第二节 分离特定的微生物并测定其数量
学习导航
明目标、知重点难点
了解、分析选择分离微生物的条件。(重点)
简述选择分离微生物并进行计数的方法。(重、难点)
学会从土壤中分离出能分解纤维素的微生物的方法。(重点)
[学生用书P14])
一、阅读教材P17～18分析微生物的分离
1．原理：在实验室中利用选择培养基可以筛选和分离出某种微生物，然后在高度稀释的条件下，在固体培养基上培养该微生物形成的单个菌落，即为纯培养物。
2．方法：平板分离法，包括涂布平板法和混合平板法。
3．选择培养分离：科学家针对某种微生物的特性，设计一个特定的环境，使之特别适合某种微生物的生长，而抑制其他微生物的生长。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术，称为选择培养分离。
4．根据菌落特征初步分离
(1)菌落的含义：是指单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
(2)菌落特征：不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落一般都具有稳定的特征，如菌落的大小、形状、边缘特征、隆起程度、颜色等，这些可以作为对微生物进行分类、鉴定的重要依据。
二、阅读教材P19～22完成土壤微生物的分离、培养与数量测定
1．涂布平板法培养和计数土壤微生物
(1)准备实验器材：所有玻璃器皿灭菌前需要用适当浓度的浓硫酸浸泡24 h。
(2)采集土壤，制备悬液
①制备悬液：称取0.5 g土壤样品，倒入盛有50 mL无菌水的锥形瓶，振荡20 min，使土样充分打散，即为10－2 g/mL的土壤悬液。
②等比稀释：用无菌移液管吸取0.5 mL土壤悬液注入盛有4.5 mL无菌水的1号试管，配成10－3 g/mL的土壤悬液。取另一支无菌移液管吹吸1号试管3次，使悬液均匀，再吸取0.5 mL注入盛有4.5 mL无菌水的2号试管，配成10－4 g/mL的土壤悬液。以此类推，依次配制成10－5 g/mL、10－6 g/mL、10－7 g/mL、10－8 g/mL的土壤悬液。
(3)选择适于分离特定微生物的培养基：利用不同微生物代谢特性的不同，通过选择培养基选出所需要的特定微生物。
(4)接种：用3支无菌移液管分别吸取10－8 g/mL、10－7 g/mL、10－6 g/mL的土壤悬液各1 mL加入培养皿中，每个浓度设置3个重复，并充分振荡混合均匀，用涂布平板法进行分离。
(5)培养与观察：将培养皿倒置于37_℃恒温箱中培养1～2 d，观察细菌菌落。
(6)计数菌落：培养1～2 d后取出平板，计数，选取菌落数为30～300的一组为样本进行统计。每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(假定涂布所用稀释液为1 mL)。
2．显微镜直接计数法
(1)原理：此法利用特定的血球计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量。血球计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，但计数室都是由400个小格组成的。
(2)操作：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌毛细吸管吸取摇匀的土壤微生物培养液，在盖玻片边缘滴一小滴，让培养液通过毛细渗透作用自动进入计数室。然后在显微镜下计数4或5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。
(3)计算公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×104×稀释倍数。
三、阅读教材P22～23完成分离土壤中能分解纤维素的微生物
1．实验原理：纤维素分解菌可以分泌纤维素酶，在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能很好地生长，其他微生物则不能生长。
2．筛选方法：刚果红染色法。如果发现菌落周围出现透明圈，则这些菌落就是能分解纤维素的细菌形成的。
判一判
(1)菌落是肉眼鉴别微生物不同种类的重要依据。(√)
(2)稀释涂布平板法的结果都可在培养基表面形成单个的菌落。(×)
(3)每种培养基都只适合一种微生物的特殊营养需求。(×)
(4)在固体培养基上形成的单个菌落即为纯培养物。(√)
(5)富含有机物的土壤中微生物的种类和数量少，反之则多。(×)
连一连
平板分离法分离微生物[学生用书P15]
利用选择培养基可达到分离纯化微生物的目的，常用平板分离法分离和纯化微生物。结合教材P17内容完成以下探究。
据图比较两种分离和纯化方法。
比较
操作
特点
结果
涂布平板法
取一定稀释度的样品涂布平板
↓
用无菌玻璃涂布器将样品涂布均匀
先制作平板后加入菌液
细菌菌落通常仅在平板表面生长
混合平板法
取一定稀释度的样品与熔化的培养基混合
↓
将与样品混合后的培养基倒入无菌培养皿
菌液与培养基混合，共同倒平板
细菌菌落出现在平板表面及内部
1．选择培养基
(1)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制和阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。
(2)选择培养基的不同处理方法
①在培养基全部营养成分具备的前提下，加入某种物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。
②通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。
③利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。
④通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。
2．平板划线法和涂布平板法的区别
比较
优点
缺点
适用范围
平板划线法
可以观察菌落特征，对混合菌进行分离
不能计数
适用于好氧菌
涂布平板法
可以计数，可以观察菌落特征
吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延
适用于厌氧菌和兼性厌氧菌
突破1 选择培养基
1．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需要的微生物。在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素，可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%的酚，可以抑制细菌和霉菌。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出( )
A．大肠杆菌 B．霉菌
C．放线菌 D．圆褐固氮菌
解析：选A。固氮细菌的生长不需要从培养基中获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长，因此可分离出圆褐固氮菌；在加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，可分离出霉菌；在加入10%的酚的培养基中，因该培养基能抑制细菌和霉菌的生长，所以可分离出放线菌。利用上述三种培养基无法分离出大肠杆菌。
生物的适应性是选择培养基配制的理论依据
生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基，控制培养条件等可以选择目的微生物，如将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。
突破2 涂布平板法
2．下列有关稀释涂布平板法的叙述，错误的是( )
A．首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B．然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C．适宜条件下培养
D．结果都可在培养基表面形成单个的菌落
解析：选D。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释。然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。
突破3 平板划线法和涂布平板法
3．用平板划线法或涂布平板法纯化大肠杆菌时( )
①可以用相同的培养基
②都需要使用接种针进行接种
③都需要在酒精灯火焰旁进行接种
④都可以用来计数活菌
A．①② B．③④
C．①③ D．②④
解析：选C。平板划线法或涂布平板法都使用固体培养基，故①正确；平板划线法采用接种针进行操作，而稀释涂布平板法采用玻璃涂布器进行操作，故②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在酒精灯火焰旁接种，避免空气中的微生物混入培养基，故③正确；平板划线法一般用于分离而不是计数，故④错误。
辨明平板划线法与涂布平板法操作中的易误区
平板划线法中的主要操作要领是“多次划线”，稀释涂布平板法中的主要操作要领是“充分稀释”，二者虽然操作方法不同，但目的是一样的，即获得由单个细胞增殖而成的菌落。如果平板划线法中的划线次数太少或稀释涂布平板法中的稀释倍数不够，则得到的菌落可能是由多个细胞增殖而来的，其中可能掺杂着其他杂菌，达不到纯化的目的。
微生物的计数方法[学生用书P16]
利用特定血球计数板，可在显微镜下直接计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌的死活。常用涂布平板法计数避免其不足。结合教材P20～22内容完成以下探究。
探究1 结合下图(以土壤微生物为例)，分析用涂布平板法计数微生物的方法
(1)计数原理：将待测样品经过适当稀释后，其中的微生物可能被分散成单个个体，吸取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养会形成由单个细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，每个菌落代表原样液中的一个微生物。
(2)基本步骤：采集土壤，制备土壤悬液→选择适于分离特定微生物的培养基→接种→培养与观察→计数菌落。
(3)设置重复组的目的是增强实验的说服力与准确性。
(4)培养与观察时应将培养皿倒置于 37 ℃恒温箱中培养1～2 d，观察细菌菌落。
(5)计数菌落
①培养24～48 h后取出平板计数，选取菌落数为 30～300的一组为样本进行统计。
②每克土壤样品的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(假定涂布所用稀释液为1 mL)。
探究2 结合下图，分析显微镜直接计数法
(1)操作过程
①将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌的毛细滴管吸取摇匀的土壤微生物悬液，在盖玻片的边缘滴一小滴，让菌液沿着缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室。
②加样后静置 5 min，然后在显微镜下计数4或5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按计算公式求出每毫升样品中所含的菌体总数。
(2)换算公式：1 mL悬液所含菌体总数＝每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数。
(1)涂布平板法统计的菌落数就是活菌的实际数目，对吗？
提示：不对，统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
(2)直接计数法统计的菌落数就是活菌数吗？
提示：不是，直接计数法统计的死菌、活菌都计算在内，所以统计的菌落数不仅仅是活菌数目。
1．间接计数法(活菌计数法)
(1)原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作
①设置重复组：同一稀释度下，至少涂3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。分析结果时，需考虑重复组的结果是否一致，结果明显不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
②为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③计算公式：每克样品中的细菌数＝某一稀释度几次重复培养后的菌落平均数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)。
④培养1～2 d，统计每个培养皿中的菌落数。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落。
2．直接计数法和间接计数法的比较
直接计数法
间接计数法
主要用具
显微镜、血球计数板
培养基
计数依据
菌体本身
培养基菌落数
优点
计数方便、操作简单
计的是活菌数
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，且有一定误差
计算公式
每毫升悬液中菌体数＝400×104×每小格平均菌体数×稀释倍数
每克样品中的细菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数(涂布所用稀释液为1 mL)
注：400、104是常数。
突破1 微生物间接计数
1．金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起食物中毒、肺炎、肠炎等。某研究小组的同学用所学的微生物的实验室培养的方法进行“变质牛奶中金黄色葡萄球菌的分离和计数实验”，部分实验处理和结果如下图。(注：培养皿旁的数字代表菌落数目；实验室条件满足金黄色葡萄球菌的生长繁殖；实验操作规范；实验过程严格做好各项防护防扩散等工作)
请回答相关问题：
(1)在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供适合的________和________条件；另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。
(2)据图，研究小组采用的是________法分离和计数金黄色葡萄球菌。由样品到4号试管的操作中，第一步，将分别盛有9 mL生理盐水的4支试管________，并编号1～4号；第二步，用移液管从样品中吸取1 mL牛奶，注入1号试管中，充分摇匀；第三步，用移液管从1号试管中吸取1 mL牛奶，注入2号试管中，以此类推，4号试管的稀释倍数是________。
(3)资料显示，金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%～15%NaCl的肉汤中生长；本实验可配制含10%氯化钠的培养基，使之成为________培养基，有利于金黄色葡萄球菌的生长，抑制或阻止其他微生物的生长。
(4)通过观察菌落特征可区分不同种类微生物，这些特征包括菌落的________________等方面；在统计菌落数目时，需按照菌落计数的要求计数，以保证计数结果准确。据图可得出1 mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为________个。
解析：(1)在实验室培养微生物，一方面需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件，另一方面需要确保无处不在的其他微生物无法混入。
(2)分离微生物一般用涂布分离法。涂布分离法中用到了稀释的方法，其中稀释液生理盐水需要进行高压蒸汽灭菌，根据信息可知，4号试管最后的稀释度是104。
(3)培养基中加氯化钠的目的是获得耐盐菌，此培养基为选择培养基。
(4)微生物进行鉴别时可通过菌落的形状、大小、边缘特征、隆起程度和颜色进行判断；据图可知在103稀释度下，菌落数为(32＋39＋37)/3＝36，所以1 mL牛奶样品中金黄色葡萄球菌的活菌数为3.6×105个。
答案：(1)营养 环境
(2)涂布平板 灭菌 104 (3)选择
(4)形状、大小、边缘特征、隆起程度和颜色 3.6×105
菌落间接计数方法
每一稀释度下设置多于3个平板，一般选择菌落数在30～300之间的平板计数。若几个平板的菌落数均不在30～300之间，但几个平板菌落数目相近，且接近30～300之间(如菌落数目为28、25、24、27)，则也可以取其平均值作为菌落数。
突破2 微生物直接计数
2．在探究培养液中酵母菌种群数量变化的实验中，需利用计数板对微生物细胞进行直接计数。血球计数板是一个特制的可在显微镜下观察的载玻片，样品就滴在计数室内。计数室由25×16＝400个小室组成，容纳液体总体积为0.1 mm3。某同学操作时将1 mL酵母菌样品加99 mL 无菌水稀释，用无菌吸管吸取少许使其自行渗入计数室，盖上盖玻片并用滤纸吸去多余菌液，进行观察计数。
(1)在实验中，某同学的部分实验操作过程是这样的：①从静置试管中吸取酵母菌培养液加入血球计数板进行计数，并记录数据；②把酵母菌培养液放置在冰箱中；③第七天再取样计数，记录数据，统计分析绘成曲线。
请纠正该同学实验操作中的3处错误：
①________________________________________________________________________；
②________________________________________________________________________；
③________________________________________________________________________。
(2)在实验前应该对血球计数板、吸管等器具进行________处理。
(3)如果一个小方格内酵母菌过多，难以数清，应采取的措施是______________。
(4)如果观察到如图所示a、b、c、d、e 5个大格共80个小室内共有酵母菌48个，则上述1 mL酵母菌样品中约有酵母菌________个；要获得较为准确的数值，减少误差，你认为该怎么做？________________________________________________。
解析：(1)在从试管中吸取酵母菌之前，应将试管轻轻振荡几次，目的是使酵母菌在培养液中均匀分布。酵母菌的培养液应置于适宜条件下，并且每隔24小时就要统计一次菌落数目。
(2)为了避免杂菌污染，实验中所用吸管、血球计数板等器具需进行灭菌处理。
(3)若一个小方格内酵母菌过多，难以数清，可以适当稀释菌液后，再重新计数。
(4)解答时要注意以下两点：①统一单位；②注意体积的变化。400个小室共容纳液体总体积为0.1 mm3，则80个小室容纳体积为：2×10－2mm3，含酵母菌48个，又因酵母菌培养液稀释倍数为102，统一单位后即可求出酵母菌个数。
答案：(1)①应将试管轻轻振荡几次再吸取酵母菌培养液进行计数
②应将酵母菌培养液放置在适宜温度下培养
③应连续七天观察、取样计数并记录数据
(2)灭菌 (3)适当稀释
(4)2.4×108 多次计数，求平均值
纤维素分解菌的筛选[学生用书P18]
纤维素是一种多糖，自然界中存在着能分解纤维素的一些微生物，可以利用选择培养基将其筛选出来。结合教材P22倒数三段～P23内容理解纤维素分解菌的筛选。
(1)方法：刚果红染色法。
(2)具体操作
在培养出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1 mg/mL的刚果红溶液，10～15 min后，倒去覆盖的溶液；再加入物质的量浓度为 1_mol/L的NaCl溶液，15 min后倒掉覆盖的溶液。如果发现菌落周围出现透明圈，说明这些菌落是由能分解纤维素的细菌形成的。
纤维素分解菌的筛选原理
可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
进入冬季，城市出现严重雾霾，与秸秆野外焚烧有一定关系，为破解秸秆处理瓶颈，微生物专家力图通过微生物降解技术使秸秆能尽快腐烂掉，增加土壤肥力，缓解环境污染。试分析并回答有关问题：
(1)专家研制的降解秸秆的催腐剂是十余种能分解纤维素的霉菌、细菌和酵母菌的组合，其中________在细胞结构上与其他两者不同。
(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将__________________________分解为____________________________。
(3)微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列________________，从而得到单个菌落，再采用____________________法进行鉴定，得到如图的菌落。那么，图中降解纤维素能力最强的菌株是________________(填图中序号)。
(4)图中所示培养基从物理状态上看，属于________培养基。
(5)为探究催腐剂在不同条件下对玉米秸秆的分解作用，将经过灭菌处理的秸秆平分成下表的甲、乙、丙三组，均放在无菌环境条件下进行培养，得到如下实验现象：该实验还存在不完善之处，请你说出其中一点__________________________________。
组别
催腐剂
温度(℃)
实验现象
甲
无
25
第25天落叶还没变化
乙
有
25
第25天落叶完全腐烂
丙
有
35
第18天落叶完全腐烂
答案：(1)细菌 (2)纤维二糖 葡萄糖
(3)梯度稀释 刚果红染色 ①
(4)固体 (5)缺少35 ℃无催腐剂的对照组
核心知识小结
[网络构建]
[关键语句]
用涂布平板法形成的细菌菌落通常仅在平板表面(位置)生长，而混合平板法形成的细菌菌落出现在平板表面及内部(位置)。
微生物分离的原理是提供有利于目的菌株生长的条件，同时抑制或阻止其他微生物生长。方法是使用选择培养基。
统计菌落数目的方法可分为活菌计数法和显微镜直接计数法。前者的原理是涂布平板法接种，一个菌落代表一个单细胞；后者的原理是利用血球计数板，在显微镜下计数。
用刚果红染色法分离土壤中能分解纤维素的微生物。
[随堂检测] [学生用书P19]
知识点一 微生物分离和纯化方法
1．下列关于微生物分离的叙述中，错误的是( )
A．平板分离法能将单个微生物经过培养形成便于移植的菌落
B．只有细菌才可以形成菌落，所以只有分离细菌时才可能获得菌落
C．平板分离法有涂布平板法和混合平板法等
D．涂布平板法得到的菌落仅在平板的表面生长
解析：选B。大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类均能在固体培养基上形成菌落。
2．分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是( )
A．均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面
B．获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C．都应在酒精灯火焰附近进行操作，以防止杂菌污染
D．稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的
解析：选B。用涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。
3．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，下列相关叙述错误的是( )
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．在适宜温度下，接种后的斜面培养基上菌落长成后，可在低温下临时保存菌株
解析：选A。生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选培养基中需要加入漆酶的底物，只有产漆酶的微生物才能在该培养基上生长，进而通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；由图可知，在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；在适宜温度下，接种后的斜面培养基上菌落长成后，可在低温下临时保存菌株，D正确。
知识点二 土壤微生物的分离和计数
4．下列关于纤维素分解菌分离实验的说法，不正确的是( )
A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌
B．从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略
C．该实验用到选择和鉴别培养基
D．在用刚果红染色法中，若将微生物培养在事先加入刚果红的培养基上，出现透明圈的菌落肯定为所需菌种
解析：选D。刚果红能鉴别纤维素，可采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌，A正确；从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略，但需要进行鉴别培养，B、C正确；有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，故出现透明圈的菌落不一定为所需菌种，D错误。
5．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是( )
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
答案：C
6．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________
(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________
(答出两点即可)。
解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基是只允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此，配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可以使培养基中pH保持相对稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
[课时作业] [学生用书P65(单独成册)]
一、选择题
1．下图所示的四种菌落分布图中，用平板划线分离法得到的是( )
解析：选D。平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法，如图D所示。
2．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌、液体培养基
B．许多细菌、液体培养基
C．一个细菌、固体培养基
D．许多细菌、固体培养基
解析：选C。菌落是单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
3．欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是( )
A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照
D．用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
解析：选D。A选项：为防止土壤浸出液浓度过高，不能获得单菌落，要将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确。B选项：同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，防止偶然因素对实验结果的影响，B正确。C选项：可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，C正确。D选项：用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解纤维素的细菌，D错误。
4．将0.1 mL 101、102、103倍稀释的土壤悬液分别接种在固体平板上，得到的平均菌落数为2 760、585和46，则细菌总数(个/mL)为( )
A．2.76×105 B．5.86×105
C．4.6×105 D．4.4×105
解析：选C。注意菌落计数法计算的是不同稀释度的平均菌落数。首先选择平均菌落数在30～300之间的，只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围，所以细菌总数为：46÷(0.1)×103(个/mL)，即4.6×105个/mL。
5．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
解析：选A。能选择出分解尿素的细菌的培养基，应是只以尿素作为唯一氮源的培养基，B选项没有氮源；C选项没有碳源；D选项没有尿素，有蛋白胨和牛肉膏。
6．下列有关涂布平板操作的叙述，不正确的是( )
A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红
B．取少量菌液滴加在培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s再使用
D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
答案：A
7．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B．如果要测定②中活细菌数量，常采用涂布平板法
C．若图中④为对照组，则其中应以苯酚作为唯一碳源
D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
答案：C
8．分离土壤中分解尿素菌的实验操作中，对于获得纯化的尿素分解菌的单菌落影响最大的是( )
A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B．涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
解析：选C。制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，A错误；涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，B错误；该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，该操作对实验影响最大，C正确；接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，D错误。
9．利用农作物秸秆等纤维质原料生产的乙醇，经加工可制成燃料乙醇，从而减少了对石油资源的依赖，下图为生产燃料乙醇的简要流程，据图分析错误的是( )
A．要得到微生物A，最好选择富含纤维素的土壤采集土样
B．图中②过程常用的微生物B是酵母菌
C．微生物A和微生物B可利用的碳源相同
D．可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用
解析：选C。微生物A所用碳源为纤维素，微生物B所用碳源为纤维素降解物。
10．在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。甲同学的结果产生原因可能有( )
①土样不同 ②培养基污染
③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选A。甲同学比其他同学的实验数据大许多，可能由于选取的土样不同，培养基灭菌不彻底或操作过程中杂菌污染，也可能操作失误，如配制的培养基中混入其他含氮物质、稀释度不够准确等。
11．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是( )
A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
解析：选C。为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先取材，配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A项正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B项正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C项错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D项正确。
12．下面是鉴别纤维素分解菌的培养基，判断鉴别纤维素分解菌的现象应是( )
羧甲基纤维素钠
5～10 g
酵母膏
1 g
KH2PO4
0.25 g
琼脂
15 g
土豆汁
100 mL
用蒸馏水定容到1 000 mL
A.在液体培养基中有微生物存活
B．在固体培养基的表面有菌落的形成
C．加入刚果红溶液，在固体培养基上有透明圈形成
D．培养基的表面有微生物进行细胞分裂
解析：选C。该培养基是含有丰富天然有机营养成分的固体培养基。不仅有分解纤维素的微生物的生长，还有其他微生物的生长，它们都能形成相应的菌落，但只有能分解纤维素的微生物，用刚果红溶液染色，能在其菌落周围出现透明圈，而其他微生物的菌落周围因为没有纤维素的分解，不能形成透明圈。微生物个体微小，并不能用肉眼观察微生物的细胞分裂。
二、非选择题
13．从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从________(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从________(填“有氧”或“无氧”)环境采集。
(2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的微生物培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是________培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择________________的培养基，并在________条件下培养。
(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生________。________灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。
(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是____________________________________________；
获得图B效果的接种方法是____________________________________。
解析：(1)在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌应从无氧环境中采集。(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。(3)高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)从培养基中菌落分布看，获得图A用的是涂布平板法，获得图B用的是平板划线法。
答案：(1)高盐 无氧
(2)加盐 以淀粉为唯一碳源 高温
(3)变性 高压蒸汽
(4)涂布平板法 平板划线法
14．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解，回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合物，其中的葡萄糖苷酶可将__________分解成______________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成_______________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的___________________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)。
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲____________________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________；培养基乙________________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________。
解析：(1)微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括Cx酶、C1酶和葡萄糖苷酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成红色复合物，用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。
(3)分析表格可知，培养基甲为液体培养基，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基。培养基乙不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因为培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物。
答案：(1)纤维二糖 葡萄糖
(2)红 透明圈
(3)不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物
15．土壤有“微生物的天然培养基”之称，下图表示对土壤中某种微生物进行分离和计数而进行的对样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图。请据图回答有关问题：
(1)图示统计样品活菌数目的方法叫做________法，主要包括________操作和________操作。
(2)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的________，一般选择菌落数在____________之间的平板进行计数。
(3)图中各试管间的“箭头”表示的操作过程是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
这一操作过程中每一步都要在火焰旁边进行。
(4)图中选择了104、105、106倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中________的数量，这个平板需要在________的温度下培养。
(5)如果要想分离分解尿素的细菌，平板中培养基成分的特点应该是________________________________________________________________________；
如果怀疑培养基被污染导致统计结果有误，则需要做对照实验，方法_______________________________________________。
解析：活菌计数最常用的是涂布平板法，最关键的步骤是梯度稀释和涂布平板。本题考查的内容涉及梯度稀释的方法、要点以及涂布平板培养基的配制、选择稀释度的范围、鉴定培养基是否被污染的方法等都是围绕这两个方面进行的。
答案：(1)涂布平板 梯度稀释 涂布平板
(2)一个活菌 30～300
(3)用移液管吸取1 mL上一试管的菌液注入下一试管中，并用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混合
(4)细菌 30～37 ℃
(5)尿素作为唯一氮源 将一个培养基在不加土壤液的情况下与加入土壤液的培养基同时培养
16．某研究小组按下图所示过程从土壤中筛选能高效降解尿素的细菌。请回答下列问题：
(1)步骤②是______________________。
(2)为了筛选目的菌，步骤③的培养基中加入的唯一氮源为________，这种培养基属于________(根据用途填写)培养基。
(3)步骤③中，需转为固定培养，常采用____________法接种，其中需要用到的接种工具是________(填字母)。
(4)为了对初步筛选出来的菌种作进一步的鉴定，可在培养基中加入________指示剂，若指示剂变成________色，则说明该菌种能够分解尿素。
(5)涂布平板：取0.1 mL稀释液，每个浓度下涂布三个平板。为避免杂菌污染，接种应在________附近进行。
答案：(1)系列稀释(或样品稀释、梯度稀释)
(2)尿素 选择 (3)涂布平板 C (4)酚红 红
(5)(酒精灯)火焰
[随堂检测] [学生用书P19]
知识点一 微生物分离和纯化方法
1．下列关于微生物分离的叙述中，错误的是( )
A．平板分离法能将单个微生物经过培养形成便于移植的菌落
B．只有细菌才可以形成菌落，所以只有分离细菌时才可能获得菌落
C．平板分离法有涂布平板法和混合平板法等
D．涂布平板法得到的菌落仅在平板的表面生长
解析：选B。大多数细菌、许多真菌和单细胞藻类均能在固体培养基上形成菌落。
2．分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是( )
A．均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面
B．获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C．都应在酒精灯火焰附近进行操作，以防止杂菌污染
D．稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的
解析：选B。用涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。
3．漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，下列相关叙述错误的是( )
A．生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品
B．筛选培养基中需要加入漆酶的底物，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落
C．在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化
D．在适宜温度下，接种后的斜面培养基上菌落长成后，可在低温下临时保存菌株
解析：选A。生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A错误；筛选培养基中需要加入漆酶的底物，只有产漆酶的微生物才能在该培养基上生长，进而通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B正确；由图可知，在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C正确；在适宜温度下，接种后的斜面培养基上菌落长成后，可在低温下临时保存菌株，D正确。
知识点二 土壤微生物的分离和计数
4．下列关于纤维素分解菌分离实验的说法，不正确的是( )
A．通常采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌
B．从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略
C．该实验用到选择和鉴别培养基
D．在用刚果红染色法中，若将微生物培养在事先加入刚果红的培养基上，出现透明圈的菌落肯定为所需菌种
解析：选D。刚果红能鉴别纤维素，可采用刚果红染色法筛选纤维素分解菌，A正确；从土壤中分离含量较多的微生物时，选择培养可以省略，但需要进行鉴别培养，B、C正确；有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红而形成明显的透明圈，故出现透明圈的菌落不一定为所需菌种，D错误。
5．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是( )
A．3号试管的稀释倍数为103倍
B．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰好为5号试管的10倍
C．5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D．该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
答案：C
6．某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生________________________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是________________________________________________________________________
(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________________________________
(答出两点即可)。
解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基是只允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此，配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可以使培养基中pH保持相对稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
[课时作业] [学生用书P65(单独成册)]
一、选择题
1．下图所示的四种菌落分布图中，用平板划线分离法得到的是( )
解析：选D。平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到纯化分离微生物的一种方法，如图D所示。
2．产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌、液体培养基
B．许多细菌、液体培养基
C．一个细菌、固体培养基
D．许多细菌、固体培养基
解析：选C。菌落是单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度，形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
3．欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是( )
A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照
D．用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
解析：选D。A选项：为防止土壤浸出液浓度过高，不能获得单菌落，要将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确。B选项：同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，防止偶然因素对实验结果的影响，B正确。C选项：可以将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，以判断培养基灭菌是否彻底，C正确。D选项：用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解纤维素的细菌，D错误。
4．将0.1 mL 101、102、103倍稀释的土壤悬液分别接种在固体平板上，得到的平均菌落数为2 760、585和46，则细菌总数(个/mL)为( )
A．2.76×105 B．5.86×105
C．4.6×105 D．4.4×105
解析：选C。注意菌落计数法计算的是不同稀释度的平均菌落数。首先选择平均菌落数在30～300之间的，只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围，所以细菌总数为：46÷(0.1)×103(个/mL)，即4.6×105个/mL。
5．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
解析：选A。能选择出分解尿素的细菌的培养基，应是只以尿素作为唯一氮源的培养基，B选项没有氮源；C选项没有碳源；D选项没有尿素，有蛋白胨和牛肉膏。
6．下列有关涂布平板操作的叙述，不正确的是( )
A．将涂布器在酒精灯火焰上灼烧，直到烧红
B．取少量菌液滴加在培养基表面
C．将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10 s再使用
D．涂布时可转动培养皿，使涂布均匀
答案：A
7．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B．如果要测定②中活细菌数量，常采用涂布平板法
C．若图中④为对照组，则其中应以苯酚作为唯一碳源
D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
答案：C
8．分离土壤中分解尿素菌的实验操作中，对于获得纯化的尿素分解菌的单菌落影响最大的是( )
A．制备浸出液的土壤取自土壤的表层
B．涂布前涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌
C．牛肉膏蛋白胨培养基中添加尿素作为氮源
D．接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒
解析：选C。制备浸出液的土壤取自土壤的表层与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，A错误；涂布器未在酒精灯外焰上灼烧灭菌可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，B错误；该培养基必须以尿素为唯一的氮源，不能使用牛肉膏蛋白胨培养基或在其中添加尿素作为氮源，该操作对实验影响最大，C正确；接种操作者的双手未用酒精棉进行消毒，可能会造成污染，与纯化的尿素分解菌的单菌落有关但影响不大，D错误。
9．利用农作物秸秆等纤维质原料生产的乙醇，经加工可制成燃料乙醇，从而减少了对石油资源的依赖，下图为生产燃料乙醇的简要流程，据图分析错误的是( )
A．要得到微生物A，最好选择富含纤维素的土壤采集土样
B．图中②过程常用的微生物B是酵母菌
C．微生物A和微生物B可利用的碳源相同
D．可用纤维素酶制剂代替微生物A起作用
解析：选C。微生物A所用碳源为纤维素，微生物B所用碳源为纤维素降解物。
10．在做分离分解尿素的细菌实验时，甲同学从对应106倍稀释的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。甲同学的结果产生原因可能有( )
①土样不同 ②培养基污染
③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选A。甲同学比其他同学的实验数据大许多，可能由于选取的土样不同，培养基灭菌不彻底或操作过程中杂菌污染，也可能操作失误，如配制的培养基中混入其他含氮物质、稀释度不够准确等。
11．原油中含有大量有害的、致癌的多环芳烃。土壤中有些细菌可以利用原油中的多环芳烃为碳源，在培养基中形成分解圈。为筛选出能高效降解原油的菌株并投入除污，某小组同学设计了相关实验。下列有关实验的叙述，不正确的是( )
A．应配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用
B．配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基
C．将土壤稀释液灭菌后接种到选择培养基上
D．在选择培养基上能形成分解圈的即为所需菌种
解析：选C。为了筛选、获取能利用多环芳烃为碳源的菌种，首先取材，配制来源于被原油污染土壤的土壤稀释液备用，A项正确；其次配制以多环芳烃为唯一碳源的选择培养基，B项正确；然后进行接种，在无菌环境下，将土壤稀释液接种到选择培养基上，在适宜的条件下进行培养，若将土壤稀释液灭菌，就不能筛选出能高效降解原油的菌株，C项错误；在选择培养基上形成的菌落，若该菌落周围有分解圈，即为所需菌种，D项正确。
12．下面是鉴别纤维素分解菌的培养基，判断鉴别纤维素分解菌的现象应是( )
羧甲基纤维素钠
5～10 g
酵母膏
1 g
KH2PO4
0.25 g
琼脂
15 g
土豆汁
100 mL
用蒸馏水定容到1 000 mL
A.在液体培养基中有微生物存活
B．在固体培养基的表面有菌落的形成
C．加入刚果红溶液，在固体培养基上有透明圈形成
D．培养基的表面有微生物进行细胞分裂
解析：选C。该培养基是含有丰富天然有机营养成分的固体培养基。不仅有分解纤维素的微生物的生长，还有其他微生物的生长，它们都能形成相应的菌落，但只有能分解纤维素的微生物，用刚果红溶液染色，能在其菌落周围出现透明圈，而其他微生物的菌落周围因为没有纤维素的分解，不能形成透明圈。微生物个体微小，并不能用肉眼观察微生物的细胞分裂。
二、非选择题
13．从自然菌样中筛选较理想生产菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。
(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从适合的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养嗜盐菌的菌样应从________(填“高盐”或“低盐”)环境采集，培养厌氧菌的菌样应从________(填“有氧”或“无氧”)环境采集。
(2)富集培养指创设仅适应于该条件的微生物旺盛生长的特定的环境条件，使待分离微生物在群落中的数量大大增加，从而达到从自然界中分离到所需的特定微生物目的的微生物培养方法。对嗜盐菌富集培养的培养基应是________培养基；对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择________________的培养基，并在________条件下培养。
(3)实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌的效果。高温灭菌的原理是高温使微生物的蛋白质和核酸等物质发生________。________灭菌法是微生物研究和教学中应用最广、效果最好的湿热灭菌法。
(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
获得图A效果的接种方法是____________________________________________；
获得图B效果的接种方法是____________________________________。
解析：(1)在长期自然选择的作用下，生物与其生活环境相适应，培养嗜盐菌的菌样应从高盐环境中采集，培养厌氧菌应从无氧环境中采集。(2)对嗜盐菌富集培养的培养基应是加盐培养基，对含耐高温淀粉酶的微生物富集培养应选择以淀粉为唯一碳源的培养基且在高温条件下培养。(3)高温能使蛋白质和核酸发生不可逆转的变性，高压蒸汽灭菌法是应用最广、效果最好的湿热灭菌法。(4)从培养基中菌落分布看，获得图A用的是涂布平板法，获得图B用的是平板划线法。
答案：(1)高盐 无氧
(2)加盐 以淀粉为唯一碳源 高温
(3)变性 高压蒸汽
(4)涂布平板法 平板划线法
14．植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解，回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合物，其中的葡萄糖苷酶可将__________分解成______________。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成_______________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的___________________。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)。
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲____________________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________；培养基乙________________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是______________________。
解析：(1)微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括Cx酶、C1酶和葡萄糖苷酶，其中的葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成红色复合物，用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的透明圈。
(3)分析表格可知，培养基甲为液体培养基，不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，纤维素分解菌鉴别培养基属于固体培养基。培养基乙不能用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因为培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物。
答案：(1)纤维二糖 葡萄糖
(2)红 透明圈
(3)不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物
15．土壤有“微生物的天然培养基”之称，下图表示对土壤中某种微生物进行分离和计数而进行的对样品的稀释和稀释液的取样培养流程示意图。请据图回答有关问题：
(1)图示统计样品活菌数目的方法叫做________法，主要包括________操作和________操作。
(2)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的________，一般选择菌落数在____________之间的平板进行计数。
(3)图中各试管间的“箭头”表示的操作过程是
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
这一操作过程中每一步都要在火焰旁边进行。
(4)图中选择了104、105、106倍的稀释液进行平板培养，最可能是测定土壤中________的数量，这个平板需要在________的温度下培养。
(5)如果要想分离分解尿素的细菌，平板中培养基成分的特点应该是________________________________________________________________________；
如果怀疑培养基被污染导致统计结果有误，则需要做对照实验，方法_______________________________________________。
解析：活菌计数最常用的是涂布平板法，最关键的步骤是梯度稀释和涂布平板。本题考查的内容涉及梯度稀释的方法、要点以及涂布平板培养基的配制、选择稀释度的范围、鉴定培养基是否被污染的方法等都是围绕这两个方面进行的。
答案：(1)涂布平板 梯度稀释 涂布平板
(2)一个活菌 30～300
(3)用移液管吸取1 mL上一试管的菌液注入下一试管中，并用手指轻压移液管橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混合
(4)细菌 30～37 ℃
(5)尿素作为唯一氮源 将一个培养基在不加土壤液的情况下与加入土壤液的培养基同时培养
16．某研究小组按下图所示过程从土壤中筛选能高效降解尿素的细菌。请回答下列问题：
(1)步骤②是______________________。
(2)为了筛选目的菌，步骤③的培养基中加入的唯一氮源为________，这种培养基属于________(根据用途填写)培养基。
(3)步骤③中，需转为固定培养，常采用____________法接种，其中需要用到的接种工具是________(填字母)。
(4)为了对初步筛选出来的菌种作进一步的鉴定，可在培养基中加入________指示剂，若指示剂变成________色，则说明该菌种能够分解尿素。
(5)涂布平板：取0.1 mL稀释液，每个浓度下涂布三个平板。为避免杂菌污染，接种应在________附近进行。
答案：(1)系列稀释(或样品稀释、梯度稀释)
(2)尿素 选择 (3)涂布平板 C (4)酚红 红
(5)(酒精灯)火焰
课件71张PPT。第一章 无菌操作技术实践第一章 无菌操作技术实践选择固体单个菌落平板分离法混合平板法选择培养固体形态结构形状颜色分类振荡无菌水3均匀3个涂布平板37℃30～300菌落平均数稀释倍数血球计数板4或5每小格平均细菌数纤维素刚果红染色法√××√×涂布先制作平板后加入菌液平板表面菌液与培养基混合，共同倒平板平板表面及内部单个个体单个细胞一个土壤悬液分离特定微生物接种增强实验的说服力与准确性37 30～300盖玻片毛细滴管5稀释倍数刚果红染色法刚果红1mol/L的NaCl透明圈本部分内容讲解结束按ESC键退出全屏播放
