第二节 分子生物学技术
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明目标、知重点难点
尝试PCR(多聚酶链式反应)技术的基本操作。(重、难点)
体验PCR这一常规分子生物学实验方法。(难点)
理解PCR的原理，讨论PCR技术的应用。(重点)
[学生用书P56])
一、阅读教材P83分析使用PCR仪的安全措施
1．严禁在PCR仪运行过程中打开池盖，否则会造成仪器的永久损坏。
2．仪器运行时，样品池及池盖内表面温度较高，当心灼伤。
3．仪器运行时，加热器内腔为高温、高压环境，严禁触及。
4．仪器运行过程中如果发出尖锐的刺刮声音，请立刻停止运行，检查是否有微量离心管断裂等故障。
5．仪器运行过程中如果没有反应，请切断电源，进行检查。
6．必须保持样品池内部的清洁，可用蘸有体积分数为95%的酒精棉签擦拭相关部位。
7．仪器必须放置在PCR实验室里，操作者在操作的时候必须遵循PCR实验室的相关规定，做好穿防护服、戴防护手套等相关防护措施。
8．当仪器接通电源后，打开外壳或移走部件可能会造成人员伤害，因此，在进行任何调整、替换、保养或维修之前，请切断所有的电源。
二、阅读教材P84完成多聚酶链式反应程序
1．物质准备：向离心管中加入模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。
2．变性：在 94 ℃高温下，作为模板的双链DNA解旋为单链DNA。
3．退火(复性)：反应体系的温度降至 55 ℃，引物与单链DNA上的特定部位相互配对。
4．延伸：反应体系的温度回升到 72 ℃左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。
三、阅读P85～87分析目的DNA片段的体外扩增与鉴定
1．DNA片段的PCR扩增
(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2 mL PCR微量离心管等。
(2)在0.2 mL PCR微量离心管中加入 5_μL_10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 μL，1_μL模板DNA，5_μL引物1和5 μL引物2，29_μL双蒸水。
(3)煮沸 5_min之后冰浴 2_min，低速离心，按照1单位/μL加入TaqDNA聚合酶。
(4)扩增DNA片断的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在 94_℃的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94_℃，30_s→55_℃，30_s→72_℃，1_min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为 72_℃，1_min。
(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。
2．DNA分子的测定
(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。
(2)条件：在沸水浴中加热。
(3)现象：出现蓝色现象。
判一判
(1)DNA扩增的变性过程中需要DNA解旋酶的参与。(×)
(2)DNA扩增退火过程中需要DNA聚合酶的参与。(×)
(3)DNA延伸过程需要TaqDNA聚合酶的作用。(√)
(4)所有PCR中使用的引物都是相同的。(×)
连一连
多聚酶链式反应[学生用书P57]
多聚酶链式反应技术又叫PCR技术。通过PCR技术就可以在体外对DNA的特定片段进行快速的复制，并获得大量的目的基因。结合教材P84内容完成以下探究。
探究1 结合图示理解PCR反应的过程及结果
(1)PCR反应过程
①变性：当温度上升到94 ℃左右时，双链DNA解旋为单链(如图)。
②退火：系统温度下降至55 ℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合(如下图)。
③延伸：当系统温度上升至72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链(如图)。
(2)结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
探究2 结合教材，推算PCR扩增数目的理论值
理论上DNA扩增呈指数增长，若只有一个DNA模板，则复制n次后有 2n个DNA；若一开始有m个DNA模板，则复制n次后有m×2n个DNA。
讨论解旋酶、DNA聚合酶与DNA连接酶的作用？
提示：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都可催化形成磷酸二酯键；DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′羟基上，需要模板，而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
PCR体外扩增DNA与生物体内DNA复制的比较
体内复制
PCR反应
不
同
点
解旋
在解旋酶的作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至 94 ℃左右，双链全部解开
合成子链
一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度在 72 ℃左右
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
DNA
聚合酶
需要
需要TaqDNA聚合酶
循环
次数
受生物体自身控制
30次
温度
体内温和条件
高温(可变)
产物
完整DNA
DNA片段
相同点
①需提供DNA复制的模板；
②以四种脱氧核苷酸为原料；
③都需要一定的缓冲溶液
突破1 PCR过程与细胞内的DNA复制
过程区别
1．如图表示细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增两个过程，两反应过程的条件中相同的是( )
A．模板 B．原料
C．酶 D．能量供应
解析：选B。选项A模板不同，胞内DNA复制以整个DNA分子作为模板，PCR扩增却以一段目的DNA作为模板。选项B原料相同，均以4种脱氧核苷酸为原料。选项C酶不相同，胞内DNA解旋需要解旋酶，延伸需要DNA聚合酶等；胞外PCR扩增通过高温解旋而不需要解旋酶，延伸只需热稳定的TaqDNA聚合酶。选项D能量供应不同，胞内DNA复制过程由ATP提供能量，而PCR扩增主要由外界供能。
突破2 PCR扩增的过程
2．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。据此回答下列问题：
(1)加热使DNA双链间的________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。
(3)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为变性，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94 ℃左右)、退火(40～60 ℃)、延伸(72 ℃左右)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段
的长度。(3)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
答案：(1)氢 变性 解旋
(2)两 (3)1/8
PCR扩增原理的有关拓展
(1)DNA热变性：双链DNA变性DNA。
(2)理论上DNA扩增呈指数增长，实验值要略小于理论值。实际操作过程中，由于无关变量的影响，一般来说，实验值要略小于理论值。从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物 Ⅱ 结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段序列呈指数扩增。
目的DNA片段的体外扩增与测定[学生用书P58]
目的DNA片段的PCR扩增是在PCR仪中进行。结合教材P85～87内容完成以下探究。
探究1 完善下列步骤，学会目的DNA片段
的体外扩增的操作过程
探究2 观察下图示意图，理解DNA复制
过程
由此可见，在PCR反应中，DNA聚合酶从引物的 3′端开始延伸DNA链，所以DNA的合成方向总是从子链的 5′端向 3′端延伸。
探究3 结合教材，完成DNA分子的测定
(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶于100 mL冰醋酸中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2 %的乙醛溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。
(2)取一定量的扩增前和扩增后的溶液分别放入两支试管中，加入等量的二苯胺试剂，混匀后观察溶液的颜色。用沸水浴加热上述溶液。在加热过程中，随时注意试管中溶液颜色的变化。
(3)根据蓝色的深浅，可以粗略地比较扩增前和扩增后溶液中DNA的含量是否有变化。
(1)试概括PCR技术原理。
提示：在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似。PCR技术利用了DNA的热变性原理。
(2)如何判断DNA片段的扩增是否成功？
提示：既可用二苯胺试剂来粗略的比较扩增前和扩增后DNA含量的变化，也可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。
1．DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。PCR中，引物长度通常为20～30个核苷酸。
2．当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到55 ℃左右时，引物与模板可结合，一般不需要考虑解开的两个DNA模板链的重新结合，原因是：①模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合；②引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会；③加入的引物的量足够大，而模板链数量少。
3．实验操作的注意事项
(1)PCR所用的缓冲液配制一定要严格，或者直接购买专用扩增缓冲液。
(2)为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头必须更换。
(4)PCR实验中应注意各种反应成分的用量，用量不当、漏加成分、PCR程序设置不当等，均有可能导致DNA片段扩增的失败。
(5)PCR扩增的是位于两种引物之间的DNA片段，合理设计引物是PCR成功的关键。
突破1 PCR实验操作
1．PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是( )
A．反复洗涤 B．用酒精擦洗
C．高压灭菌 D．在－20 ℃储存
解析：选C。为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存。使用前，将所需的试剂从冰箱内拿出，放在冰块上缓慢融化。
突破2 DNA分子的测定
2．在DNA鉴定过程中加入的试剂是( )
A．双缩脲试剂 B．斐林试剂
C．二苯胺试剂 D．甲基绿
解析：选C。双缩脲试剂鉴定蛋白质生成紫色，A错误；斐林试剂鉴定还原性糖生成砖红色，B错误；二苯胺试剂鉴定DNA生成蓝色，C正确；甲基绿鉴定细胞中DNA的分布，生成绿色，D错误。
核心知识小结
[网络构建]
[关键语句]
多聚酶链式反应，简称PCR，是一种在体外快速扩增目的基因或DNA序列的技术。
PCR扩增过程中要进行无菌操作，避免污染，且向离心管中加入模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸以及TaqDNA聚合酶。
变性是在94 ℃高温下使模板双链DNA解旋。
退火是将反应体系温度降至55 ℃，使引物与模板DNA链配对。
延伸是将反应体系温度回升至72 ℃左右，在TaqDNA聚合酶作用下，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。
DNA分子的测定：DNA分子＋二苯胺试剂蓝色物质。
[随堂检测] [学生用书P59]
知识点一 多聚酶链式反应程序
1. 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历30多次下述循环：90～95 ℃下使模板DNA变性、解链→55～60 ℃下退火(引物与DNA模板链结合)→70～75 ℃下引物链延伸。下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是( )
A．变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
C．退火过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
解析：选B。变性过程的目的是解链，与解旋酶的作用相同，所以变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A项正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，该过程需要热稳定TaqDNA聚合酶，且由于该过程的产物是DNA，所以需要的原料是四种游离的脱氧核苷酸，故B项错误；退火过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C项正确；PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，D项正确。
2．下图是PCR反应过程中哪次循环的产物( )
A．第一次循环
B．第二次循环
C．第三次循环
D．第四次循环
解析：选A。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子代DNA中只有一种引物。
知识点二 目的DNA片段的体外扩增与鉴定
3．下列关于DNA双链的叙述，错误的是( )
A．通常将DNA的羟基末端称为5′端，而磷酸基团末端称为3′端
B．通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团末端称为5′端
C．通常DNA只能从3′端延伸DNA链
D．通常DNA不能从5′端延伸DNA链
解析：选A。通常将DNA的羟基末端称为3′端，磷酸基团末端称为5′端。
4．下列关于操作过程的叙述中，错误的是( )
A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C．PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换
解析：选C。为避免外源DNA等因素污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确。PCR缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，B正确，C错误。微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换，以免其他成分污染，D正确。
5．DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( )
A．砖红色 B．橘黄色
C．紫色 D．蓝色
解析：选D。DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，D正确。还原糖与斐林试剂水浴加热生成砖红色沉淀，A错误。脂肪被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，B错误。蛋白质与双缩脲试剂生成紫色化合物，C错误。
6．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。回答以下问题：
(1)细胞内DNA复制过程中，引物的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
而且DNA复制的前提是________。
(2)PCR利用了________原理，可通过控制温度来控制双链的解旋与结合。
(3)PCR技术用到的酶是________________，与细胞内DNA复制时发挥相同作用的酶相比区别在于______________________。
(4)下面表格是DNA体内复制与PCR反应的部分比较结果。通过比较分析，请推导出PCR反应合成DNA子链时能量来源于_____________________________________________________。
原料
ATP
DNA体
内复制
四种脱氧核苷酸
需要
PCR反应
脱氧胞苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸
脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸
不需要
(5)假如PCR反应所用的引物含有放射性、模板不具有放射性，且引物不被切除，则经过n次循环，具有放射性的脱氧核苷酸链占总链数的比值为________________________________________________________________________。
解析：(1)DNA具有双螺旋结构，复制时遵循碱基互补配对原则，所以打开氢键，DNA聚合酶方可在引物的引导下从引物3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR技术就是模拟细胞内DNA复制的一项技术，只不过该技术中双链的解旋与结合是通过温度来控制的，原因在于DNA具有热变性。(3)TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性。(4)DNA无论是体内复制还是体外复制，子链合成过程中都要消耗能量，而PCR反应不加入ATP供能，且加入的原料也不是四种脱氧核苷酸，可见PCR所用原料在水解成相应脱氧核苷酸时，能释放出等同于ATP水解的能量。(5)DNA复制n次产生2n个DNA，共有2n＋1条脱氧核苷酸链，由于母链不具有放射性，所以具有放射性的脱氧核苷酸链占总链数的比值为＝＝。
答案：(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解开双链(或打开氢键)
(2)DNA的热变性
(3)Taq DNA聚合酶 耐高温
(4)所用原料水解产生相应脱氧核苷酸时所释放的能量
(5)
[课时作业] [学生用书P95(单独成册)]
一、选择题
1．TaqDNA聚合酶的特点是( )
A．耐高温 B．耐盐酸
C．耐强碱 D．不耐热
解析：选A。TaqDNA聚合酶的特点是耐高温。
2．标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步所需的温度依次是( )
A．94 ℃、55 ℃、72 ℃
B．72 ℃、55 ℃、92 ℃
C．55 ℃、92 ℃、72 ℃
D．80 ℃、55 ℃、72 ℃
解析：选A。当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单链，称之为变性；当温度下降到55 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升至72 ℃时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
3．有关DNA聚合酶与RNA聚合酶的说法，不正确的是( )
A．均以DNA的两条链作为模板
B．均可催化形成磷酸二酯键
C．均以氨基酸作为基本组成单位
D．催化生成的产物不相同
解析：选A。DNA聚合酶催化合成DNA时，以DNA分子的两条链为模板；RNA聚合酶催化转录合成mRNA时，以DNA分子的一条链为模板，A错误；由于磷酸与五碳糖是通过磷酸二酯键相连，所以DNA聚合酶与RNA聚合酶都是通过形成磷酸二酯键逐个连接上核苷酸，B正确；DNA聚合酶与RNA聚合酶的本质为蛋白质，都以氨基酸作为基本组成单位，C正确；DNA聚合酶催化合成DNA，RNA聚合酶催化转录合成mRNA，D正确。
4．下列哪项不是多聚酶链式反应(PCR)扩增DNA片段的必需条件( )
A．模板DNA片段和四种游离脱氧核苷酸
B．核糖体和DNA解旋酶
C．耐热的DNA聚合酶和引物
D．适宜pH的缓冲液和自动温度控制仪器
解析：选B。PCR反应需要在一定缓冲液中进行，另外，还需提供：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、自动温度控制仪器。通过控制温度使DNA复制在体外进行。
5．假设PCR反应中，只有一个双链DNA片段作为模板，在5次循环后，反应物中大约有多少个这样的DNA片段( )
A．8 B．16
C．32 D．64
解析：选C。PCR反应中，DNA呈指数式增加，为2n，故5次循环后，会产生25即32个DNA片段。
6．下列有关PCR的描述，正确的是( )
①是一种酶促反应 ②利用DNA的热变性原理 ③引物决定了扩增的特异性 ④扩增片段一般以2n的方式积累 ⑤扩增对象是氨基酸序列
A．①②③ B．①③④⑤
C．①②③④ D．②③④⑤
解析：选C。PCR是一种体外扩增DNA的技术，是一种酶促反应，利用了DNA的热变性原理，引物决定了扩增的特异性，扩增片段一般以2n的方式积累，C正确。
7．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
解析：选C。PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA，长度通常为15～40个核苷酸；PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
8．多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
解析：选C。PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。
9．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
解析：选B。①过程为逆转录过程，故催化①过程的酶是逆转录酶，A错误；④为退火过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，B正确；催化②过程(DNA复制)需要的酶是DNA聚合酶，催化⑤过程(延伸)的酶是耐高温DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶，C错误；根据碱基互补配对原则A—T，U—A，如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与T之和也占该DNA碱基含量的40%，而DNA分子中不含碱基U，D错误。
10．退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括( )
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
D．加入引物的量足够多而模板链数量少
解析：选C。退火的原理是碱基互补配对，解旋后DNA分子变成单链，碱基序列未发生改变，冷却后仍可以进行退火，C项错误。
11．某考古学家在西伯利亚泰加林地区的冰中，发现了一种冰冻的已灭绝的巨大动物的肌肉。他想了解该巨型动物的DNA与现今印度大象的DNA的相似性，于是做了如下检测工作，其中正确的操作步骤及顺序是( )
①降低温度，检测处理后形成的杂合DNA双链区段
②通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA
③把巨型动物的DNA导入大象的细胞中
④在一定的温度条件下，将巨型动物和大象的DNA水浴共热
A．②④③ B．②④③①
C．③④① D．②④①
解析：选D。要想对比两个DNA分子的相似性，首先需要有足够的样本，所以先扩增；然后在一定温度下，使其变性，解成单链；再降低温度，检测杂合DNA双链区段。
12．下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是( )
A．片段a、b、c的长度均相同
B．片段a、b只是第一次循环的产物
C．片段c最早出现在第二次循环的产物中
D．经过30次循环后，片段c的数量为230
解析：选C。图中片段a、b只有一种引物，是以原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这也包括图中的片段a、b，故D项不正确。
二、非选择题
13．PCR是一种DNA体外扩增技术，被广泛应用于基因扩增和DNA序列测定。如图是PCR技术示意图，请回答下列问题：
(1)标准的PCR过程一般分为__________、__________、__________三大步骤。
(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段________。
(3)将双链DNA________，使之变性，从而导致______________________。
(4)引物延伸需提供________________作为原料。
解析：(1)标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是94 ℃、55 ℃、72 ℃。(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一段单链DNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。(3)在PCR反应过程中，当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单链。(4)当系统温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
答案：(1)变性 退火 延伸
(2)单链DNA
(3)加热到94 ℃ 双链DNA解旋成两条单链
(4)4种脱氧核苷酸
14．美国科学家穆里斯发明了PCR技术，它是一种DNA“复印机”，可以在数小时内，将一个DNA复制出1 000亿个，解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，PCR技术使每个核苷酸的识别成本降低至5～10美元，他因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖。请回答下列问题：
(1)在DNA扩增时，需要大量的____________________作为原料，在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下，以解旋后的单链为____________进行生物合成。
(2)PCR技术中，DNA分子解旋时，必须加热，普通的酶容易________________________，科学家从温泉中找到了耐95 ℃高温的________________________，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。
(3)耐高温酶的发现应用说明了地球生物________的重要，大自然的________库是人类的宝贵财富。
解析：(1)体外扩增DNA时，与体内DNA复制需要的原料相同，即四种游离的脱氧核苷酸；同时还需要母链解旋后的单链为模板等。(2)PCR技术中一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸，在DNA复制过程中需要较高的温度，所以需要耐高温的TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶是科学家从温泉中找到的，能够耐95 ℃高温。(3)耐高温酶的发现应用也说明了地球上生物多样性中基因多样性的重要作用，体现了保护生物多样性的重要意义。
答案：(1)脱氧核苷酸 模板
(2)变性(失活) TaqDNA聚合酶
(3)多样性 基因
15．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA，PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图，图中加粗线段代表引物)。在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。据此回答下列问题：
(1)图中的变性、延伸分别是指________________________________________________________________________、
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)假设PCR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为N1，第二轮的产物4个子代DNA为N2，N1、N2中含有模板DNA单链的DNA分别有________个、________个。若继续循环，该DNA片段共经过30次循环后能形成________个DNA片段。
(3)某样品DNA分子中引物之间的序列共含3 000个碱基对，碱基数量满足：＝，若经5次循环，至少需要向试管中加入______个腺嘌呤脱氧核苷酸(不考虑引物所对应的片段)。
解析：(1)PCR技术中DNA变性是指作为模板的TaqDNA双链解旋形成单链。延伸是指在TaqDNA聚合酶的作用下，原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链。
(2)因DNA为半保留复制方式，不管复制几次，子代中始终有2个DNA含有模板DNA单链。DNA复制子代以指数式2n增长，n＝复制次数，故复制30次形成230个DNA片段。
(3)在双链DNA分子中，A＝T，G＝C，由＝推出A/C＝，C＝2A ①；A＋C＝碱基总数 ②，将①式代入②得：A＝1 000。1个DNA分子复制5次，增加了25－1＝31个DNA，故至少需要1 000×31＝31 000个腺嘌呤脱氧核苷酸。
答案：(1)模板DNA双链解旋形成单链 在TaqDNA聚合酶的作用下，原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链
(2)2 2 230
(3)31 000
16．在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
____________________ ____________________
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：________________________________________________________________________
____________________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________________________________________________________________________。
(4)PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用DNA的________原理解决了这个问题。
(5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________________。
解析：(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH。(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA分子中各有一条链含32P，若复制n次，共产生单链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2/(2n×2)＝。(4)DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。(5)DNA中杂质蛋白的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。
答案：(1)5′—G—A—OH
(2)3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′
5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P
(4)DNA解旋 热变性
(5)蛋白酶
[随堂检测] [学生用书P59]
知识点一 多聚酶链式反应程序
1. 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历30多次下述循环：90～95 ℃下使模板DNA变性、解链→55～60 ℃下退火(引物与DNA模板链结合)→70～75 ℃下引物链延伸。下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是( )
A．变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
C．退火过程中引物与DNA模板链的结合依靠碱基互补配对原则完成
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
解析：选B。变性过程的目的是解链，与解旋酶的作用相同，所以变性过程中被切断的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A项正确；PCR技术是在较高温度条件下进行的，该过程需要热稳定TaqDNA聚合酶，且由于该过程的产物是DNA，所以需要的原料是四种游离的脱氧核苷酸，故B项错误；退火过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的，C项正确；PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，D项正确。
2．下图是PCR反应过程中哪次循环的产物( )
A．第一次循环
B．第二次循环
C．第三次循环
D．第四次循环
解析：选A。在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的每个子代DNA中只有一种引物。
知识点二 目的DNA片段的体外扩增与鉴定
3．下列关于DNA双链的叙述，错误的是( )
A．通常将DNA的羟基末端称为5′端，而磷酸基团末端称为3′端
B．通常将DNA的羟基末端称为3′端，而磷酸基团末端称为5′端
C．通常DNA只能从3′端延伸DNA链
D．通常DNA不能从5′端延伸DNA链
解析：选A。通常将DNA的羟基末端称为3′端，磷酸基团末端称为5′端。
4．下列关于操作过程的叙述中，错误的是( )
A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存
C．PCR所用缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换
解析：选C。为避免外源DNA等因素污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌，A正确。PCR缓冲液和酶应分装成小份，在－20 ℃储存，使用前，将所需试剂从冰箱取出，放在冰块上缓慢融化，B正确，C错误。微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换，以免其他成分污染，D正确。
5．DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( )
A．砖红色 B．橘黄色
C．紫色 D．蓝色
解析：选D。DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成蓝色，D正确。还原糖与斐林试剂水浴加热生成砖红色沉淀，A错误。脂肪被苏丹Ⅲ染液染成橘黄色，B错误。蛋白质与双缩脲试剂生成紫色化合物，C错误。
6．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。回答以下问题：
(1)细胞内DNA复制过程中，引物的作用是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________，
而且DNA复制的前提是________。
(2)PCR利用了________原理，可通过控制温度来控制双链的解旋与结合。
(3)PCR技术用到的酶是________________，与细胞内DNA复制时发挥相同作用的酶相比区别在于______________________。
(4)下面表格是DNA体内复制与PCR反应的部分比较结果。通过比较分析，请推导出PCR反应合成DNA子链时能量来源于_____________________________________________________。
原料
ATP
DNA体
内复制
四种脱氧核苷酸
需要
PCR反应
脱氧胞苷三磷酸、脱氧腺苷三磷酸
脱氧胸苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸
不需要
(5)假如PCR反应所用的引物含有放射性、模板不具有放射性，且引物不被切除，则经过n次循环，具有放射性的脱氧核苷酸链占总链数的比值为________________________________________________________________________。
解析：(1)DNA具有双螺旋结构，复制时遵循碱基互补配对原则，所以打开氢键，DNA聚合酶方可在引物的引导下从引物3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR技术就是模拟细胞内DNA复制的一项技术，只不过该技术中双链的解旋与结合是通过温度来控制的，原因在于DNA具有热变性。(3)TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性。(4)DNA无论是体内复制还是体外复制，子链合成过程中都要消耗能量，而PCR反应不加入ATP供能，且加入的原料也不是四种脱氧核苷酸，可见PCR所用原料在水解成相应脱氧核苷酸时，能释放出等同于ATP水解的能量。(5)DNA复制n次产生2n个DNA，共有2n＋1条脱氧核苷酸链，由于母链不具有放射性，所以具有放射性的脱氧核苷酸链占总链数的比值为＝＝。
答案：(1)使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 解开双链(或打开氢键)
(2)DNA的热变性
(3)Taq DNA聚合酶 耐高温
(4)所用原料水解产生相应脱氧核苷酸时所释放的能量
(5)
[课时作业] [学生用书P95(单独成册)]
一、选择题
1．TaqDNA聚合酶的特点是( )
A．耐高温 B．耐盐酸
C．耐强碱 D．不耐热
解析：选A。TaqDNA聚合酶的特点是耐高温。
2．标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步所需的温度依次是( )
A．94 ℃、55 ℃、72 ℃
B．72 ℃、55 ℃、92 ℃
C．55 ℃、92 ℃、72 ℃
D．80 ℃、55 ℃、72 ℃
解析：选A。当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单链，称之为变性；当温度下降到55 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；当温度上升至72 ℃时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
3．有关DNA聚合酶与RNA聚合酶的说法，不正确的是( )
A．均以DNA的两条链作为模板
B．均可催化形成磷酸二酯键
C．均以氨基酸作为基本组成单位
D．催化生成的产物不相同
解析：选A。DNA聚合酶催化合成DNA时，以DNA分子的两条链为模板；RNA聚合酶催化转录合成mRNA时，以DNA分子的一条链为模板，A错误；由于磷酸与五碳糖是通过磷酸二酯键相连，所以DNA聚合酶与RNA聚合酶都是通过形成磷酸二酯键逐个连接上核苷酸，B正确；DNA聚合酶与RNA聚合酶的本质为蛋白质，都以氨基酸作为基本组成单位，C正确；DNA聚合酶催化合成DNA，RNA聚合酶催化转录合成mRNA，D正确。
4．下列哪项不是多聚酶链式反应(PCR)扩增DNA片段的必需条件( )
A．模板DNA片段和四种游离脱氧核苷酸
B．核糖体和DNA解旋酶
C．耐热的DNA聚合酶和引物
D．适宜pH的缓冲液和自动温度控制仪器
解析：选B。PCR反应需要在一定缓冲液中进行，另外，还需提供：DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶、自动温度控制仪器。通过控制温度使DNA复制在体外进行。
5．假设PCR反应中，只有一个双链DNA片段作为模板，在5次循环后，反应物中大约有多少个这样的DNA片段( )
A．8 B．16
C．32 D．64
解析：选C。PCR反应中，DNA呈指数式增加，为2n，故5次循环后，会产生25即32个DNA片段。
6．下列有关PCR的描述，正确的是( )
①是一种酶促反应 ②利用DNA的热变性原理 ③引物决定了扩增的特异性 ④扩增片段一般以2n的方式积累 ⑤扩增对象是氨基酸序列
A．①②③ B．①③④⑤
C．①②③④ D．②③④⑤
解析：选C。PCR是一种体外扩增DNA的技术，是一种酶促反应，利用了DNA的热变性原理，引物决定了扩增的特异性，扩增片段一般以2n的方式积累，C正确。
7．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④ B．①②
C．①③ D．②④
解析：选C。PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA，长度通常为15～40个核苷酸；PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
8．多聚酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
解析：选C。PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸而不是核糖核苷酸。
9．以下为形成cDNA过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
解析：选B。①过程为逆转录过程，故催化①过程的酶是逆转录酶，A错误；④为退火过程，发生的变化是引物与互补DNA链结合，B正确；催化②过程(DNA复制)需要的酶是DNA聚合酶，催化⑤过程(延伸)的酶是耐高温DNA聚合酶——TaqDNA聚合酶，C错误；根据碱基互补配对原则A—T，U—A，如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与T之和也占该DNA碱基含量的40%，而DNA分子中不含碱基U，D错误。
10．退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40～60 ℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括( )
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
D．加入引物的量足够多而模板链数量少
解析：选C。退火的原理是碱基互补配对，解旋后DNA分子变成单链，碱基序列未发生改变，冷却后仍可以进行退火，C项错误。
11．某考古学家在西伯利亚泰加林地区的冰中，发现了一种冰冻的已灭绝的巨大动物的肌肉。他想了解该巨型动物的DNA与现今印度大象的DNA的相似性，于是做了如下检测工作，其中正确的操作步骤及顺序是( )
①降低温度，检测处理后形成的杂合DNA双链区段
②通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA
③把巨型动物的DNA导入大象的细胞中
④在一定的温度条件下，将巨型动物和大象的DNA水浴共热
A．②④③ B．②④③①
C．③④① D．②④①
解析：选D。要想对比两个DNA分子的相似性，首先需要有足够的样本，所以先扩增；然后在一定温度下，使其变性，解成单链；再降低温度，检测杂合DNA双链区段。
12．下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是( )
A．片段a、b、c的长度均相同
B．片段a、b只是第一次循环的产物
C．片段c最早出现在第二次循环的产物中
D．经过30次循环后，片段c的数量为230
解析：选C。图中片段a、b只有一种引物，是以原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环的产物中，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这也包括图中的片段a、b，故D项不正确。
二、非选择题
13．PCR是一种DNA体外扩增技术，被广泛应用于基因扩增和DNA序列测定。如图是PCR技术示意图，请回答下列问题：
(1)标准的PCR过程一般分为__________、__________、__________三大步骤。
(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一小段________。
(3)将双链DNA________，使之变性，从而导致______________________。
(4)引物延伸需提供________________作为原料。
解析：(1)标准的PCR过程一般分为变性、退火、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是94 ℃、55 ℃、72 ℃。(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上说，引物是一段单链DNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。(3)在PCR反应过程中，当温度上升到94 ℃时，双链DNA解旋为单链。(4)当系统温度上升到72 ℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)在TaqDNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
答案：(1)变性 退火 延伸
(2)单链DNA
(3)加热到94 ℃ 双链DNA解旋成两条单链
(4)4种脱氧核苷酸
14．美国科学家穆里斯发明了PCR技术，它是一种DNA“复印机”，可以在数小时内，将一个DNA复制出1 000亿个，解决了检测样本扩增的难题。在人类基因组计划实施中，PCR技术使每个核苷酸的识别成本降低至5～10美元，他因发明PCR技术而荣获了诺贝尔奖。请回答下列问题：
(1)在DNA扩增时，需要大量的____________________作为原料，在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下，以解旋后的单链为____________进行生物合成。
(2)PCR技术中，DNA分子解旋时，必须加热，普通的酶容易________________________，科学家从温泉中找到了耐95 ℃高温的________________________，解决了酶重复使用的难题，使链式反应成为可能。
(3)耐高温酶的发现应用说明了地球生物________的重要，大自然的________库是人类的宝贵财富。
解析：(1)体外扩增DNA时，与体内DNA复制需要的原料相同，即四种游离的脱氧核苷酸；同时还需要母链解旋后的单链为模板等。(2)PCR技术中一般要经历三十多次循环，每次循环可以分为变性、复性和延伸，在DNA复制过程中需要较高的温度，所以需要耐高温的TaqDNA聚合酶。TaqDNA聚合酶是科学家从温泉中找到的，能够耐95 ℃高温。(3)耐高温酶的发现应用也说明了地球上生物多样性中基因多样性的重要作用，体现了保护生物多样性的重要意义。
答案：(1)脱氧核苷酸 模板
(2)变性(失活) TaqDNA聚合酶
(3)多样性 基因
15．在进行DNA亲子鉴定时，需大量的DNA，PCR技术(多聚酶链式反应)可以使样品DNA扩增，获得大量DNA克隆分子。该技术的原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图，图中加粗线段代表引物)。在很短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体。据此回答下列问题：
(1)图中的变性、延伸分别是指________________________________________________________________________、
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)假设PCR反应中的DNA模板为P，第一轮循环的产物2个子代DNA为N1，第二轮的产物4个子代DNA为N2，N1、N2中含有模板DNA单链的DNA分别有________个、________个。若继续循环，该DNA片段共经过30次循环后能形成________个DNA片段。
(3)某样品DNA分子中引物之间的序列共含3 000个碱基对，碱基数量满足：＝，若经5次循环，至少需要向试管中加入______个腺嘌呤脱氧核苷酸(不考虑引物所对应的片段)。
解析：(1)PCR技术中DNA变性是指作为模板的TaqDNA双链解旋形成单链。延伸是指在TaqDNA聚合酶的作用下，原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链。
(2)因DNA为半保留复制方式，不管复制几次，子代中始终有2个DNA含有模板DNA单链。DNA复制子代以指数式2n增长，n＝复制次数，故复制30次形成230个DNA片段。
(3)在双链DNA分子中，A＝T，G＝C，由＝推出A/C＝，C＝2A ①；A＋C＝碱基总数 ②，将①式代入②得：A＝1 000。1个DNA分子复制5次，增加了25－1＝31个DNA，故至少需要1 000×31＝31 000个腺嘌呤脱氧核苷酸。
答案：(1)模板DNA双链解旋形成单链 在TaqDNA聚合酶的作用下，原料脱氧核苷酸聚合形成新的DNA链
(2)2 2 230
(3)31 000
16．在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
____________________ ____________________
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点：________________________________________________________________________
____________________，循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为________________________________________________________________________。
(4)PCR反应过程的前提条件是________，PCR技术利用DNA的________原理解决了这个问题。
(5)在对样品DNA进行分析的过程中发现，DNA掺杂着一些组蛋白，要去除这些组蛋白可加入的物质是________________。
解析：(1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，所以引物就提供了3′端，子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′—G—A—OH。(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA分子中各有一条链含32P，若复制n次，共产生单链2n×2，其中只有DNA母链不含32P，则其所占比例为2/(2n×2)＝。(4)DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。(5)DNA中杂质蛋白的去除，利用酶的专一性，应加入蛋白酶。
答案：(1)5′—G—A—OH
(2)3′—C—C……A—G—5′ 5′—G—G……T—C—3′
5′—G—G……T—C—3′ 3′—C—C……A—G—5′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P
(4)DNA解旋 热变性
(5)蛋白酶
课件51张PPT。第四章 生物化学与分子生物学技术实践第四章 生物化学与分子生物学技术实践池盖样品池及池盖高温、高压运行微量离心管电源清洁PCR实验室防护服防护手套所有的电源模板DNA引物TaqDNA聚合酶94 解旋55 引物72碱基互补配对DNA双链1μL5μL29μL5min2minTaqDNA聚合酶94℃94℃30s55℃30s72℃1min72℃1min冰醋酸乙醛沸水浴蓝色××√×两种引物TaqDNA聚合酶DNA序列呈指数扩增2nm×2n引物自动取液器低速947272 ↓↓↓3′5′3′二苯胺二苯胺沸水浴蓝色本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放
