第二节 分离特定的微生物并测定其数量
[学习目标] 1.认识各种微生物形成的菌落特征。 2.学会利用涂布平板法分离、培养微生物，并测定其数量。(重难点) 3.掌握利用选择培养基分离特定微生物的方法。(重点)
知识点一| 微生物的分离
1．分离原理
在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。
2．分离方法
(1)平板分离法：包括涂布平板法和混合平板法。能将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面，每个孤立的活微生物体经过生长、繁殖均可形成单个菌落。
(2)选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。
(3)根据菌落特征初步分离：
①菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
②菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以成为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。
探讨：在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌吗？
提示：标准的单个菌落中只含有一种细菌。
探讨：如果要分离厌氧菌，应在什么条件下培养？
提示：在无氧条件下培养。
探讨：在选择培养分离微生物的过程中，“选择培养”的培养基按物理性质划分属于什么培养基？为什么？
提示：固体培养基。便于选择、分离所需要的微生物。
1．涂布平板法与混合平板法的比较
比较
操作
特点
结果
涂布
平板法
取一定稀释度的样品涂布平板
用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀
先制作琼脂平板后加入菌液
细菌菌落通常仅在平板表面生长
混合
平板法
取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合
将混合液倒入无菌培养皿
菌液与琼脂混合，共同倒平板
细菌菌落出现在平板表面及内部
2.选择培养基的选择作用
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
1．微生物的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，关于两者的区别下列说法正确的是( )
比较方面
平板划线法
稀释涂布平板法
①
需在无菌条件下操作
不需无菌操作
②
培养基中不加琼脂
培养基中加有琼脂
③
不可计算菌液中的活菌数
可计算菌液中的活菌数
④
需要接种环
需要玻璃涂布器
A.②、④ B．③、④
C．①、④ D．②、③
B [平板划线法和稀释涂布平板法都需要进行无菌操作，避免杂菌污染；平板划线法和稀释涂布平板法都使用固体培养基，培养基中都加有琼脂；平板划线法采用接种环或接种针进行接种，而稀释涂布平板法采用玻璃涂布器进行接种；稀释涂布平板法可计算菌液中的活菌数，平板划线法不能计算出菌液中的活菌数。]
2．(2019·全国卷Ⅰ)已知一种有机物X(仅含有C、H两种元素)不易降解，会造成环境污染。某小组用三种培养基筛选土壤中能高效降解X的细菌(目标菌)。
Ⅰ号培养基：在牛肉膏蛋白胨培养基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(15 g/L)。
Ⅲ号培养基：氯化钠(5 g/L)，硝酸铵(3 g/L)，其他无机盐(适量)，X(45 g/L)。
回答下列问题。
(1)在Ⅰ号培养基中，为微生物提供氮源的是________________，Ⅱ、Ⅲ号培养基中为微生物提供碳源的有机物是________。
(2)若将土壤悬浮液接种在Ⅱ号液体培养基中，培养一段时间后，不能降解X的细菌比例会__________，其原因是___________________________________
_________________________________________________________________
________________________________________________________________。
(3)Ⅱ号培养基加入琼脂后可以制成固体培养基，若要以该固体培养基培养目标菌并对菌落进行计数，接种时，应采用的方法是__________________。
(4)假设从Ⅲ号培养基中得到了能高效降解X的细菌，且该菌能将X代谢为丙酮酸，则在有氧条件下，丙酮酸可为该菌的生长提供________和________。
[答案] (1)牛肉膏、蛋白胨 X
(2)下降 不能降解X的细菌因缺乏碳源不能增殖，而能降解X的细菌能够增殖
(3)稀释涂布平板法
(4)能量 合成其他物质的原料
知识点二| 土壤微生物的分离、培养与数量测定
1．涂布平板法培养和计数土壤微生物
(1)过程：
(2)计数：每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)。
2．显微镜直接计数法
(1)原理：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)血球计数板：血球计数板是一块特制的载玻片。其上有特定面积为1 mm2、高为0.1 mm的计数室，一个计数室又被分成25个(或16个)中方格，每个中方格再被划分成16个(或25个)小方格，每个计数室都由400个小方格组成。
(3)操作过程：
①将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让培养液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。
②加样后静止5 min，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。
(4)计算公式：1 mL悬液所含菌体总数＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数。
3．分离土壤中能分解纤维素的微生物
(1)实验目的：分离以纤维素为唯一碳源的微生物。
(2)培养基配方特点：纤维素是唯一的碳源。
(3)基本步骤：制备培养基―→制备土壤悬液―→接种培养―→观察。
探讨：你认为涂布平板法计数的菌落数与实际活菌数之间存在什么样的关系？
提示：实际活菌数大于计数的菌落数目。原因是有的菌落不只由一个细菌生长而成。
探讨：常见的菌数计数的方法有哪些？它们所利用的原理分别是什么？
提示：(1)显微镜直接计数法。
原理：利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。
(2)间接计数法(活菌计数法)。
原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
1．直接计数法与间接计数法的比较
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：
项目
直接计数法
间接计数法
主要
用具
显微镜、细菌计数板
培养基
计数
依据
菌株本身
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，且有一定误差
计算
公式
每毫升原液含菌株数＝400×104×每小格平均菌株数×稀释倍数
每毫升原液含菌株数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)
2.筛选能分解纤维素的微生物流程图
1．某同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上的菌落数的平均值为215，那么每毫升样品中菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)( )
A．2.15×108 B．2.15×109
C．215 D．21.5
B [稀释倍数为106,0.1 mL稀释液的菌落数的平均值为215，则每毫升样品中菌落数为215÷0.1×106＝2.15×109。]
2．图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。
该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白质含________个氨基酸。
[解析] (1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175(个)。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。
(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。
[答案] (1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
[课堂小结]
知识网络构建
核心语句归纳
1.实验室中分离微生物的方法有平板分离法和选择培养分离，平板分离法常用的有涂布平板法和混合平板法。
2.针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合这种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离。
3.测定微生物数量的常用方法有涂布平板法和显微镜直接计数法。涂布平板法计数的结果与待测样品中真正的含菌数量相比往往偏低。
4.涂布平板法培养和计数微生物的流程为：准备实验器材→采集土壤，制备悬液→选择适于分离特定微生物的培养基→接种→培养与观察→计数菌落。
5.涂布平板法计数微生物的公式：每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)
1．下列关于微生物分离和培养的有关叙述，错误的是( )
A．微生物培养前，需对培养基进行消毒
B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
A [微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法而一般不用活菌计数法；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度以便能从中选择出菌落数在30～300间的平板进行计数；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源。]
2．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
C [要分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中尿素应是唯一的氮源，不能加硝酸盐；在固体培养基上形成菌落，要加琼脂作凝固剂；分解尿素的细菌是异养生物，要加有机碳源(如葡萄糖)。]
3．用涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数，原因是( )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
C [当稀释倍数适宜时，培养基上的一个菌落可能来源于样品稀释液中的一个活菌，但也可能由2个或2个以上活菌生长而成，因此菌落数往往比活菌的实际数低。]
4．将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
(1)M培养基用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_______________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是
________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
[解析] (1)M培养基用于真菌的筛选，抗生素能够杀菌，因此培养基中应加入链霉素以抑制细菌的生长，加入了链霉素的培养基属于选择培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，包括水、无机盐、碳源、氮源等。生物大分子包括蛋白质、核酸、多糖，由于糖类的元素组成中只有C、H、O，因此氮源进入细胞后可参与蛋白质、核酸等的合成。
(3)淀粉可以用碘液鉴定产生蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，因此可通过加入显色剂选出能产淀粉酶的微生物。
(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差，因此其可信度差。
[答案] (1)细菌 选择
(2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
课件61张PPT。第一章 无菌操作技术实践第二节 分离特定的微生物并测定其数量微生物的分离选择菌落单个固体混合平板选择培养抑制菌落固体固体颜色分类形状生长群体形态结构土壤微生物的分离、培养与数量测定稀释倍数血球计数板载玻片毛细滴管盖玻片400255稀释倍数纤维素接种培养土壤悬液点击右图进入…Thank you for watching !课时分层作业(三)
(建议用时：45分钟)
[基础达标练]
1．下列关于微生物分离的叙述，错误的是( )
A．平板分离法能将单个微生物经过培养形成便于移植的菌落
B．只有细菌才可以形成菌落，所以只有分离细菌时才可能获得菌落
C．平板分离法有涂布平板法和混合平板法等
D．涂布平板法得到的菌落仅在平板的表面生长
B [大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类均能在固体培养基上形成菌落。]
2．产生标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌，液体培养基
B．许多细菌，液体培养基
C．一个细菌，固体培养基
D．许多细菌，固体培养基
C [菌落是指单个微生物的子细胞群体，在固体培养基上肉眼可见，是作为菌种鉴定的重要依据，若是多个细菌形成的菌落则不是标准菌落。]
3．有关涂布平板法的叙述错误的是( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C．适宜条件下培养
D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落
D [涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养的过程。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。]
4．从土壤中分离能分解尿素的微生物与分离能分解纤维素的微生物时，所利用的培养基中最明显的特点是( )
A．前者尿素是唯一的氮源，后者纤维素是唯一的碳源
B．二者都具有琼脂成分
C．二者的pH相同
D．以上均不正确
A [由于分离微生物所利用的是选择培养基，所以培养基中有与其他培养基不同的某种成分，该种成分是由培养的目的微生物而定的。分离能分解尿素的微生物，所利用的培养基中尿素是唯一的氮源，凡是能分解尿素的微生物就能生存，否则就不能生存， 由相同的原理可知，分离能分解纤维素的微生物时，纤维素是唯一的碳源。]
5．选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物，通过不含有机物的培养基、缺氮培养基、含尿素(不含其他氮源)的培养基，可从土壤中分离出的微生物依次是( )
A．硝化细菌、放线菌、根瘤菌
B．根瘤菌、青霉菌、固氮菌
C．异养型细菌、放线菌、硝化细菌
D．自养型细菌、固氮菌、分解尿素的细菌
D [选择培养基是根据不同微生物的代谢特点，通过改变培养基的成分，以达到选择某种微生物的目的。不含有机物的培养基可以选择自养型微生物，缺少氮元素的培养基可以培养固氮微生物，含尿素(不含其他氮源)的培养基可以选择能分解尿素的微生物。]
6．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需要的微生物。在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚，可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出( )
A．大肠杆菌 B．霉菌
C．放线菌 D．圆褐固氮菌
A [固氮细菌的生长不需要从培养基中获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长，因此可分离出圆褐固氮菌；在加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，可分离出霉菌；在加入10%的酚的培养基中，因该培养基能抑制细菌和霉菌的生长，所以可分离出放线菌。利用上述三种培养基无法分离出大肠杆菌。]
7．下列说法中不正确的是( )
A．科学家从70～80 ℃热泉中分离得到耐高温的Taq DNA聚合酶
B．统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C．设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D．同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多
B [Taq DNA聚合酶是从一种水生耐热菌中分离提取的，这种耐热菌能在70～80 ℃的高温条件下生长。统计平板的菌落数时，应选择菌落数在30～300的平板，每个稀释度至少取3个平板，为了提高准确度，应求其平均值。设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。]
8．下列关于分离纤维素分解菌实验的叙述，错误的是( )
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
A [经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。]
9．用涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235
D [在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板，但是其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值来求平均值。]
10．在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。计数板是一个特制的可在显微镜下观察的玻片，样品就滴在计数室内。计数室由25×16＝400(个)小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将1 mL酵母菌样品加99 mL无菌水稀释，盖上盖玻片，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。
(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入计数板进行计数，并记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。
请纠正该同学实验操作中的3处错误：
①______________________________________________________________；
②______________________________________________________________；
③______________________________________________________________；
(2)在实验前应该对计数板、吸管等器具进行_________________________
处理。
(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是_。
(4)如果观察到如图所示a、b、c、d、e 5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌________个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？_______。
[解析] (1)在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔24小时就要统计一次菌落数目。
(2)为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、计数板等器具需进行灭菌处理。
(3)(4)解答时要注意以下两点：①统一单位；②注意体积的变化。400个小室共容纳液体总体积为0.1 mm3，则80个小室容纳体积为2×10－2mm3，含酵母菌48个，又因酵母菌培养液总体积为100 mL，统一单位后即可求出酵母菌个数。
[答案] (1)①应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数
②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养
③应连续七天观察、取样计数并记录数据
(2)灭菌 (3)适当稀释
(4)2.4×108 多次计数，求平均值
[能力提升练]
11．下列关于分离与培养土壤微生物的操作，叙述错误的是( )
A．制备土壤悬液时，应依此配制成浓度分别为10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8g/mL的土壤悬液
B．制平板时，应将熔化的培养基冷却到45～50 ℃后再倒入培养皿中，并迅速盖好培养皿盖
C．接种时应从最低的土壤悬液开始，并且每个浓度设置3个重复组
D．计数菌落时，应选取菌落数为100～300的一组代表进行统计
D [分离与培养土壤微生物的操作过程中，对土壤悬液应进行10倍浓度梯度差的稀释，并稀释至10－8g/mL。制平板时应防止杂菌的污染，接种时应从最低的土壤悬液开始，并且每个浓度设置3个重复组。计数时应选取菌落数为30～300的一组为代表进行统计。]
12．现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，你认为它们适于分离( )
成分
KH2PO4
MgSO4·7H2O
NaCl
CaSO4·2H2O
CaCO3
葡萄糖
纯淀粉
甲培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
0.5%
2%
乙培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
－
－
A.甲培养基适于分离自养型自生固氮菌；乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
B．甲培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
C．甲培养基适于分离酵母菌；乙培养基适于分离真菌
D．甲培养基适于分离自养型共生固氮菌；乙培养基适于分离异养型共生固氮菌
B [固氮菌中能独立生存的是自生固氮菌，甲培养基中含有的葡萄糖和淀粉是有机物，由此推出该培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基中不含有机碳源，所以可用来分离自养型自生固氮菌。]
13．将相等数量的硝化细菌和大肠杆菌分别接种到含铵盐的无机盐培养液中，在适宜温度下振荡培养。若用虚线表示大肠杆菌的生长趋势，实线表示硝化细菌的生长趋势，则下图中能正确表示两种菌体生长趋势的是( )
C [硝化细菌是自养生物，可以利用培养液中的无机盐、水及大气中的CO2，通过化能合成作用合成有机物以维持生命活动，由于空间、营养等条件是有限的，其种群数量呈“S”型增长；大肠杆菌属于异养生物，必须消耗现成的有机物才能维持正常的生命活动，故在只含无机盐的培养液中不能生存，其数量是逐渐减少的，C表示大肠杆菌和硝化细菌的生长曲线正确。]
14．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类、数量繁多，某生物小组试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如下图所示。请分析回答：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·
7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10 g
1 g
15 g
(1)培养基中加入尿素的目的是筛选________，这种培养基属于________培养基。
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的________和________，实验中需要振荡培养，目的是________________________________。
(3)转到固体培养基上时，常采用________法接种，获得单个菌落后继续筛选。
(4)下列材料或用具中，需要灭菌的是________；需要消毒的是________(填序号)。
①培养细菌用的培养基与培养皿 ②玻璃棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手
[解析] (1)培养基中加入尿素为唯一氮源能够筛选出能分解尿素的细菌，此培养基属于选择培养基。(2)尿素为“目的菌”提供氮源，葡萄糖为“目的菌”提供碳源。振荡培养基可溶入氧气，为培养的目的菌提供必需的氧气。
[答案] (1)目的菌 选择 (2)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (3)涂布平板(或平板划线)
(4)①② ③
15．一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行________处理。
(2)要在长期使用该除草剂的土壤中分离出目的菌，从物理性质、用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是___________________________________。
(3)在划线培养时，只有很少的菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是________________________或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在固体培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的氮源主要是________，有透明圈菌落利用的氮源主要是________，据此可筛选出目的菌。实验结果如图显示的A～E五种菌株中，________是最理想菌株。
(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：
接种的
菌种
一般培养基
实验处理及结果
A
不生长
添加营养物质甲，能生长
B
不生长
添加营养物质乙，能生长
A＋B
能生长
不添加营养物质甲、乙都能生长
突变株A不能在一般培养基上生长的原因是________________________。突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是______________________________
______________________________________________________。
[解析] (1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。(2)从物理性质方面来看，题图中的培养基属于固体培养基；从用途方面来看，该培养基属于选择培养基。该除草剂为含氮有机化合物，降解该除草剂的细菌可以该除草剂为氮源。故该培养基中除加入除草剂外，不能再含有其他氮源，以选择出能降解该除草剂的细菌。(3)在以该除草剂为唯一氮源的培养基上，不能降解该除草剂的细菌(除具有固氮能力的细菌外)是不能生长的。(4)含一定量该除草剂的培养基不透明，形成透明圈是该除草剂被某些细菌降解的结果。(5)突变株A的生长依赖于营养物质甲，突变株B的生长依赖于营养物质乙。不添加营养物质甲和乙，二者混合培养时都能生长，最可能的原因是突变株A为突变株B提供了营养物质乙，突变株B为突变株A提供了营养物质甲。
[答案] (1)稀释 (2)在无氮固体培养基中添加了该除草剂 (3)培养基中缺少这些细菌可利用的氮源 (4)氮气 该除草剂 E (5)突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶 突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供
