浙科版高二生物选修一实验1：大肠杆菌的培养和分离（共33张PPT）

(共33张PPT)
实验1：大肠杆菌的培养和分离
一、基础知识
（一）微生物：
1、特点：
结构简单，形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到。
2、包括：
3、大肠杆菌的常识：
单细胞藻类、原生动物
……
酵母菌、霉菌
……
细菌、放线菌、蓝藻
……
1、大肠杆菌的外形：
——
杆状菌
2、大肠杆菌的代谢类型：
根据细菌所利用的碳源的不同，可分为两大营养类型——自养菌和异养菌
——
异养兼性厌氧菌
3、大肠杆菌的革兰氏染色：
——
革兰氏阴性菌
根据细菌细胞壁成分的不同，通过革兰氏染色可
分为阳性和阴性两类
根据细菌其生命活动过程中是否需要氧气，可分为——需氧菌、厌氧菌和兼性厌氧菌
一、基础知识
（二）培养基：
1、分类(按物理状态)：
区别：是否加琼脂
用途：
单个细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体——菌落
不同的细菌的菌落特征不同；菌落是鉴定菌种的重要依据。
供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养基质。
1、分类(按物理状态)：
一、基础知识
（二）培养基：
供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养基质。
(根据化学成分)：
区别：成分是否明确
用途：
1、分类(按物理状态)：
(根据用途)：
：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基：
供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养基质。
(根据化学成分)：
一、基础知识
（二）培养基：
2、培养基的营养成分：
一般都要含有水、碳源、氮源、无机盐、生长因子等营养物质；但各种培养基的具体配方不同。
不同培养基还需要满足不同微生物对pH
、氧气、渗透压等的要求。
细菌：中性偏碱
霉菌：中性偏酸
细菌需加入一定量NaCl来维持渗透压
细菌喜荤——要用蛋白胨和酵母提取物配制
霉菌喜素——常用无机物或添加蔗糖的豆芽汁配制
厌氧微生物需提供无氧条件
自养微生物：无机碳源
异养微生物：有机碳源
培
养
基
成
分
成分
主要作用
主要来源
碳源
作能源物质
无机碳(CO2
、
NaHCO3)
或有机碳(糖类)
氮源
合成含N类化合物
N2、NH3、铵、硝酸盐、尿素、牛肉膏、蛋白胨
无机盐
调节渗透压等
水
溶剂，生化反应的介质
生长因子
酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基
注意：
1、不同生物所需营养物质(即维持机体生命活动，保
证生长发育、生殖所需的外源物质)不同：
动物：包括水、无机盐、糖类、脂质、蛋白质、
维生素六类；
植物：包括矿质元素、水、二氧化碳三类；
微生物：包括水、无机盐、碳源、氮源及生长因
子五类。
2、微生物需要补充生长因子是由于缺乏合成这些物质
所需要的酶或合成能力有限。
一、基础知识
（三）无菌技术：
1、概念：
2、具体操作：
对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；
将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰旁进行；
操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
3、消毒与灭菌的区别：
泛指在培养微生物的操作中，所有防止外来杂菌污染的方法。
成功培养微生物的关键。
消毒与灭菌的区别
成分
消毒
灭菌
概念
使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。
使用强烈的理化因素，杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。
常用
方法
煮沸消毒法：100℃煮沸5-6min
巴氏消毒法：常用于牛奶的消毒（70-75
℃下煮30min或
80
℃下煮15min）
化学药剂消毒：如用70%酒精进行皮肤消毒，氯气消毒水源
紫外线消毒：用于空气消毒
灼烧灭菌
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
干热灭菌
高压蒸汽灭菌
培养基及器具的灭菌
操作步骤：
加塞封口、包扎
——
灭菌
——烘干
通常试管用棉塞(2/3在试管内)，三角瓶用封口膜或纱布。
作用：既通气又阻止杂菌进入
不能用脱脂棉(易吸水引起污染)。
用牛皮纸或报纸包扎
放入高压蒸汽灭菌锅,在121℃(1Kg/cm2压力)下灭菌15min。
培养基中若有葡萄糖,用500g/cm2压力(90℃以上)灭菌30min。防止葡萄糖分解碳化
不能加热灭菌的化合物(如尿素)，只能用G6玻璃砂漏斗过滤。细菌不能滤过G6
60~80℃烘箱中烘干
（一）实验目的：
1、进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2、进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。
3、说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。
本实验的内容是：将大肠杆菌扩大培养和划线分离。
二、实验内容
二、实验内容
（二）设备及用品：
（三）材料
50mlLB液体培养基
2.
大肠杆菌菌种斜面
3.
空白斜面
——用于大肠杆菌的扩大培养
——用于大肠杆菌的菌种保存
——扩大培养所用菌种
二、实验内容
（四）实验步骤：
称量——溶化——调PH——分装——加塞封口、包扎——灭菌(有压力后开始计时)
配方：
LB液体培养基——细菌的扩大培养
LB固体培养基——细菌的划线分离
用途：
操作步骤：
1、LB培养基的配制和灭菌：
富含小分子氨基酸、多肽、核苷酸、维生素等天然活性成分的物质
培养基组分
提供的主要营养
蛋白胨
0.5g
氮源、碳源
酵母提取物
0.25g
生长因子
氯化钠
0.5g
无机盐（维持渗透压）
水
50mL
(溶剂，生化反应的介质)
（琼脂
1g）
（凝固剂）
分装
本实验是将50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基(刚配好，尚未凝固)分别装入2个250ml的三角瓶中。
液体分装到三角瓶，一般培养液高度不超过瓶高1/4。
分装过程中培养基不能沾上管口或瓶口，在将培养基分装到三角瓶或试管中时必须用三角漏斗。
——以免引起污染
固体分装到试管，培养液应不超过管高1/5
。
——便于放斜面
增大表面积，主要培养接
种用菌种及菌种的保存。
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入培养皿中，置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部，待凝固后即形成平面。
过程：
含义：
注意事项：
1、灭菌后需待灭菌锅压力与大气压相同时才能打开锅盖，培养基需要冷却到
60℃左右时，才能用来倒平板。
2、要使三角瓶的瓶口通过火焰的原因：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
3、整个操作要在酒精灯火焰旁进行原因：避免杂菌污染。
4、平板冷凝后要倒置原因：既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
二、实验内容
（四）实验步骤：
2、倒平板：
1、无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒。
倒平板过程
4、将三角瓶中的培养基倒入培养皿，立刻盖上培养皿盖，置于水平位置上，并轻轻晃动，使培养基铺满底部。
2、在火焰旁，右手无名指和小指夹住封口膜，另外三指拿三角瓶，并使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；
5、待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
3、左手拿培养皿并打开上盖的一边(不能全部打开)。
1、取菌前接种环要用酒精灯灼烧灭菌，冷却后方能取菌；
2、在火焰旁从斜面上用接种环取菌；
3、接种后封口膜和棉塞复原
注意事项：
过程：
1、接种环烧灼；
2、接种环在菌种斜面培养基上冷却；
3、挑取少许菌种接种到灭菌后的液体培养基中；
4、37℃摇床(每分钟200转)震荡培养12h
二、实验内容
（四）实验步骤：
3、大肠杆菌的扩大培养：
分离方法：
划线分离法和涂布分离法
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。
涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，并在培养基表面形成单个细胞繁殖而成的子细胞群体——菌落
目的：
两种分离方法的优缺点：
单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
分离标准：
出现不连续的单个菌落
二、实验内容
（四）实验步骤：
4、大肠杆菌的分离：
本实验采用的是划线分离法
划线分离法
通过接种环在固体培养基表面划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
原理：
在数次划线后，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，即菌落。
含义：
操作方法：
注意事项：
1、接种环只蘸一次菌液。
2、每次划线之前接种环都需灼烧灭菌，划线操作结束仍需灼烧接种环。
3、灼烧的接种环要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
4、划线时最后一区域不要与第一区域相连。
5、画线用力大小要适当，防止将培养基划破。
交叉划线法和连续划线法
思考
灼烧接种环
冷却
划线(第一区域)
蘸取菌液
灼烧接种环
冷却
灼烧接种环
平板倒置放置培养(37℃
，12-24h)
划线(第二区域)
灼烧接种环
冷却
划线(第三区域)
灼烧接种环
冷却
划线(第四区域)
第一次灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。
每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单菌落。
划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
1、第一次划线及每次划线之前都需灼烧接种环，划线操作结束仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的是什么？
思考：
2、在作第二次以及其后的划线操作时，为什么要从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
一是一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。
3、为什么平板划线时不能划破培养基表面？
涂布分离法
是指先将培养的菌液稀释一定的倍数，然后取一定量稀释液(0.1ml)加在固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上。
含义：
1、稀释操作时：每支试管及其中的9
mL水、移液管均需灭菌；操作时，试管口和移液管应在离火焰1～2
cm处。
2、涂布平板时：
①涂布器用70%酒精消毒，取出时，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适，移液管头不要接触任何物体。
操作方法：
注意事项：
梯度稀释
涂布分离
用移液管吸1mL菌液和9mL无
菌水混合，梯度稀释
移液管要灭菌，操作在火焰旁
0.1ml
二、实验操作
5、菌种的纯化与保藏：
——斜面保藏
将单菌落用接种环取出，再用划线法接种到试管的固体斜面培养基上，37℃培养24h，当菌落长成后，将试管置于4℃冰箱保存。
（四）实验步骤：
小结
1.配制LB培养基
3.倒平板
4.接种扩大培养
1.
培养基冷却
2.
接种环烧灼
3.
接种环在菌种斜面培养基上冷却
4.
挑取菌种接种到液体培养基中
5.
37℃摇床震荡培养12h
5.平板划线分离
3.37℃培养24h
4.4℃保存
1.挑取单菌落菌种
2.斜面连续划线
实验过程小结：
1.只蘸菌液1次
2.连续划线
3.37℃培养
12-24h
思考
思考与练习：
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒；
(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌；
(3)实验操作应在酒精灯火焰旁进行；
(4)操作时应避免已灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。
2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?
(1)从菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等，这是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
(2)用显微镜观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌关键指标。
(3)上述方法较难区别同类的不同物种，需借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法、观察有无鞭毛、孢子的形态、孢子着生方式等。
3.进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置?
恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。
4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤（特别是培养基）；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃
5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的大肠杆菌所污染?
转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经过改造的，通常含有抗性基因，所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进行培养。