝固。
(2)制备细菌悬液(过程如图1)。在无菌条件下，将1 g土样加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即成10－2土壤稀释液。依此法制备10－3、10－4和10－5土壤稀释液。取样时，尽量只取悬液。摇匀，放在试管架上。
(3)用涂布分离法分离细菌(如图2)。取10－4和10－5的土壤稀释液各0.1 mL，分别加到有LB培养基和尿素培养基的培养皿中，再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
(4)将培养皿倒置，在37 ℃恒温箱中培养24～48 h。观察菌落数。
3.观察结果(如图3)
全营养培养基中有较多的菌落，而尿素为氮源的培养基平板中只有少量菌落。
4.思考与讨论
(1)样品为什么要进行稀释？有什么标准？
答案 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。稀释的标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300，便于计数。
(2)有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？
答案 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨水为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境中变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源，红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。
(3)与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？
答案 这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约500～800 mL尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的。因此，以尿素为氮源的菌群较少。
(4)2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？
答案 配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。
5.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
对照组 作用 现象 结论
未接种培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的培养皿中无菌落生长 未被杂菌污染
接种的牛肉膏蛋白胨培养基 选择培养基筛选作用的确认 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 选择培养基具有筛选作用
3.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示：
→→→→
请回答：
(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用 进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布 个平板，通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
(2)接种后的培养皿 于37 ℃的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的 产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是 。
(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选)( )
A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分
B.倒平板
C.涂布平板
D.微生物的培养
(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是
。
答案 (1)无菌水 3 20 (2)倒置 红色环带 酚红指示剂 (3)以尿素作为唯一氮源 (4)BC (5)土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
解析 (1)涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。(2)接种后需倒置培养皿恒温培养。含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。(4)进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。(5)尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是( )
A.将土壤用无菌水稀释，制备10－3～10－5土壤稀释液
B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C.用加入酚红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株
答案 C
解析 从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上；用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。
一题多变
判断正误：
(1)(NH2)2C＝O＋H2O2NH3＋CO2( )
(2)尿素固体培养基配制后需要在121 ℃(1 kg/cm2压力)下灭菌15 min( )
(3)本实验中的LB培养基和尿素培养基均为固体培养基( )
(4)接种后，应将培养皿正置，在37 ℃恒温箱中培养24～48 h( )
(5)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )
(6)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )
答案 (1)√ (2)× (3)√ (4)× (5)√ (6)×
分离以尿素为氮源的微生物
1.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是( )
A.打开培养皿盖，取一根接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上
B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点
C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
答案 D
解析 接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，否则用未冷却的接种环蘸取稀泥浆会杀灭菌种。
2.用来判断尿素固体选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A.未接种的尿素固体选择培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
D.接种了的尿素固体选择培养基
答案 C
解析 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于尿素固体选择培养基上的数目。因此，选用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。本实验的变量是培养基的种类，其他方面如接种，培养条件等应相同。
3.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂糖、水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂糖、水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂糖、水
答案 A
4.请选出下列正确的操作顺序( )
①土壤取样 ②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A.①→②→③→④ B.①→③→②→④
C.①→②→④→③ D.①→④→②→③
答案 C
5.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示：
(1)图中物质A为 ，若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目，宜采用 法接种到尿素培养基上，对照组配制的培养基为 培养基，若用同浓度的土壤稀释液接种，实验组培养皿中菌落数 (填“大于”“等于”或“小于”)对照组。在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是
。
(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是 灭菌。
A.高压蒸汽 B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡 D.过滤
(3)下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是 。
A.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水
B.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素
C.NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素
D.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物
(4)欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养，应使用LB 培养基。
答案 (1)无菌水 涂布(分离) LB全营养 小于 能利用尿素的细菌产生的脲酶，将培养基中的尿素分解，产生的氨使指示剂呈红色 (2)D (3)B (4)液体
课时作业
[基础过关]
1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( )
A.筛选出能分解尿素的细菌
B.对分离的菌种作进一步鉴定
C.作细菌的营养成分
D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
答案 B
解析 筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的都是对要分离的菌种作进一步的鉴定。
2.土壤中分解尿素的微生物所需氮源为( )
A.硝酸 B.氨
C.尿素 D.蛋白胨
答案 C
解析 只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源。
3.土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种( )
A.尿素酶 B.脲酶
C.蛋白酶 D.肽酶
答案 B
解析 能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。
4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A.一个细菌、液体培养基 B.许多细菌、液体培养基
C.一个细菌、固体培养基 D.许多细菌、固体培养基
答案 C
解析 在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上生活的细菌，当数目较少时也是看不见的。当固体培养基上由许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果是由许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这许多细菌第一不可能是同一种细菌，第二不可能在培养基的同一个点上。
5.在培养基中加入尿素(唯一氮源)，以分离出能分解尿素的细菌，这种加入尿素的培养基在功能上属于( )
A.选择培养基 B.固体培养基
C.液体培养基 D.半固体培养基
答案 A
解析 选择培养基是从功能上对培养基进行分类的，B、C、D三项所述的培养基是根据培养基的物理状态进行分类的。题述培养基能分离出以尿素为唯一氮源的细菌，故是一种选择培养基。
6.下面对“从土壤中分离分解尿素的细菌过程中灭菌”的理解，不正确的是( )
A.防止杂菌污染
B.消灭全部微生物
C.稀释土壤溶液的过程必须在酒精灯火焰旁操作
D.灭菌必须在接种前进行
答案 B
7.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应10－6培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因不可能是( )
A.土样不同 B.培养基污染
C.操作失误 D.没有设置对照
答案 D
解析 实验结论是否正确与是否设置对照有直接关系，但实验结果与是否设置对照无关。
[能力提升]
8.下列有关尿素培养基的叙述，不正确的是( )
A.根据物理性质划分，该培养基属于固体培养基
B.培养基中的唯一氮源为尿素，用以筛选以尿素为氮源的微生物
C.培养基中的酚红，用以鉴别以尿素为氮源的微生物
D.培养基中加入G6玻璃漏斗过滤的尿素后，要用500 g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30 min
答案 D
解析 因为尿素加热会分解，所以应先将培养基经500 g/cm2压力灭菌30 min(为防止葡萄糖分解碳化)，再添加G6玻璃漏斗过滤后的尿素。
9.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍的稀释液，其原因是( )
A.细菌个体小，真菌个体大
B.细菌易稀释，真菌不易稀释
C.细菌在土壤中数量比真菌多
D.随机的，没有原因
答案 C
解析 土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。
10.如图是“分离以尿素为氮源的微生物”实验的基本流程，请回答下列问题：
(1)该实验培养基可以不含有 。
A.尿素 B.氯化钠
C.葡萄糖 D.琼脂
(2)尿素溶液可用 使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是 。
(3)图中步骤C为 。相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是 。
(4)如果菌落周围出现 色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
答案 (1)B
(2)G6玻璃漏斗过滤 将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现
(3)倒平板 单菌落更易分开
(4)红
解析 (1)分解尿素的细菌是异养微生物，因此培养基中应该加入有机碳源，如葡萄糖；分离分解尿素的细菌的培养基从功能上分属于选择培养基，应该以尿素为唯一氮源；从物理性质上分属于固体培养基，因此应加入凝固剂琼脂。故选B。
(2)尿素溶液可用G6玻璃漏斗过滤使之无菌。若要检查B过程灭菌是否彻底，可以采用的方法是将空白培养基放在适宜温度下培养一段时间，观察有无菌落出现。
(3)图中步骤C为倒平板。相对于划线分离法，过程D涂布分离法的优点是单菌落更易分开。
(4)如果菌落周围出现红色环带，说明该菌落能分泌脲酶。
11.芽孢杆菌是一种耐高温的细菌，可用于植物保护、饲料添加及环境净化。为获取土壤中的芽孢杆菌，某同学进行了相关实验，操作流程如下图：
(1)上图中85 ℃处理10分钟的目的是 。上图中步骤A为 ，步骤B为 。要判断培养基灭菌是否彻底，可采用的方法是 。
(2)下列消毒灭菌方法中，常用于接种环灭菌的是 。
A.70%酒精浸泡 B.紫外线照射
C.灼烧 D.高压蒸汽
(3)请分析划线分离法能得到单菌落的原因：
。
若要对每克土样中所含芽孢杆菌进行计数，应采用 接种方法。
(4)菌株经鉴定后，可进一步接种到 培养基中扩大培养，培养时需要 。
答案 (1)筛选出耐高温菌株 倒平板 培养 将灭菌后的培养基培养一段时间后观察是否出现菌落 (2)C(3)划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，到划线最后部分细菌间距离加大，经培养后能得到单菌落 涂布分离
(4)LB液体 振荡
12.幽门螺杆菌(Hp)感染是急慢性胃炎和消化性溃疡的主要致病因素。在患者体内采集样本并制成菌液后，进行分离培养。实验基本步骤如下：
→→→→
请回答：
(1)在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，这是因为Hp含有 ，它能以尿素作为氮源；若有Hp，则菌落周围会出现 色环带。
(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是 。
A.高压蒸汽 B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡 D.过滤
(3)步骤X表示 。在无菌条件下操作时，先将菌液稀释，然后将菌液 到培养基平面上。菌液稀释的目的是为了获得 菌落。
(4)在培养时，需将培养皿倒置并放在 中。若不倒置培养，将导致 。
(5)临床上用呼气试验检测人体是否感染Hp，其基本原理是Hp能将标记的 分解为氨和二氧化碳。
答案 (1)脲酶 红 (2)D (3)接种 涂布 单一 (4)恒温培养箱 无法形成单一菌落 (5)尿素
解析 能以尿素作为氮源的微生物体内含有脲酶，可将尿素分解为CO2和NH3，NH3遇酚红指示剂会显红色。尿素不能高温灭菌，因为加热会导致尿素分解，所以应该用过滤方法灭菌。将稀释菌液接种到培养基上的方法应该是涂布分离法。培养时，培养皿应倒置，否则水蒸气遇培养皿盖冷凝形成水珠滴落到培养基上，会使菌落相互粘连，导致无法形成单菌落。
[个性拓展]
13.下面是探究如何从土壤中分离出自生固氮菌及其计数的实验，完成下列问题：
实验原理：农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表层土壤制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离。
材料用具：农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛有9 mL无菌水的试管、无菌吸管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛有90 mL无菌水的锥形瓶、恒温箱。
(1)方法步骤：
①倒平板：分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在 操作。
②制备土壤稀释液：取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌吸管吸取上清液1 mL，转至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释到10－7稀释度。
③涂布：按照由10－7～10－3稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布，每个稀释度下，无氮培养基应至少涂布 个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布 个。
④培养：放入恒温箱内，在28～30 ℃下培养3～4 d。
⑤细菌的计数：当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。如果计数的平均值为50，则每克样品中的菌落数是 。(稀释度是10－5)
(2)预期结果：相同稀释度下，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数 (填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。原因是 。
答案 (1)①酒精灯火焰旁 ③3 1 ⑤30～300 5×107 (2)多于 无氮培养基上只有土壤中的自生固氮菌生长繁殖，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类生存
解析 在酒精灯火焰旁倒平板，可以减少杂菌污染。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值；若计数的平均值为50，样品稀释度为10－5，则每克样品中的菌落数为50÷0.1÷10－5＝5×107。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，以消除无关变量对实验结果的影响，该培养基适合几乎所有细菌生存，所以，它比无氮培养基上的菌落数目多。(共42张PPT)
第2课时 分离以尿素为氮源的微生物
第一部分 微生物的利用
考试要求
知识内容 考试属性及要求 考情解读
分离以尿素为氮源的微生物 加试 1.进行微生物分离。使用含有尿素的培养基，采用涂布分离法，分离有脲酶的细菌。
2.使用酚红指示剂检测以尿素为氮源的细菌的存在。
3.说明分离以尿素为氮源的细菌的实验原理。
4.举例说明本实验分离出来的细菌不一定都是以尿素为氮源的细菌。
一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备
二、分离以尿素为氮源的微生物
内容索引
当堂检测
一、实验目的、原理、设备、用品及材料准备
基础梳理
1.实验目的
(1)使用专一的培养基(含有 )分离专一的细菌(有 的细菌)。
(2)利用指示剂颜色的变化检知酶( 酶)所催化的反应。
2.实验原理
(1)脲或称尿素，是 的产物。有一些细菌含有脲酶可以分解尿素，利用尿素作为其生长的 。
(2)(NH2)2C＝O＋H2O ＋_____
尿素
脲酶
脲
蛋白质降解
氮源
2NH3
CO2
3.设备及用品
灭菌锅或高压锅、250 mL的三角瓶1个和100 mL的三角瓶2个、封口膜和橡皮圈、培养皿4个、 和玻璃刮刀、恒温培养箱、摇床、酒精灯和 、一次性塑料手套、装有酒精棉球的广口瓶、镊子、有盖的试管(15 mm×150 mm)5支和试管架、 。
4.实验材料
(1)在100 mL烧杯中装入50 mL 70%酒精，将 浸泡在其中。
(2)在100 mL三角瓶中配制好25 mL (0.25 g蛋白胨，0.12 g酵母提取物，0.25 g NaCl和0.5 g琼脂糖，水25 mL)，加上封口膜后
待用。
接种环
超净台
移液器
玻璃刮刀
全营养LB固体培养基
灭菌
(3)在100 mL三角瓶中配制好25 mL尿素固体培养基(0.025 g葡萄糖，0.12 g NaCl，0.12 g K2HPO4，0.25 mg酚红和0.5 g琼脂糖，水15 mL)，加上封口膜后 ，待冷却至60 ℃时，加入通过 (使之无菌)的10 mL (内含2 g脲)，摇动，混合均匀后待用。
(4)将盛有4.5 mL 的5支有塞试管灭菌后待用。
(5)在250 mL三角瓶中装入99 mL蒸馏水，用封口膜盖上， 后待用。
(6)土样1 g(从 的地方取得)。
灭菌
G6玻璃漏斗过滤
尿素溶液
蒸馏水
灭菌
有哺乳动物排泄物
问题探究
1.为什么要用琼脂糖代替琼脂配制固体培养基？
答案 琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养基上产生大量非以尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故而用经纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂。
答案
2.分离以尿素为氮源的微生物实验所用培养基为 培养基。在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是 ，提供氮源的是 ，琼脂糖的作用是 。
3.微生物要利用尿素需要分泌脲酶，不能分泌脲酶的微生物不能利用尿素。据此该培养基对微生物具有 作用，其选择机制是只有_____________
的微生物才能在该培养基上生长。
答案
尿素固体
葡萄糖
尿素
凝固剂
选择
能够分泌脲酶
从而以尿素作为氮源
4.有脲酶的细菌在生态系统稳态中起什么作用？
答案 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下会被水解，水解后的氨使土壤变成碱性，氨与其他阴离子物质如 等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。
答案
5.酸碱指示剂是用来指示反应前后的酸碱性变化的。尿素在被脲酶作用前是 性的，而作用后产生了NH3，变成了 性，本实验使用 作为指示剂，在酸性情况下呈 色，碱性情况下呈 色，变色范围是pH6.4～8.2。培养后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，培养基中的尿素分解产生的氨使培养基变碱性，于是酚红由黄色变成红色，这就表明
。圆形红色区域愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。
答案
中
碱
酚红
黄
红
以尿素为氮源的细菌分泌了脲酶并分解了尿素
活学活用
1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出
A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.固氮细菌、霉菌、放线菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
答案
解析
解析 固氮细菌可以在无氮培养基上生长；
青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；
加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。
2.下列有关叙述，不正确的是
A.脲是一种有机化合物，含有氮元素
B.地表土壤中含有一定量的脲
C.以尿素为氮源的细菌含有脲酶
D.在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会导致培养基呈酸性
答案
解析
解析 根据反应式：(NH2)2C＝O＋H2O 2NH3＋CO2，在尿素固体培养基上培养含有脲酶的微生物会产生NH3，从而导致培养基呈碱性。
二、分离以尿素为氮源的微生物
基础梳理
1.实验中的对照设置
(1)实验组：以 培养基进行培养。
(2)对照组：以 培养基进行培养。
2.实验步骤
制备培养基：将已灭菌的 和 分别倒入
两个培养皿中，摇匀，平放至凝固
↓
制备细菌悬液：用1 g土样配制不同浓度的细菌悬液
↓
LB固体培养基
尿素固体培养基
尿素固体
全营养LB固体
用涂布分离法分离细菌：将 分别加入有LB培养基 和尿素培养基的培养皿中，并用玻璃刮刀涂布
到整个平面上
↓
培养：倒置培养皿，在 ℃恒温箱中培养24～48 h
↓
观察：培养基中_______
不同浓度的土壤稀释液
37
菌落数
问题探究
阅读教材，回答问题：
1.实验原理
(1)以尿素为氮源的微生物含有 酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
(2)尿素固体培养基的唯一氮源为 ，只有能合成 的微生物才能分解尿素，以尿素为氮源生长繁殖，缺乏 的微生物则由于不能分解尿素而不能生长繁殖，所以，用该培养基能够筛选分离出以 为氮源的微生物。
(3)脲酶可使尿素分解产生氨，从而可使加入酚红指示剂的尿素固体培养基变 。
答案
脲
尿素
脲酶
红
脲酶
尿素
2.实验步骤
(1)在60 ℃左右时，将两只三角瓶中已灭菌的 培养基和_________
培养基，在酒精灯旁分别倒入两个培养皿中，在水平的 上摇匀，平放至凝固。
答案
LB固体
尿素固体
超净台
(2)制备 (过程如图1)。在无菌条件下，将1 g土样加到有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡10 min，即成 土壤稀释液。依此法制备 、
和 土壤稀释液。取样时，尽量只取 。摇匀，放在试管架上。
答案
细菌悬液
10－2
10－3
10－4
10－5
悬液
答案
(3)用 法分离细菌(如图2)。取 和 的土壤稀释液各
，分别加到有 和 的培养皿中，再将保存在
中的 放在 上，待刮刀上火焰熄灭，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。
(4)将培养皿 ，在 中培养24～48 h。观察菌落数。
涂布分离
10－4
10－5
0.1 mL
LB培养基
尿素培养基
70%酒精
玻璃刮刀
酒精灯火焰
倒置
37 ℃恒温箱
答案
3.观察结果(如图3)
中有较多的菌落，而 为氮源的培养基平板中只有
少量菌落。
全营养培养基
尿素
答案
4.思考与讨论
(1)样品为什么要进行稀释？有什么标准？
答案 样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。稀释的标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在30～300，便于计数。
答案
(2)有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现？
答案 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中的尿素水解，尿素分解后产生氨，氨水为碱性，酚红在酸性环境中为黄色，在碱性环境中变为红色。培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株能以尿素为氮源，红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。
答案
(3)与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落？
答案 这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数。因为人和其他哺乳动物产生的排泄物毕竟是少量的，每人每天排泄约500～800 mL尿，但随地便溺的不多，动物虽然随地便溺，但尿素还是可以在高温下自然分解的。因此，以尿素为氮源的菌群较少。
答案
(4)2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？
答案 配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。
答案
5.微生物筛选过程中必要的两种对照培养基及其作用
对照组 作用 现象 结论
未接种培养基 有无杂菌污染的判断 未接种的培养皿中无菌落生长 _____________
接种的牛肉膏蛋白胨培养基 选择培养基筛选作用的确认 牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的数目 选择培养基具有
作用
未被杂菌污染
筛选
活学活用
3.现从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如下图所示：
请回答：
(1)欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，将土壤用 进行一系列的梯度稀释，同一浓度的土壤稀释液应至少涂布 个平板，通常以每个培养皿中有 个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
解析 涂布分离法必须先用无菌水对土样进行一系列的梯度稀释，通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落的那一组稀释倍数为最合适。
无菌水
3
20
答案
解析
(2)接种后的培养皿 于37 ℃的恒温箱中培养。若培养基中存在含脲酶的细菌，其菌落周围会出现 ，这是由于尿素被分解产生氨气，与该培养基中的 产生的颜色变化，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。
解析 接种后需倒置培养皿恒温培养。含有脲酶的细菌能够将尿素分解，产生的氨气使培养基呈碱性，导致培养基中的酚红指示剂呈红色。
(3)分离能利用尿素的细菌时所用的培养基成分上最主要的特点是_______
。
解析 分离能利用尿素的细菌时所用的培养基应以尿素为唯一氮源。
答案
倒置
红色环带
酚红指示剂
以尿素
作为唯一氮源
解析
(4)下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的是(多选)
A.称取葡萄糖、琼脂糖等培养基成分
B.倒平板
C.涂布平板
D.微生物的培养
解析 进行微生物培养和分离时，倒平板、涂布平板均需要在酒精灯火焰旁进行，以防杂菌污染。
答案
解析
(5)与LB全营养培养基上的菌落数相比，尿素培养基上只有少数菌落的原因是 。
解析 尿素培养基只以尿素为氮源，在尿素培养基上生长繁殖的只能是少数能够合成脲酶可利用尿素的细菌。
土壤中能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少数量
答案
解析
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是
A.将土壤用无菌水稀释，制备10－3～10－5土壤稀释液
B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C.用加入酚红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株
解析 从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；
将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上；
用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；
从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。
答案
解析
一题多变
判断正误：
(1)(NH2)2C＝O＋H2O 2NH3＋CO2( )
(2)尿素固体培养基配制后需要在121 ℃(1 kg/cm2压力)下灭菌15 min( )
(3)本实验中的LB培养基和尿素培养基均为固体培养基( )
(4)接种后，应将培养皿正置，在37 ℃恒温箱中培养24～48 h( )
(5)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源( )
(6)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低( )
答案
√
×
√
×
√
×
课堂小结
分离以尿素为氮源的微生物
实验前的准备
实验目的
实验原理
实验设备、用品及材料
实验过程：倒 →制菌悬液→涂布分离细菌
→ 培养→ 数观察)
平板
倒置
菌落
当堂检测
1.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的方法是
A.打开培养皿盖，取一根接种环蘸取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养
基的表面上
B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀泥浆，略微打开
培养皿盖，在培养基的表面轻点
C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后蘸取少许稀
泥浆，在培养基的表面轻点
D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后
蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
√
2
3
4
5
1
答案
解析
解析 接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后蘸取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，否则用未冷却的接种环蘸取稀泥浆会杀灭菌种。
2
3
4
5
1
2.用来判断尿素固体选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是
A.未接种的尿素固体选择培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨(全营养)培养基
D.接种了的尿素固体选择培养基
解析 将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于尿素固体选择培养基上的数目。因此，选用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。本实验的变量是培养基的种类，其他方面如接种，培养条件等应相同。
答案
解析
2
3
4
1
5
√
3.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂糖、水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂糖、水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂糖、水
√
答案
2
3
4
1
5
4.请选出下列正确的操作顺序
①土壤取样
②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布
④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A.①→②→③→④ B.①→③→②→④
C.①→②→④→③ D.①→④→②→③
2
3
4
1
√
答案
5
5.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，实验过程如图所示：
(1)图中物质A为 ，若要统计每克土壤样品中以尿素为氮源的细菌的活菌数目，宜采用 法接种到尿素培养基上，对照组配制的培养基为 培养基，若用同浓度的土壤稀释液接种，实验组培养皿中菌落数 (填“大于”“等于”或“小于”)对照组。在能利用尿素的细菌菌落周围，有红色环带出现的原因是____________________________
。
答案
2
3
4
1
5
无菌水
涂布(分离)
LB全营养
小于
能利用尿素的细菌产生的脲酶，
将培养基中的尿素分解，产生的氨使指示剂呈红色
(2)下列对尿素溶液进行灭菌的最适方法是 灭菌。
A.高压蒸汽 B.紫外灯照射
C.70%酒精浸泡 D.过滤
(3)下列培养基中，能分离出分解尿素的细菌的是 。
A.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水
B.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、尿素
C.NaCl、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物、尿素
D.葡萄糖、NaCl、K2HPO4、酚红、琼脂糖、水、蛋白胨、酵母提取物
(4)欲将分离得到的以尿素为氮源的细菌进行扩大培养，应使用LB 培养基。
答案
2
3
4
1
5
√
√
液体
