3.1DNA重组技术的基本工具 课件【新教材】2020-2021学年人教版（2019）高二生物选择性必修三（54张PPT）
文档属性
| 名称 | 3.1DNA重组技术的基本工具 课件【新教材】2020-2021学年人教版（2019）高二生物选择性必修三（54张PPT） |  | |
| 格式 | pptx | ||
| 文件大小 | 5.8MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（2019） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2021-02-22 06:52:34 | ||
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文档简介
章引言
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外____________和____________等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。
例如，通过转基因技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是_______________，受体细胞是________________，目的基因的表达产物是____________。
DNA重组
转基因
DNA重组
人胰岛素基因
大肠杆菌细胞
人胰岛素
2021人教版（新教材）必修二 遗传和进化
第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
本节聚焦
重组DNA技术所需要的三种基本工具是什么？他们的作用是什么?
基因工程载体需要具备什么条件？
DNA重组技术的基本工具是什么？
将DNA分子导入细胞
准确切割DNA分子
连接DNA片段
⒈主要来源：
主要从原核生物中分离纯化
思考
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
⒉ 种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
SmaⅠ
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
EcoRⅠ
3.作用特点
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
例如：
大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，
（2）在特定的位点切割DNA分子。
并在G和A之间切开。
——特异性
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
4、作用：
特定部位的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键断开
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
5、结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
1.已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
能
不一定能
牛刀小试
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
EcoRⅠ
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
不同来源的DNA片段混合
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
生物A基因片段
生物B基因片段
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC……
……CTTAA G……
酶切
?
过渡
1.DNA连接酶的作用是：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被________切开的两个__________之间的____________。
限制酶
核苷酸
磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}类型
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
____________
____________
功能
只缝合____________
缝合____________和____________
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
2.种类
DNA聚合酶
DNA连接酶
模板
作用底物
作用特点
相同点
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
形成磷酸二酯键
以一条DNA链为模板，将单个核苷酸连接成一条互补的DNA链
将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板
需要
不需要
单个脱氧核苷酸
DNA分子片段
?
与DNA相关的五种酶的比较
{616DA210-FB5B-4158-B5E0-FEB733F419BA} 名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
拓展延伸
关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是
A.①与③是由相同限制酶切割产生的
B.DNA连接酶可催化①与③的连接
C.经酶切形成④需要脱去2分子水
D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
B
牛刀小试
通常是利用______作为载体，将目的
基因送入受体细胞中。质粒是一种裸露的、
结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具
有__________能力的很小的双链_____DNA
分子。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有
____________、_____________________等。
质粒
自我复制
环状
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
DNA聚合酶的识别和结合位点
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
质粒作为运载体的条件：
①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，便于_____________________；
②质粒含有复制原点，可在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞______________；
③质粒DNA分子上有特殊的____________，
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，
供重组DNA的____________。
外源DNA片段
（目的基因）插入
染色体DNA上
标记基因
鉴定和选择
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。
敏感
不能
表达产物
如何利用标记基因的筛选呢？
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
牛刀小试
DNA的粗提取与鉴定
探究和实践
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、基础知识
1.DNA的溶解性
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
利用这一特点，
选择适当的盐浓度
就能使DNA充分溶解，
而使杂质沉淀；
或者让其他成分溶解，
DNA析出
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
1.DNA的溶解性
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，将DNA与蛋白质进一步分离。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
① 蛋白酶——水解蛋白质，
对DNA没有影响
② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃
而DNA在80℃以上才会变性
③ 洗涤剂——瓦解细胞膜，
但对DNA没有影响
1.DNA的溶解性
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
试剂：
条件：
二苯胺
沸水浴条件下，
DNA与二苯胺反应呈现蓝色
沸水浴
现象：
（三）DNA的鉴定
一、基础知识
（一）实验材料的选取
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
（三）除去滤液中的杂质(纯化)
（四）DNA的析出与鉴定
二、实验设计
（一）实验材料的选取
从下列材料中选取2～3种
原则：
菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）
思考：
不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核。
二、实验设计
材料：
能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？
动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1.动物细胞
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
二、实验设计
讨论1：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1.植物细胞
二、实验设计
②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
①植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
讨论2：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
1.搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA ）
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
2.这个步骤过滤获得什么？
获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）
3.滤液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
二、实验设计
问题探讨：
DNA的溶解性
（三）除去滤液中的杂质
方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。
思考1：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
思考2：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？
含DNA的滤液
思考3：这一步过滤的目的是？
获得含DNA的滤液，除去不溶的杂质
二、实验设计
思考4：加蒸馏水的目的是？
调节NaCl溶液物质的量为接近0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
思考5：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）
稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
思考6：这一步过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L的NaCl溶液，获得什么？
获得DNA黏稠物（ 纱布上的DNA黏稠物）
思考7：过滤的目的？
获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质
（三）除去滤液中的杂质
二、实验设计
方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。
为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
1.用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
2.用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
二、实验设计
讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，
使提取的DNA与蛋白质分开；
方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，
使蛋白质变性，与DNA分离
（三）除去滤液中的杂质
二、实验设计
（四）DNA的析出与鉴定
1.DNA的析出
思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
二、实验设计
加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：
一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml
⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解
⑶ 向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml
⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min
⑸ 待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化。
观察现象：
溶解丝状物的溶液变为蓝色
（四）DNA的析出与鉴定
2.DNA的鉴定
二、实验设计
原理：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色物质。
（四）DNA的析出与鉴定
2.DNA的鉴定
二、实验设计
思考：可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是DNA吗？
不可以，甲基绿同样会和RNA结合呈绿色！
1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
三、操作提示
二苯胺试剂的配制
称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备
四、结果分析与评价
（一）是否提取出了DNA
（二）分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
获得含核物质的滤液
⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液
获取纱布上的DNA粘稠物
⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液
得到含DNA的滤液
1.本实验中有三次过滤 ,获得什么？
问题总结
第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
第二次搅拌加2mol/L NaCl溶液的滤液
目的是使DNA充分溶解在2mol/ LNaCl溶液中
第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/L NaCl溶液
稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
第四次搅拌放入2mol/L NaCl溶液中纱布上的粘稠物
使DNA黏稠物充分溶解在2mol/L NaCl溶液中
第五次搅拌体积分数为95%的酒精
2.实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
问题总结
3.本实验两次用蒸馏水
第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
4.本实验两次析出DNA
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质
第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA（利用DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）
问题总结
第二次：调节NaCl溶液物质的量为0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
实验成功的关键及注意事项
1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min
2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用
3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子
4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失
1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够
实验现象不明显的原因分析
2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏
3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果
4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果
5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）
谢谢
基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外____________和____________等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做__________技术。
例如，通过转基因技术，可以实现利用大肠杆菌生产人的胰岛素。在此实例中，目的基因是_______________，受体细胞是________________，目的基因的表达产物是____________。
DNA重组
转基因
DNA重组
人胰岛素基因
大肠杆菌细胞
人胰岛素
2021人教版（新教材）必修二 遗传和进化
第三章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具
本节聚焦
重组DNA技术所需要的三种基本工具是什么？他们的作用是什么?
基因工程载体需要具备什么条件？
DNA重组技术的基本工具是什么？
将DNA分子导入细胞
准确切割DNA分子
连接DNA片段
⒈主要来源：
主要从原核生物中分离纯化
思考
根据你所掌握的知识你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA使之失效，从而达到保护自身的目的。
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
⒉ 种类与命名：
现在已经从约300种微生物中分离出了约4000种限制性内核酸切酶(限制酶)。
练习：流感嗜血杆菌的d菌株( Haemophilus influenzae d )中先后分离到3种限制酶，则分别命名为:
HindⅠ、HindⅡ、 HindⅢ
粘质沙雷氏杆菌
（Serratia marcesens）
SmaⅠ
大肠杆菌
（Escherichia coli R）
EcoRⅠ
3.作用特点
（1）识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列
例如：
大肠杆菌的EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC序列，
（2）在特定的位点切割DNA分子。
并在G和A之间切开。
——特异性
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
4、作用：
特定部位的两个核苷酸之间的
磷酸二酯键断开
?
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
5、结果：
产生黏性末端或平末端
一、限制性核酸内切酶 ——分子手术刀
大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,少数的识别序列由4、5或8个核苷酸组成
1.已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。
（1）则能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；
（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。
能
不一定能
牛刀小试
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
EcoRⅠ
……GAATTC……
……CTTAAG……
……GAATTC……
……CTTAAG……
不同来源的DNA片段混合
如何将不同种来源的DNA片段连接起来？
生物A基因片段
生物B基因片段
……G AATTC……
……CTTAA G……
……G AATTC……
……CTTAA G……
酶切
?
过渡
1.DNA连接酶的作用是：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被________切开的两个__________之间的____________。
限制酶
核苷酸
磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
{5940675A-B579-460E-94D1-54222C63F5DA}类型
E·coli DNA连接酶
T4DNA连接酶
来源
____________
____________
功能
只缝合____________
缝合____________和____________
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的_________________
大肠杆菌
T4噬菌体
黏性末端
黏性末端
平末端
磷酸二酯键
二、DNA连接酶 ——分子缝合针
2.种类
DNA聚合酶
DNA连接酶
模板
作用底物
作用特点
相同点
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?
形成磷酸二酯键
以一条DNA链为模板，将单个核苷酸连接成一条互补的DNA链
将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板
需要
不需要
单个脱氧核苷酸
DNA分子片段
?
与DNA相关的五种酶的比较
{616DA210-FB5B-4158-B5E0-FEB733F419BA} 名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间
的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
拓展延伸
关于下图所示黏性末端的叙述，正确的是
A.①与③是由相同限制酶切割产生的
B.DNA连接酶可催化①与③的连接
C.经酶切形成④需要脱去2分子水
D.DNA连接酶与DNA聚合酶均能作用于上述黏性末端
B
牛刀小试
通常是利用______作为载体，将目的
基因送入受体细胞中。质粒是一种裸露的、
结构简单、独立于细菌拟核DNA之外，并具
有__________能力的很小的双链_____DNA
分子。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有
____________、_____________________等。
质粒
自我复制
环状
λ噬菌体的衍生物
动植物病毒
DNA聚合酶的识别和结合位点
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
质粒作为运载体的条件：
①质粒DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点，便于_____________________；
②质粒含有复制原点，可在受体细胞中进行自我复制，或整合到受体细胞______________；
③质粒DNA分子上有特殊的____________，
如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等，
供重组DNA的____________。
外源DNA片段
（目的基因）插入
染色体DNA上
标记基因
鉴定和选择
三、基因进入细胞的载体——分子运输车
普通的细菌一般是对抗生素______（敏感/不敏感）的，在含有青霉素或四环素的培养基中______（能/不能）生长。如果给普通细菌导入一个含有四环素抗性基因的质粒，四环素抗性基因的____________可使细菌获得抵抗四环素的性状。
敏感
不能
表达产物
如何利用标记基因的筛选呢？
图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。
（1）上述操作中不宜选用Sma I，原因是Sma I会破坏__________和_____________。
（2）在基因工程的操作中，不宜选用EcoR I，原因是用EcoR I切割外源DNA片段后，__________________________________________________。
目的基因
抗性基因
目的基因只有一侧含有黏性末端，不能插入到质粒中
牛刀小试
DNA的粗提取与鉴定
探究和实践
（一）提取DNA的方法
1.提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子
2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）
利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
一、基础知识
1.DNA的溶解性
DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
利用这一特点，
选择适当的盐浓度
就能使DNA充分溶解，
而使杂质沉淀；
或者让其他成分溶解，
DNA析出
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
1.DNA的溶解性
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出
在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
此外，DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，将DNA与蛋白质进一步分离。
2.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
① 蛋白酶——水解蛋白质，
对DNA没有影响
② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃
而DNA在80℃以上才会变性
③ 洗涤剂——瓦解细胞膜，
但对DNA没有影响
1.DNA的溶解性
（二）DNA等大分子的理化性质
一、基础知识
试剂：
条件：
二苯胺
沸水浴条件下，
DNA与二苯胺反应呈现蓝色
沸水浴
现象：
（三）DNA的鉴定
一、基础知识
（一）实验材料的选取
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
（三）除去滤液中的杂质(纯化)
（四）DNA的析出与鉴定
二、实验设计
（一）实验材料的选取
从下列材料中选取2～3种
原则：
菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌
凡是含有DNA的生物材料都可以考虑,但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大。
新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）
思考：
不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核。
二、实验设计
材料：
能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？
动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1.动物细胞
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
二、实验设计
讨论1：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
1.植物细胞
二、实验设计
②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
①植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
讨论2：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
1.搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA ）
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
2.这个步骤过滤获得什么？
获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用3——4层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）
3.滤液中可能含有哪些细胞成分？
可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理）
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液
二、实验设计
问题探讨：
DNA的溶解性
（三）除去滤液中的杂质
方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。
思考1：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？
目的是使DNA充分溶解
思考2：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？
含DNA的滤液
思考3：这一步过滤的目的是？
获得含DNA的滤液，除去不溶的杂质
二、实验设计
思考4：加蒸馏水的目的是？
调节NaCl溶液物质的量为接近0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
思考5：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）
稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
思考6：这一步过滤含DNA黏稠物的0．14mol/L的NaCl溶液，获得什么？
获得DNA黏稠物（ 纱布上的DNA黏稠物）
思考7：过滤的目的？
获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质
（三）除去滤液中的杂质
二、实验设计
方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。
为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
1.用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；
2.用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。
因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。
二、实验设计
讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？
方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，
使提取的DNA与蛋白质分开；
方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，
使蛋白质变性，与DNA分离
（三）除去滤液中的杂质
二、实验设计
（四）DNA的析出与鉴定
1.DNA的析出
思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌)
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
二、实验设计
加入与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95％)，静置2－3min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取的DNA
用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水
冷却的酒精溶液(体积分数95％)作用：
一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；
二是低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。
⑴ 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液5ml
⑵ 其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解
⑶ 向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml
⑷ 混匀后，置于沸水浴中加热5min
⑸ 待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化。
观察现象：
溶解丝状物的溶液变为蓝色
（四）DNA的析出与鉴定
2.DNA的鉴定
二、实验设计
原理：DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂反应生成蓝色物质。
（四）DNA的析出与鉴定
2.DNA的鉴定
二、实验设计
思考：可以单独用甲基绿鉴定某种物质是否是DNA吗？
不可以，甲基绿同样会和RNA结合呈绿色！
1.以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
三、操作提示
二苯胺试剂的配制
称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。
观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备
四、结果分析与评价
（一）是否提取出了DNA
（二）分析DNA中的杂质
本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
⑴过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
获得含核物质的滤液
⑵过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液
获取纱布上的DNA粘稠物
⑶过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液
得到含DNA的滤液
1.本实验中有三次过滤 ,获得什么？
问题总结
第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
第二次搅拌加2mol/L NaCl溶液的滤液
目的是使DNA充分溶解在2mol/ LNaCl溶液中
第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/L NaCl溶液
稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物
第四次搅拌放入2mol/L NaCl溶液中纱布上的粘稠物
使DNA黏稠物充分溶解在2mol/L NaCl溶液中
第五次搅拌体积分数为95%的酒精
2.实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?
卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA
问题总结
3.本实验两次用蒸馏水
第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA
4.本实验两次析出DNA
第一次：用0.14 mol／L 的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质
第二次：用冷却的95％的酒精，获得含杂质较少的DNA（利用DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）
问题总结
第二次：调节NaCl溶液物质的量为0．14mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出
实验成功的关键及注意事项
1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min
2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用
3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子
4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基业带电荷而被吸附于玻璃表面，故实验中用塑料杯和试管可减少损失
1.材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够
实验现象不明显的原因分析
2.加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏
3.二苯胺配制时间过长，变成浅蓝色，影响鉴定效果
4.析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水一次快速加入，影响实验结果
5.实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，操作时不注意区分，影响实验结果（注意：搅拌都沿一个方向进行）
谢谢