选修一 第四部分 实验13 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定教学 课件 (32张PPT)浙科版
文档属性
| 名称 | 选修一 第四部分 实验13 PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定教学 课件 (32张PPT)浙科版 |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 21.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 浙科版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2021-01-07 16:56:33 | ||
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文档简介
-是一种体外扩增特定基因或DNA序列的技术
PCR技术-聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction）
PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
实验原理
{21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0}
体内DNA复制
体外DNA复制
模板
亲代DNA
原料
4种脱氧核苷酸（dNTP）
酶
解旋酶
DNA聚合酶 DNA连接酶
引物
RNA
√
√
X
√
X
DNA
卡里·穆利斯（Kary Mullis）
1944年生于美国。
1983年发明了PCR技术
1976，錢嘉韻从Thermus Aquaticus成功分离出嗜热DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶,最适温度为72℃，在95℃仍具有酶活性。
{21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0}
体外DNA复制
模板
亲代DNA
原料
4种脱氧核苷酸（dNTP）
酶
Taq DNA聚合酶
引物
DNA
核糖体DNA部分片段示意图
酵母细胞中编码核糖体18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3个DNA序列，中间相隔2个内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer），简称ITS。成熟的核糖体RNA中不包括ITS序列。
广泛存在于真菌中，多样性程度较高
常用于鉴定病原真菌，选择酿酒酵母菌株，通过测序和比对PCR产物序列推测亲缘关系
电泳
电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。
琼脂糖是从红色海藻中提取的多糖聚合物，加热熔化后再冷却能凝结形成凝胶。
核酸是带有负电的生物大分子，在电场作用下会向正电极迁移。在电场强度一定时，核酸分子越大迁移速率越慢。
凝胶电泳是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。
DNA标准溶液（marker）是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中用做确定DNA片段长度的参照物。
Trans2K Marker Trans5K Marker
染色
亚甲基蓝（又名“亚甲蓝”）可以将无色的DNA染成蓝色。
75%的乙醇和蒸馏水对凝胶进行脱色。
实验目的
简述PCR技术的原理，说出PCR扩增过程。尝试用PCR仪扩增酵母菌rDNA部分片段的实验操作。
尝试用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测的基本操作。
关注PCR技术的应用，认同现代生物技术的价值。
材料用具
材料 酵母细胞悬液：称取0.1 g食用高活性干酵母（酿酒酵母），放于盛有100 mL无菌蒸馏水的三角瓶中。在温暖的环境下活化2小时。
PCR相关试剂
双蒸水(ddH2O)
10×扩增缓冲液(PCR buffer)
10 mmol/L dNTP
10μmol/L引物A溶液
10μmol/L引物B溶液
Taq DNA 聚合酶
电泳相关试剂
Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液
市售6×上样缓冲液（loading buffer）：内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入上样孔内；还含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝的迁移速率与小片段DNA相近。
市售DNA标准溶液（Marker）
染色相关试剂
0.1% 亚甲基蓝溶液：称取0.1 g 亚甲基蓝溶于100 mL 蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛,避光保存。
75% 乙醇
藏于4℃冰箱的蒸馏水
(或使用0.002% 亚甲基蓝溶液：将2 mL 的0.1% 亚甲基蓝溶液加入10 mL电泳缓冲液中,再加88 mL蒸馏水，避光保存。)
实验用具
PCR仪、琼脂糖凝胶电泳设备（含梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪电源）、微量移液器及枪头、微量离心管、培养皿、三角瓶、封口膜、橡皮筋、冰盒、记号笔、三脚架、微波炉（枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌）
PCR反应
凝胶电泳
制备琼脂糖凝胶
加样
跑电泳
染色
观察
实验步骤
实验流程图
1. PCR反应
PCR反应体系
PCR反应条件流程图
预变性 95 ℃ 10 min
↓
变性 95 ℃ 1 min
↓
退火 55 ℃ 1 min
↓
延伸 72 ℃ 1 min
↓
延伸 72 ℃ 10 min
循环33次
梳子
模具
熔化的琼脂糖
琼脂糖
凝胶
加样孔
2.凝胶电泳
制备琼脂糖凝胶
用微量移液器向50μL PCR产物中加入10μL 6×上样缓冲液（Loading buffer），并反复吹吸混合均匀。将10 μL样品混合液缓慢加到加样孔内。
加样
电泳仪电源
电泳槽
琼脂糖凝胶
正极
负极
样品
DNA迁移方向
电压80 V，电泳20~30 min。
跑电泳
倒入0.1% 亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5 mm，染色8 min。凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。
75%乙醇脱色1min,
不断晃动培养皿。
3. 染色
*替换染色方法：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002% 亚甲基蓝溶液，并没过凝胶。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。
冷蒸馏水脱色。可更换被染蓝的蒸馏水。
4. 观察
实验结果与分析
加样孔
DNA条带
Marker
20 μL
10 μL
DNA
迁
移
方
向
对照
加样孔
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
Marker
20 μL
10 μL 对照
实验结果局部放大照片
PCR
产物
条带
测量DNA条带迁移距离
Marker 2000
PCR产物
DNA片段长度（bp）
2000
1000
750
500
?
迁移距离（cm）
DNA片段长度与迁移距离曲线图
实验结果
加样孔
DNA条带
Marker
20 μL
10 μL
DNA
迁
移
方
向
对照
Marker 5000实验结果
加样孔
5000 bp
3000 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
800 bp
Marker
20 μL
10 μL
500 bp
对照
300 bp
PCR
产物
条带
谢谢大家~
PCR技术-聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction）
PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定
实验原理
{21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0}
体内DNA复制
体外DNA复制
模板
亲代DNA
原料
4种脱氧核苷酸（dNTP）
酶
解旋酶
DNA聚合酶 DNA连接酶
引物
RNA
√
√
X
√
X
DNA
卡里·穆利斯（Kary Mullis）
1944年生于美国。
1983年发明了PCR技术
1976，錢嘉韻从Thermus Aquaticus成功分离出嗜热DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶,最适温度为72℃，在95℃仍具有酶活性。
{21E4AEA4-8DFA-4A89-87EB-49C32662AFE0}
体外DNA复制
模板
亲代DNA
原料
4种脱氧核苷酸（dNTP）
酶
Taq DNA聚合酶
引物
DNA
核糖体DNA部分片段示意图
酵母细胞中编码核糖体18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3个DNA序列，中间相隔2个内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer），简称ITS。成熟的核糖体RNA中不包括ITS序列。
广泛存在于真菌中，多样性程度较高
常用于鉴定病原真菌，选择酿酒酵母菌株，通过测序和比对PCR产物序列推测亲缘关系
电泳
电泳是指带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极迁移的过程。
琼脂糖是从红色海藻中提取的多糖聚合物，加热熔化后再冷却能凝结形成凝胶。
核酸是带有负电的生物大分子，在电场作用下会向正电极迁移。在电场强度一定时，核酸分子越大迁移速率越慢。
凝胶电泳是分离、鉴定、纯化核酸和蛋白质的常用方法。
DNA标准溶液（marker）是一组已知长度和含量的标准DNA片段混合物，在电泳中用做确定DNA片段长度的参照物。
Trans2K Marker Trans5K Marker
染色
亚甲基蓝（又名“亚甲蓝”）可以将无色的DNA染成蓝色。
75%的乙醇和蒸馏水对凝胶进行脱色。
实验目的
简述PCR技术的原理，说出PCR扩增过程。尝试用PCR仪扩增酵母菌rDNA部分片段的实验操作。
尝试用琼脂糖凝胶电泳技术对PCR扩增产物进行检测的基本操作。
关注PCR技术的应用，认同现代生物技术的价值。
材料用具
材料 酵母细胞悬液：称取0.1 g食用高活性干酵母（酿酒酵母），放于盛有100 mL无菌蒸馏水的三角瓶中。在温暖的环境下活化2小时。
PCR相关试剂
双蒸水(ddH2O)
10×扩增缓冲液(PCR buffer)
10 mmol/L dNTP
10μmol/L引物A溶液
10μmol/L引物B溶液
Taq DNA 聚合酶
电泳相关试剂
Tris-硼酸（TBE）电泳缓冲液
市售6×上样缓冲液（loading buffer）：内含甘油可以增加样品密度，确保DNA能够沉入上样孔内；还含有少许溴酚蓝作为电泳指示剂，电泳时溴酚蓝的迁移速率与小片段DNA相近。
市售DNA标准溶液（Marker）
染色相关试剂
0.1% 亚甲基蓝溶液：称取0.1 g 亚甲基蓝溶于100 mL 蒸馏水中。避免接触皮肤和眼睛,避光保存。
75% 乙醇
藏于4℃冰箱的蒸馏水
(或使用0.002% 亚甲基蓝溶液：将2 mL 的0.1% 亚甲基蓝溶液加入10 mL电泳缓冲液中,再加88 mL蒸馏水，避光保存。)
实验用具
PCR仪、琼脂糖凝胶电泳设备（含梳子、胶盒、水平电泳槽和电泳仪电源）、微量移液器及枪头、微量离心管、培养皿、三角瓶、封口膜、橡皮筋、冰盒、记号笔、三脚架、微波炉（枪头、微量离心管使用前需进行高压蒸汽灭菌）
PCR反应
凝胶电泳
制备琼脂糖凝胶
加样
跑电泳
染色
观察
实验步骤
实验流程图
1. PCR反应
PCR反应体系
PCR反应条件流程图
预变性 95 ℃ 10 min
↓
变性 95 ℃ 1 min
↓
退火 55 ℃ 1 min
↓
延伸 72 ℃ 1 min
↓
延伸 72 ℃ 10 min
循环33次
梳子
模具
熔化的琼脂糖
琼脂糖
凝胶
加样孔
2.凝胶电泳
制备琼脂糖凝胶
用微量移液器向50μL PCR产物中加入10μL 6×上样缓冲液（Loading buffer），并反复吹吸混合均匀。将10 μL样品混合液缓慢加到加样孔内。
加样
电泳仪电源
电泳槽
琼脂糖凝胶
正极
负极
样品
DNA迁移方向
电压80 V，电泳20~30 min。
跑电泳
倒入0.1% 亚甲基蓝溶液，没过凝胶约5 mm，染色8 min。凝胶下表面与培养皿之间，不要留有气泡。
75%乙醇脱色1min,
不断晃动培养皿。
3. 染色
*替换染色方法：向盛有凝胶的培养皿中倒入0.002% 亚甲基蓝溶液，并没过凝胶。盖上培养皿盖，4℃冷藏过夜。
冷蒸馏水脱色。可更换被染蓝的蒸馏水。
4. 观察
实验结果与分析
加样孔
DNA条带
Marker
20 μL
10 μL
DNA
迁
移
方
向
对照
加样孔
2000 bp
1000 bp
750 bp
500 bp
250 bp
100 bp
Marker
20 μL
10 μL 对照
实验结果局部放大照片
PCR
产物
条带
测量DNA条带迁移距离
Marker 2000
PCR产物
DNA片段长度（bp）
2000
1000
750
500
?
迁移距离（cm）
DNA片段长度与迁移距离曲线图
实验结果
加样孔
DNA条带
Marker
20 μL
10 μL
DNA
迁
移
方
向
对照
Marker 5000实验结果
加样孔
5000 bp
3000 bp
2000 bp
1500 bp
1000 bp
800 bp
Marker
20 μL
10 μL
500 bp
对照
300 bp
PCR
产物
条带
谢谢大家~