第一节 生物成分的分离与测定技术
第1课时 蛋白质的分离与提取
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明目标、知重点难点
掌握电泳法分离大分子的原理。(重点)
运用常用的方法提取和分离蛋白质。(重、难点)
[学生用书P48]
一、阅读教材P71～72分析蛋白质的分离与纯化
1．生物细胞中的蛋白质提取
(1)在提取蛋白质时，可以采用研磨与超声波结合的方法将生物组织或细胞完全破碎，使蛋白质从细胞中释放出来，并使其溶解在适当的抽提液中。
(2)抽提液的选择需要根据蛋白质的特性而定，一般酸性蛋白质用偏碱性溶液抽提，碱性蛋白质用偏酸性溶液抽提，脂蛋白等则可用有机溶剂抽提。
2．蛋白质的分离方法
(1)离心沉降法：通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层。
(2)薄膜透析法：利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离的方法。
(3)凝胶色谱法
①概念：根据蛋白质分子量的大小差异对其进行有效分离的方法。
②原理
a．凝胶
b．分离的过程
进入凝胶颗粒内
部的难易程度
路程
移动速度
小分子
蛋白质
容易
较长
较慢
大分子
蛋白质
无法进入
较短
较快
(4)电泳法：将所带电荷的数量和性质不同的蛋白质从混合样品中分离并纯化出来。
二、阅读教材P73～77完成血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳及凝胶色谱法分离血红蛋白的操作
1．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳
配制试剂→准备器材→架滤纸桥→浸泡薄膜→细心点样→平悬薄膜→实施电泳→染色→漂洗→脱色。
2．凝胶色谱法分离血红蛋白
样品处理→血红蛋白的释放、分离和透析→凝胶的制备→色谱柱的装填→样品的加入→洗脱与收集。
判一判
(1)酸性蛋白质用酸性溶液抽提，水溶性蛋白质用透析液抽提，脂溶性蛋白质用稀碱性溶液抽提。(×)
(2)电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其电性相反的电极移动的过程。(√)
(3)电泳时泳动速度取决于带电颗粒的大小、形状、所带静电荷多少。(√)
(4)离心沉降法和薄膜透析法分离蛋白质的原理是一样的。(×)
(5)凝胶色谱法是根据蛋白质分子量的大小而对其进行有效分离的方法。(√)
(6)醋酸纤维薄膜电泳是采用滤纸为支持物的电泳方法。(×)
蛋白质分离技术[学生用书P49]
欲研究某种蛋白质的结构、性质和功能，需将这种蛋白质从组织细胞中分离、纯化出来。结合教材P71第三段～P74内容完成以下探究。
探究1 完善下面示意图，理解离心沉降法
分离蛋白质
(1)原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。
(2)目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质发生沉降分层，彼此分离。
探究2 仔细观察下面示意图，分析薄膜透
析法分离蛋白质
(1)原理：蛋白质分子不能透过半透膜。
(2)目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖以及氨基酸等。
(3)常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。
(4)步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。
探究3 完善下面示意图，分析凝胶色谱法
分离蛋白质
(1)大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙移动，洗脱路程较短，移动速度较快，最先流出柱外。
(2)小分子蛋白质可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，洗脱路程较长，移动速度缓慢，以致需要较长时间才能流出柱外。
1．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的是( )
A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质
C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析：选A。蛋白质分子不能通过半透膜，但溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离，A项错误；电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现蛋白质分子的分离，B项正确；凝胶色谱法的原理是：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快，而分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢，所以可以根据蛋白质相对分子质量的大小，通过凝胶色谱法使大分子的蛋白质先洗脱出来，小分子的蛋白质后洗脱出来，从而实现蛋白质分子的分离，C项正确；根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的蛋白质分子位于不同层次的离心液中，从而实现蛋白质的分离，D项正确。
2．下列有关蛋白质提取和分离的说法，错误的是( )
A．透析法分离蛋白质的原理是利用蛋白质不能通过半透膜的特性
B．采用透析法使蛋白质与其他小分子化合物分离开来
C．离心沉降法通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离
D．蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相同的电极方向移动
解析：选D。蛋白质是生物大分子，不能通过半透膜，而其他小分子可以通过半透膜，可以利用半透膜进行分离得到蛋白质，A、B正确。分子大小、密度不同的蛋白质其离心速率不同，通过控制离心速率使分子大小、密度不同的蛋白质分离，C正确。蛋白质在电场中可以向与其自身所带电荷电性相反的电极方向移动，D错。
血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳[学生用书P50]
结合教材，完善下表，理解血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳。
实验步骤
操作方法
配制试剂
↓
配制巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液
准备器材
↓
醋酸纤维薄膜、常压电泳仪、点样器等
架滤纸桥
↓
取双层滤纸条，一端与支架前沿对齐，另一端浸入电泳槽的缓冲液中，待滤纸条湿润后，驱除气泡，使滤纸紧贴于支架上
浸泡薄膜
↓
用镊子夹取醋酸纤维薄膜，识别出光泽面，并在光泽面的一角用笔做上记号，然后放在巴比妥缓冲液中浸泡20 min
细心点样
↓
取出薄膜，吸去多余液体，平铺在玻璃板上，有记号的一面朝下，点样时将盖玻片在血清中蘸一下，在薄膜一端 2_cm处轻轻按下，点上细条状的血清样品，随即提起
平悬薄膜
↓
将点样端平贴在电泳槽负极支架的滤纸桥上，有记号的一面朝上，另一端平贴于正极，呈绷直状态
实施电泳
↓
盖上电泳槽盖，在醋酸纤维薄膜平衡约10 min 后接通电源，电泳 60～90 min
染色
↓
取下薄膜，放入染色液中浸泡5～10 min
漂洗
↓
取出薄膜，在漂洗液中漂洗数次，直至蛋白质区底色脱净为止
脱色
用滤纸压平并吸干薄膜后，再浸入透明液中约5 min，取出后平贴于玻璃板上，待完全干燥后便形成透明薄膜图谱
1．电泳的泳动规律
带电颗粒直径越小、越接近于球形，所带净电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。
2．关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的几点说明
(1)薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。
(2)点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。
(3)点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
(4)点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适中，不宜过多或过少。
(5)电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。
(6)应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。
1．仔细观察下面血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳图谱，所带负电荷少的球蛋白是( )
A．α1-球蛋白 B．α2-球蛋白
C．β-球蛋白 D．γ-球蛋白
解析：选D。对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极，且γ-球蛋白距点样处最近，所以γ-球蛋白所带负电荷最少。
2．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的说法中，不正确的是( )
A．架滤纸桥时，待滤纸条湿润后，要驱除气泡，以便使滤纸紧贴于支架上
B．浸泡薄膜时要识别出光泽面，并做记号
C．平悬薄膜时，有记号的一面朝上
D．从染色液中取出薄膜后，用滤纸条压平并吸干，再浸入透明液中脱色
解析：选D。薄膜染色后要先放入漂洗液中漂洗直至蛋白质区底色脱净为止，然后才用透明液脱色。
凝胶色谱法分离血红蛋白[学生用书P50]
凝胶色谱法是根据蛋白质分子的大小，对其进行有效分离的方法。结合教材P75第三段～P77内容完成下列过程(以哺乳动物红细胞为例)，学会凝胶色谱法分离血红蛋白。
1．样品处理：采集血样→低速短时间离心→取红细胞，倒入烧杯＋5倍体积生理盐水搅拌→低速离心→重复3次→洗净的红细胞。
2．血红蛋白的释放、分离和透析
(1)血红蛋白的释放：红细胞＋蒸馏水＋甲苯搅拌，红细胞破裂而释放出血红蛋白。
(2)分离血红蛋白溶液：将混合液以2_000 r/min的速度离心10 min，试管中形成4层，取自上而下的第3层红色透明液体(血红蛋白水溶液)。
(3)透析：将盛有1 mL血红蛋白溶液的透析袋放入盛有物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中透析12 h。
3．凝胶的制备：将交联葡聚糖凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。
4．色谱柱的装填
固定：将层析柱垂直固定在支架上
↓
装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内
↓
洗涤平衡：用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH＝7.0)充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密
5．样品的加入
(1)加样示意图
(2)打开色谱柱下端的流出口，让凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面刚好平行，关闭出口。用滴管小心吸取1 mL样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱顶端，不能破坏凝胶面。然后，打开流出口，使样品液逐渐渗入凝胶。
6．洗脱与收集
(1)洗脱：洗脱液流速为每分钟 1_mL。
(2)收集：待红色的蛋白质接近色谱柱出口时，用试管收集洗脱液，每 5 mL收集一管，连续收集。
(1)凝胶色谱制备中严禁出现气泡，为什么？
提示：气泡会打乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
(2)用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对蛋白质的纯度鉴定时，为何仅仅取决于分子量的大小？
提示：SDS可使蛋白质分子中的二硫键还原，十二烷基硫酸根所带的负电荷使各种蛋白质—SDS复合物都带上大大超过了蛋白质分子原有的负电荷量，所以不受蛋白质原有电荷的影响。SDS与蛋白质的结合引起蛋白质构象改变，使不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，所以不受蛋白质形状的影响。故仅仅取决于蛋白质分子量的大小。
蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析
相对分子质量大
相对分子质量小
直径大小
大于凝胶颗粒空隙直径
小于凝胶颗粒空隙直径
运动方式
垂直向下运动
不规则的扩散运动
运动速度
较快
较慢
运动路程
较短
较长
洗脱次序
先从凝胶柱中洗脱出来
后从凝胶柱中洗脱出来
突破1 血红蛋白提取和分离的过程及原理
1．下列关于血红蛋白提取和分离的过程及原理叙述，正确的是( )
A．为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠
B．红细胞洗涤使用5倍体积的蒸馏水，直到离心后上清液不呈现黄色为止
C．利用0.9%的NaCl对血红蛋白溶液透析12小时，可以去除小分子杂质
D．在凝胶柱中加入蛋白样品后即可连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱和收集样品
解析：选A。为了防止血液凝固，应在采血器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠，A正确；红细胞的洗涤过程应该用生理盐水洗涤，不能用蒸馏水洗涤，B错误；将血红蛋白溶液通过透析进行粗分离时应该选用磷酸缓冲液，不是质量分数为0.9%的NaCl溶液，C错误；在凝胶柱中加入蛋白样品后要使样品完全进入凝胶层后，小心加入缓冲液到适当高度后才可连接缓冲溶液洗脱瓶进行洗脱和收集样品，D错误。
突破2 血红蛋白的提取和分离流程
2．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：
(1)实验流程中：A为__________，B为______________。凝胶色谱法的基本原理是根据相对分子质量的大小而达到蛋白质分离的有效方法。
(2)洗涤红细胞的目的是去除________。
(3)释放血红蛋白的过程中，加入的试剂是___________。
解析：样品处理过程为：红细胞的洗涤→血红蛋白的释放→分离血红蛋白溶液→透析；凝胶色谱操作过程为：凝胶色谱柱的制作→凝胶色谱柱的填充→样品的加入和洗脱。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。释放血红蛋白的过程是让红细胞吸水胀破，由于甲苯是表面活性剂的一种，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂。
答案：(1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱
(2)杂蛋白(血浆蛋白) (3)蒸馏水和甲苯
核心知识小结
[网络构建]
[关键语句]
分离与测定生物成分中蛋白质的技术包括离心沉降法、薄膜透析法和凝胶色谱法等。
离心沉降法是通过控制离心速度，使分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不同种类蛋白质的目的。
薄膜透析法是利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，使蛋白质与其他小分子化合物分离开。
凝胶色谱法是根据蛋白质分子的大小对其进行有效分离的方法。
[随堂检测] [学生用书P52]
知识点一 蛋白质分离技术
1．凝胶色谱法分离蛋白质依据的原理是( )
A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．根据蛋白质相对分子质量的大小
C．根据蛋白质所带电荷的多少
D．根据蛋白质溶解度的大小
解析：选B。凝胶色谱法是根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的一种方法。
2．下列有关透析的叙述，错误的是( )
A．用于透析的薄膜要具有选择透过性
B．透析膜是一种半透膜
C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内
D．透析膜可用于更换样品的缓冲液
解析：选A。透析膜能使小分子自由出入，大分子不能通过，具有半透性，但不具有选择性，A项错。透析过程中小分子可自由出入，因此，可用于更换样品的缓冲液，B、C、D项都正确。
3．电泳实现样品中各种蛋白质分子的分离是利用了( )
A．各种分子带电性质的差异
B．分子本身的大小不同
C．分子形状的不同
D．以上都正确
解析：选D。电泳是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
知识点二 电泳法与凝胶色谱法分离蛋白
质的过程
4．如图为凝胶色谱法分离蛋白质示意图和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图。据图分析不正确的是( )
A．在装填图甲中凝胶色谱柱时一旦发现柱内有气泡存在，就需要重装
B．图甲中大分子蛋白质因阻力大而移动慢，所以最后从层析柱中流出来
C．图乙中凝胶中加入的SDS可以使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小
D．已知凝胶中的SDS带负电，则应在电泳槽的①处接电源负极，②处接电源正极
解析：选B。在装填凝胶色谱柱时，凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在，因为气泡会影响蛋白质洗脱的次序，A正确；图甲中大分子蛋白质因不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动速度快，所以最先从层析柱中流出来，B错误；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子大小，因此图乙中凝胶中加入的SDS可以使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小，C正确；凝胶中的SDS带负电，所以电泳槽的①处接电源负极，②处接电源正极，D正确。
5．如图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质，属于在凝胶中的行进过程的是( )
解析：选B。相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，A错误；相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，C错误；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，且其路程短，移动的速度快，D错误。
6．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：
(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是________________________________________________________________________。
(2)在对样品进行处理时，主要包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是________________________________________________________________________。
(3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的________、________以及分子的形状等。
(4)图1、图2分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图2中与图1中蛋白质P对应的是________________________________________________________________________。
解析：(1)加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)透析的原理是小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过。(3)电泳时，影响蛋白质迁移速率的因素有蛋白质分子大小、带电性质及分子的形状等。(4)SDS凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质分子量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，相对分子质量相对小的，移动距离大，因此从图1的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，说明P的相对分子质量相对比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图2中的丙。
答案：(1)防止血液凝固
(2)小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过
(3)大小 带电性质
(4)丙
[课时作业] [学生用书P91(单独成册)]
一、选择题
1．下列关于蛋白质提取的说法中，不正确的是( )
A．一般用机械方法破碎生物组织
B．破碎细胞常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法
C．一般来说，酸性蛋白质要用酸性溶液抽提
D．抽提得到的蛋白质粗提取物可用离心法去除固体杂质
解析：选C。一般酸性蛋白质要用偏碱性溶液抽提。
2．离心沉降法是纯化蛋白质的方法之一，在这一过程中蛋白质会分层，这一现象与蛋白质的何种性质有关( )
A．酸碱性
B．所带电荷多少
C．分子大小和密度
D．种类
解析：选C。根据蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间在分子大小和密度上的不同，采用离心沉降法，使其分层而分离；酸碱性不同可用电泳法；所带电荷多少不同可采用电泳法等。
3．利用凝胶色谱法哪种蛋白质先洗脱出来( )
A．相对分子质量大的
B．溶解度高的
C．相对分子质量小的
D．所带电荷多的
解析：选A。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，洗脱路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙移动，洗脱路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
4．在pH＝5.12时进行电泳，下列哪种蛋白质既不向正极移动也不向负极移动( )
A．血红蛋白：pI(等电点)＝7.07
B．鱼精蛋白：pI＝12.20
C．α1-球蛋白：pI＝5.06
D．β-球蛋白：pI＝5.12
解析：选D。β-球蛋白在pH＝5.12时不带电，在电泳时既不向正极移动也不向负极移动。
5．关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是( )
A．分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来
B．抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂
C．蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质
D．蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物
解析：选C。分离纯化蛋白质之前要先让细胞中的蛋白质释放出来，A正确；提取蛋白质时，要根据蛋白质的不同特性选用不同的溶剂，B正确；对蛋白质的粗提取物离心可以除去一些固体杂质，C错误；蛋白质的粗制品是多种蛋白质的混合物，D正确。
6．下列有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是( )
A．它们都是分离蛋白质的重要方法
B．它们的原理相同
C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要
D．以上说法都正确
解析：选A。不同蛋白质的分子量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子的迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，A正确、B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，C错误。
7．下列关于蛋白质纯化方法的叙述，错误的是( )
A．纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的
B．透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同
C．通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质
D．不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质
解析：选B。透析法是利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，将蛋白质与其他小分子化合物分离开来。
8．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的说法，不正确的是( )
A．实验所用的巴比妥缓冲液的pH为8.6
B．点样是在薄膜的光泽面上进行的
C．实验后可以得到五条色带
D．整个实验最关键的步骤是点样
解析：选B。在点样时，用盖玻片在薄膜的非光泽面且离薄膜一端2 cm 处轻轻点样。
9．下图是人血清蛋白在以醋酸纤维薄膜为支持物，pH为8.6 的巴比妥缓冲液中电泳分离结果示意图，由此图不能得出的结论是( )
A．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中γ、β、α2、α1和清蛋白都带负电荷
B．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中电泳时，γ、β、α2、α1和清蛋白迁移速率不同
C．β球蛋白的相对分子质量一定比α球蛋白的相对分子质量大
D．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中γ球蛋白迁移速率最慢，清蛋白迁移速率最快
解析：选C。带电粒子在电场中迁移的速率是带电粒子带电性质、带电量、粒子大小、粒子形状共同作用的结果。
10．如图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验装置，下列叙述不正确是( )
A．用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
解析：选B。图甲装置为透析法，通过对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，A正确；图乙装置为凝胶色谱法，试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质，B错误；用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集，C正确；丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动，D正确。
11.
如图表示对某蛋白质溶液进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是( )
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其分子量大小
D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种
解析：选B。蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子量大小决定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能有两种蛋白质。
12．下列关于凝胶色谱法的原理及操作，不正确的是( )
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，最后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其空隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析：选C。凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。凝胶是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，相对分子质量较小的蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度较快，因此在洗脱过程中先分离出来。不同的凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离的分子大小也不同。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所以要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
二、非选择题
13．请根据血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验回答下列问题：
(1)实验所用的主要试剂有：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)实验所用缓冲液的pH为________，为什么？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)点样应点在薄膜的哪一面？__________，方法是：用__________在血清中蘸一下，在离薄膜一端________cm处轻轻按下，随即提起。
(4)实施电泳时，每厘米膜宽电流强度为________________________________________________________________________，
电泳时间为________________________。
解析：(1)血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验需配制的试剂有巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。(2)实验所用的缓冲液的pH为8.6，因为此时血清中的各种蛋白质都呈负电性，而且彼此电荷大小不同，便于分离。(3)在点样时，用盖玻片在膜的非光泽面且离薄膜一端2 cm处轻轻点样。(4)在实施电泳时，盖上电泳槽盖，在薄膜平衡约10 min后通上电源，调节电流强度至每厘米膜宽0.4～0.8 mA，电泳时间为60～90 min。
答案：(1)巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等
(2)8.6 在此pH下，血清中的各种蛋白质都呈负电性，而且彼此电荷大小不同，便于分离
(3)非光泽面 盖玻片 2
(4)0.4～0.8 mA 60～90 min
14.
凝胶色谱技术是20世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等相关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________。
解析：用凝胶色谱法分离各种蛋白质时，大分子蛋白质先洗脱出来，小分子蛋白质后洗脱出来。大分子蛋白质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子蛋白质可进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子蛋白质的下移速度落后于大分子蛋白质。在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；洗脱时要调节洗脱液流速，保持稳定。
答案：(1)a a的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网或尼龙纱
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
(4)相同 保持稳定
15．商品化植酸酶主要来自微生物，首先筛选出产酶的菌株，然后制备植酸酶，请根据下面的流程图回答问题：
(1)Ⅰ中的主要成分有哪些？____________________；Ⅱ中包含哪些成分？__________________。
(2)请写一种纯化得到植酸酶的方法：________________________________________________________________________；
其原理是________________________________________________________________________。
解析：植酸酶是蛋白质，属于大分子有机物，含酶的发酵液经过透析后，能够除去小分子杂质，这样就能够得到植酸酶。对于粗提取的植酸酶可以用凝胶色谱法进行提纯，由于蛋白质带有电荷，亦可用电泳法进行纯化。
答案：(1)小分子杂质 植酸酶等多种蛋白质
(2)凝胶色谱法 根据蛋白质之间分子量的大小差异进行纯化(或电泳法 根据蛋白质之间电荷、分子量的大小等差异进行纯化)
16．某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下，试回答下列有关问题：
―→→→
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度、pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________________________________________________________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是__________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以__________________________(写出一种方法)。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子____________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水；根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水胀
破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。
答案：(1)生理盐水 渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水胀破)
(2)除去样品中的小分子杂质 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液
(3)带电性质以及分子大小、形状
(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
[随堂检测] [学生用书P52]
知识点一 蛋白质分离技术
1．凝胶色谱法分离蛋白质依据的原理是( )
A．根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小
B．根据蛋白质相对分子质量的大小
C．根据蛋白质所带电荷的多少
D．根据蛋白质溶解度的大小
解析：选B。凝胶色谱法是根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质的一种方法。
2．下列有关透析的叙述，错误的是( )
A．用于透析的薄膜要具有选择透过性
B．透析膜是一种半透膜
C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内
D．透析膜可用于更换样品的缓冲液
解析：选A。透析膜能使小分子自由出入，大分子不能通过，具有半透性，但不具有选择性，A项错。透析过程中小分子可自由出入，因此，可用于更换样品的缓冲液，B、C、D项都正确。
3．电泳实现样品中各种蛋白质分子的分离是利用了( )
A．各种分子带电性质的差异
B．分子本身的大小不同
C．分子形状的不同
D．以上都正确
解析：选D。电泳是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
知识点二 电泳法与凝胶色谱法分离蛋白
质的过程
4．如图为凝胶色谱法分离蛋白质示意图和SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图。据图分析不正确的是( )
A．在装填图甲中凝胶色谱柱时一旦发现柱内有气泡存在，就需要重装
B．图甲中大分子蛋白质因阻力大而移动慢，所以最后从层析柱中流出来
C．图乙中凝胶中加入的SDS可以使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小
D．已知凝胶中的SDS带负电，则应在电泳槽的①处接电源负极，②处接电源正极
解析：选B。在装填凝胶色谱柱时，凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在，因为气泡会影响蛋白质洗脱的次序，A正确；图甲中大分子蛋白质因不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动速度快，所以最先从层析柱中流出来，B错误；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子大小，因此图乙中凝胶中加入的SDS可以使蛋白质迁移速率完全取决于分子大小，C正确；凝胶中的SDS带负电，所以电泳槽的①处接电源负极，②处接电源正极，D正确。
5．如图能正确表示相对分子质量不同的蛋白质，属于在凝胶中的行进过程的是( )
解析：选B。相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，A错误；相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程长，移动的速度慢，相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，路程短，移动的速度快，B正确；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，C错误；相对分子质量大的蛋白质不容易进入凝胶内部的通道，且其路程短，移动的速度快，D错误。
6．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：
(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是________________________________________________________________________。
(2)在对样品进行处理时，主要包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是________________________________________________________________________。
(3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的________、________以及分子的形状等。
(4)图1、图2分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图2中与图1中蛋白质P对应的是________________________________________________________________________。
解析：(1)加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)透析的原理是小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过。(3)电泳时，影响蛋白质迁移速率的因素有蛋白质分子大小、带电性质及分子的形状等。(4)SDS凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质分子量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，相对分子质量相对小的，移动距离大，因此从图1的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，说明P的相对分子质量相对比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图2中的丙。
答案：(1)防止血液凝固
(2)小分子可以自由进出透析袋(半透膜)，而大分子不能通过
(3)大小 带电性质
(4)丙
[课时作业] [学生用书P91(单独成册)]
一、选择题
1．下列关于蛋白质提取的说法中，不正确的是( )
A．一般用机械方法破碎生物组织
B．破碎细胞常用的方法有研磨法、超声波法和酶解法
C．一般来说，酸性蛋白质要用酸性溶液抽提
D．抽提得到的蛋白质粗提取物可用离心法去除固体杂质
解析：选C。一般酸性蛋白质要用偏碱性溶液抽提。
2．离心沉降法是纯化蛋白质的方法之一，在这一过程中蛋白质会分层，这一现象与蛋白质的何种性质有关( )
A．酸碱性
B．所带电荷多少
C．分子大小和密度
D．种类
解析：选C。根据蛋白质之间或蛋白质与其他分子之间在分子大小和密度上的不同，采用离心沉降法，使其分层而分离；酸碱性不同可用电泳法；所带电荷多少不同可采用电泳法等。
3．利用凝胶色谱法哪种蛋白质先洗脱出来( )
A．相对分子质量大的
B．溶解度高的
C．相对分子质量小的
D．所带电荷多的
解析：选A。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，洗脱路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙移动，洗脱路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
4．在pH＝5.12时进行电泳，下列哪种蛋白质既不向正极移动也不向负极移动( )
A．血红蛋白：pI(等电点)＝7.07
B．鱼精蛋白：pI＝12.20
C．α1-球蛋白：pI＝5.06
D．β-球蛋白：pI＝5.12
解析：选D。β-球蛋白在pH＝5.12时不带电，在电泳时既不向正极移动也不向负极移动。
5．关于蛋白质提取的叙述中，不正确的是( )
A．分离与纯化蛋白质之前首先要用适当的方法使蛋白质释放出来
B．抽提时要依据蛋白质的不同特性选择不同的溶剂
C．蛋白质的粗提取物离心可除去一些小分子杂质
D．蛋白质的粗制品可能是多种蛋白质的混合物
解析：选C。分离纯化蛋白质之前要先让细胞中的蛋白质释放出来，A正确；提取蛋白质时，要根据蛋白质的不同特性选用不同的溶剂，B正确；对蛋白质的粗提取物离心可以除去一些固体杂质，C错误；蛋白质的粗制品是多种蛋白质的混合物，D正确。
6．下列有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是( )
A．它们都是分离蛋白质的重要方法
B．它们的原理相同
C．使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要
D．以上说法都正确
解析：选A。不同蛋白质的分子量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子的迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，A正确、B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，C错误。
7．下列关于蛋白质纯化方法的叙述，错误的是( )
A．纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的
B．透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同
C．通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质
D．不同的物质在同一电场中的泳动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质
解析：选B。透析法是利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性，将蛋白质与其他小分子化合物分离开来。
8．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的说法，不正确的是( )
A．实验所用的巴比妥缓冲液的pH为8.6
B．点样是在薄膜的光泽面上进行的
C．实验后可以得到五条色带
D．整个实验最关键的步骤是点样
解析：选B。在点样时，用盖玻片在薄膜的非光泽面且离薄膜一端2 cm 处轻轻点样。
9．下图是人血清蛋白在以醋酸纤维薄膜为支持物，pH为8.6 的巴比妥缓冲液中电泳分离结果示意图，由此图不能得出的结论是( )
A．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中γ、β、α2、α1和清蛋白都带负电荷
B．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中电泳时，γ、β、α2、α1和清蛋白迁移速率不同
C．β球蛋白的相对分子质量一定比α球蛋白的相对分子质量大
D．在pH为8.6的巴比妥缓冲液中γ球蛋白迁移速率最慢，清蛋白迁移速率最快
解析：选C。带电粒子在电场中迁移的速率是带电粒子带电性质、带电量、粒子大小、粒子形状共同作用的结果。
10．如图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验装置，下列叙述不正确是( )
A．用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较小的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
解析：选B。图甲装置为透析法，通过对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，A正确；图乙装置为凝胶色谱法，试管中收集到的液体中最先出现的是相对分子质量较大的蛋白质，B错误；用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集，C正确；丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动，D正确。
11.
如图表示对某蛋白质溶液进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是( )
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其分子量大小
D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种
解析：选B。蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳中所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子量大小决定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能有两种蛋白质。
12．下列关于凝胶色谱法的原理及操作，不正确的是( )
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出，而小分子可以进入凝胶内部而流速缓慢，最后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其空隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析：选C。凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。凝胶是由多糖类化合物构成的，其内部有很微细的多孔网状结构，相对分子质量较小的蛋白质可以进入凝胶内部，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部，路程较短，移动速度较快，因此在洗脱过程中先分离出来。不同的凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离的分子大小也不同。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所以要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
二、非选择题
13．请根据血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验回答下列问题：
(1)实验所用的主要试剂有：________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)实验所用缓冲液的pH为________，为什么？________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)点样应点在薄膜的哪一面？__________，方法是：用__________在血清中蘸一下，在离薄膜一端________cm处轻轻按下，随即提起。
(4)实施电泳时，每厘米膜宽电流强度为________________________________________________________________________，
电泳时间为________________________。
解析：(1)血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验需配制的试剂有巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等。(2)实验所用的缓冲液的pH为8.6，因为此时血清中的各种蛋白质都呈负电性，而且彼此电荷大小不同，便于分离。(3)在点样时，用盖玻片在膜的非光泽面且离薄膜一端2 cm处轻轻点样。(4)在实施电泳时，盖上电泳槽盖，在薄膜平衡约10 min后通上电源，调节电流强度至每厘米膜宽0.4～0.8 mA，电泳时间为60～90 min。
答案：(1)巴比妥缓冲液、染色液、漂洗液、透明液等
(2)8.6 在此pH下，血清中的各种蛋白质都呈负电性，而且彼此电荷大小不同，便于分离
(3)非光泽面 盖玻片 2
(4)0.4～0.8 mA 60～90 min
14.
凝胶色谱技术是20世纪六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便、不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等相关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________。
解析：用凝胶色谱法分离各种蛋白质时，大分子蛋白质先洗脱出来，小分子蛋白质后洗脱出来。大分子蛋白质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子蛋白质可进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子蛋白质的下移速度落后于大分子蛋白质。在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；洗脱时要调节洗脱液流速，保持稳定。
答案：(1)a a的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网或尼龙纱
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
(4)相同 保持稳定
15．商品化植酸酶主要来自微生物，首先筛选出产酶的菌株，然后制备植酸酶，请根据下面的流程图回答问题：
(1)Ⅰ中的主要成分有哪些？____________________；Ⅱ中包含哪些成分？__________________。
(2)请写一种纯化得到植酸酶的方法：________________________________________________________________________；
其原理是________________________________________________________________________。
解析：植酸酶是蛋白质，属于大分子有机物，含酶的发酵液经过透析后，能够除去小分子杂质，这样就能够得到植酸酶。对于粗提取的植酸酶可以用凝胶色谱法进行提纯，由于蛋白质带有电荷，亦可用电泳法进行纯化。
答案：(1)小分子杂质 植酸酶等多种蛋白质
(2)凝胶色谱法 根据蛋白质之间分子量的大小差异进行纯化(或电泳法 根据蛋白质之间电荷、分子量的大小等差异进行纯化)
16．某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下，试回答下列有关问题：
―→→→
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度、pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________________________________________________________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是__________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以__________________________(写出一种方法)。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子____________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水；根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水胀
破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。
答案：(1)生理盐水 渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水胀破)
(2)除去样品中的小分子杂质 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液
(3)带电性质以及分子大小、形状
(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
课件52张PPT。第四章 生物化学与分子生物学技术实践第四章 生物化学与分子生物学技术实践研磨超声波抽提液蛋白质的特性偏碱性偏酸性有机溶剂离心速度密度半透膜蛋白质蛋白质分子量多糖类化合物多孔网状结构容易较慢较短架滤纸桥细心点样平悬薄膜染色透析洗脱与收集×√√×√×分子大小、密度不同分子大小、密度不同半透膜小分子化合物透析液较短较快较长缓慢巴比妥缓冲透明↓↓支架前沿气泡记号巴比妥缓冲液↓↓记号2cm↓记号正极60～90 ↓↓染色液蛋白质区底色脱净↓↓透明液透明薄膜低速短时间20003磷酸缓冲液蒸馏水垂直一次紧密流出口关闭打开1mL红5本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放
