第2节 微生物的培养技术及应用
一 微生物的基本培养技术
必备知识·素养奠基
一、培养基的配制
1.培养基的概念:人们按照微生物对营养物质的不同需求,配制出供其生长繁殖的营养基质——培养基,用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
2.培养基的分类:按照物理性质不同分为两类。
(1)液体培养基:呈液体状态的培养基,不加入凝固剂(如琼脂)。
(2)固体培养基:呈固体状态的培养基,加入凝固剂(如琼脂)。
3.营养组成:各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐,此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
4.培养基特殊需求:
(1)培养乳酸杆菌时,在培养基中添加维生素。
(2)培养霉菌时,将培养基调至酸性。
(3)培养细菌时,将培养基调至中性或弱碱性。
(4)培养厌氧微生物时,需要提供无氧的条件。
有同学认为液体培养基含有水,而固体培养基是没有水的,这种想法对吗?为什么?
提示:不对。液体培养基和固体培养基都含有水分,它们的区别为是否添加凝固剂。
二、无菌技术
1.无菌技术关键:防止杂菌污染。
2.消毒与灭菌:
(1)概念:
①消毒:使用较为温和的物理、化学或生物等方法仅杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
②灭菌:使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子)。
(2)类型与方法:
连一连:将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。
在无菌技术中,为什么许多实验操作都要在酒精灯火焰附近进行?
提示:酒精灯火焰周围温度高,细菌少,甚至无菌,这样可以避免周围环境中微生物的污染。
三、微生物的纯培养
1.微生物纯培养的概念:由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,获得纯培养物的过程就是纯培养。
2.酵母菌的纯培养:
(1)纯培养的原理:设法在培养基上得到由单个微生物繁殖形成的纯培养物(单菌落)。
(2)纯培养方法:平板划线法和稀释涂布平板法。
(3)纯培养过程:
①制备培养基:配制培养基→灭菌→倒平板
②接种和分离酵母菌:用平板划线法在马铃薯培养基表面接种酵母菌。下列接种过程正确的顺序是baefcgd
③培养酵母菌:待菌液被培养基吸收,将接种后的平板和一个未接种的平板倒置,放入28
℃左右恒温箱中培养24～48h。
(4)结果分析与评价:
结合酵母菌纯培养的过程,判断下列分析的正误:
①未接种的平板上没有菌种,此实验没有必要培养。
(×)
提示:培养未接种的平板起到对照作用,可以检验培养基的制备是否合格。
②在未接种的培养基表面长出了菌落,说明培养基制备不合格。
(√)
③若无菌操作合格,在接种酵母菌的培养基上应观察到不同形态、不同颜色的酵母菌菌落。
(×)
提示:应该是观察到形态、颜色一致的酵母菌单菌落。
④如果将酵母菌放置在35
℃恒温箱中培养,相同时间后观察,菌落会比28
℃
条件下的大,数量多。
(×)
提示:酵母菌适宜生长温度为28
℃,35
℃条件下由于温度较高,酵母菌生长慢。
⑤某同学使用平板划线法纯化酵母菌,培养48
h后,只在培养基的第一划线区域长出密集的菌落,其他区域未长出菌落,可能是这位同学第二次灼烧接种环未冷却就直接划线导致的。
(√)
将接种后的平板放在恒温培养箱中培养有必要吗?为什么?
提示:有必要。恒温培养箱可以提供微生物生长的适宜温度。
关键能力·素养形成
知识点一 培养基的配制
1.培养基的成分及功能:
营养要素
来 源
功 能
碳源(提供碳元素的物质)
无机碳源
NaHCO3等含碳无机物
①构成细胞物质和一些代谢产物;②有机碳既是碳源又是能源
有机碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
氮源(提供氮元素的物质)
无机氮源
铵盐、硝酸盐等
将无机氮合成含氮的代谢产物
有机氮源
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
生长因子(生长必不可少的微量有机物)
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分;②参与代谢过程中的酶促反应
水
外界摄入
①良好的溶剂②维持生物大分子结构的稳定
无机盐
无机物
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素
【特别提醒】有关培养基营养物质的三点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)微生物需要补充生长因子,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(3)微生物需要量最大的是碳源。能合成含碳有机物的是自养型,反之则为异养型。
2.培养基的种类:
分类标准
培养基种类
培养基特点
作 用
物理性质
固体培养基
加凝固剂,如琼脂
微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种
半固体培养基
容器放倒不致流出,剧烈震动则破散
观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基
不加凝固剂
常用于工业生产
功能
选择培养基
根据某种微生物的特殊营养要求配制
选择、分离
鉴别培养基
加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂
鉴定
成分来源
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
用已知的化学物质配制
分类鉴定
微生物种类繁多,培养条件也各不相同。下列关于微生物培养基的描述正确的是
( )
A.同一物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量,氮源有些也能提供能量
C.牛肉膏蛋白胨培养基是培养细菌、病毒等常用的培养基
D.培养硝化细菌,可用无机碳源的培养基
【解题导引】
【解析】选D。对异养微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是氮源,如牛肉膏,A错误;有机碳源能提供能量,无机碳源不能提供能量,有些氮源也能提供能量,B错误;病毒必须寄生在活细胞内才能生活,不能用普通培养基培养,必须先培养细胞再培养病毒,C错误;硝化细菌是自养微生物,可以通过化能合成作用合成含碳有机物,D正确。
【误区警示】微生物的碳源、氮源和能源物质的两个认识“误区”
(1)误认为所有碳源和氮源都可提供能量:有机碳源和有机氮源是异养微生物的能源物质。
(2)误认为所有微生物的能源都是有机碳源:自养微生物的碳源一般是CO2,光能自养微生物的能源是光能,例如蓝细菌等;化能自养微生物的能源是化学物质,例如硝化细菌的能源物质是NH3。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与推理
结合病毒的特点,试分析如何培养病毒,写出简要思路。
提示:可以先在特定培养基上培养病毒的宿主细胞,然后让病毒侵染宿主细胞,从而达到培养病毒的目的。
(2)科学思维——演绎与推理
结合相关知识,判断下面培养基的各种成分能提供的营
养物质类别:
成分
蔗糖
(NH4)2SO4
FeSO4
维生素
提供的营养
____?
____?
____?
____?
提示:碳源 氮源(无机盐) 无机盐 生长因子
【素养·迁移】
下表是某微生物培养基成分,请据此回答:
编号
成分
含量
①
粉状硫
10
g
②
(NH4)2SO4
0.4
g
③
K2HPO4
4.0
g
④
MgSO4
9.25
g
⑤
FeSO4
0.5
g
⑥
CaCl2
0.5
g
⑦
H2O
100
mL
(1)上表培养基可培养的微生物类型是__________________________。?
(2)若除去成分②,加入(CH2O),该培养基可用于培养________________。?
(3)表中营养成分共有________类。?
(4)不论何种培养基,在各种成分都溶化后分装前,要进行的是________________________。?
(5)若上表培养基用于菌种鉴定,应该增加的成分是________________。?
【解析】(1)由题表可知,该培养基中没有碳源,说明培养的微生物是从外界环境中获取碳源的,因此培养的微生物是自养型微生物。
(2)该培养基若加入(CH2O),培养基中就有了碳源,但除去成分②,培养基中就没有了氮源,该培养基就只能用于培养固氮微生物。
(3)题表中的营养物质有水、无机盐、无机氮源三类,缺乏碳源和特殊营养物质。
(4)微生物生长需要一定的pH,所以培养基装瓶前需要调节pH。
(5)该培养基中无凝固剂,为液体培养基。菌种的纯化和鉴定通常利用固体平板培养基以获得单细胞菌落,因此需要加入凝固剂,如琼脂,将液体培养基转变成固体培养基。
答案:(1)自养型微生物
(2)固氮微生物
(3)3 (4)调节pH
(5)琼脂(或凝固剂)
【补偿训练】
下列关于培养基的叙述,错误的是
( )
A.氮源、无机盐、水等是微生物生长不可缺少的营养物质
B.根据微生物自身的特点,使用不同碳源的培养基
C.可在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾,用于维持pH的相对稳定
D.若要将微生物扩大培养,应使用固体培养基
【解析】选D。微生物的营养物质主要有碳源、氮源、无机盐、水和生长因子,A正确;根据微生物自身的特点,使用含不同碳源的培养基,例如培养自养型的细菌,在培养基中不需加入碳源,B正确;微生物培养基调节pH时可以用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾,C正确;若要将微生物扩大培养,一般用液体培养基,D错误。
知识点二 无菌技术
1.无菌技术的概念:防止外来杂菌的入侵,并保持已灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法,称为无菌技术。
2.无菌技术的目的:
(1)可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
(2)有效避免操作者自身被微生物感染。
3.无菌技术的选择原则:
(1)考虑效果:灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力:活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法,而不能采用灭菌的方法。
4.无菌技术的方法——消毒与灭菌:
方法
条件
应用范围
消毒
煮沸消毒法
在100
℃下煮沸5～6min
一般物品,如家庭餐具等生活用品
巴氏消毒法
62～65
℃消毒30
min或80～90
℃处理30
s～1
min
一些不耐高温的液体,如牛奶、啤酒、果酒和酱油等
化学药物消毒法
70%～75%的酒精、碘酒、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液等
用于双手、皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等消毒
紫外线消毒法
30
W紫外灯照射30
min
接种室、接种箱、超净工作台
灭菌
灼烧灭菌
在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧
涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等;接种过程中的试管口或瓶口灭菌
干热灭菌
干热灭菌箱内160～170
℃下灭菌2～3
h
玻璃器皿、金属用具等不适宜用其他方法灭菌需要保持干燥和能耐高温的物品
湿热灭菌
高压蒸汽灭菌锅:100
kPa、121
℃条件下15～30
min灭菌
培养基及容器的灭菌
【特别提醒】消毒和灭菌的两点提醒
(1)作用原理是借助理化因素,通过使蛋白质变性来抑制微生物生命活动或杀死微生物。
(2)最根本区别是芽孢和孢子是否灭活,灭菌能杀死芽孢和孢子,因而灭菌更彻底。
防止杂菌入侵,获得纯净的培养物,是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是
( )
A.实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒
B.在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室时一定要洗手,以防止被微生物感染
C.接种环、接种针等金属用具,直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境
【解题导引】明确以下三个关键点:
(1)对操作空间消毒的方法:紫外线消毒、化学药物消毒。
(2)适于灼烧灭菌的物品:接种环、接种针等金属用具。
(3)防止微生物感染:做好自身防护,对使用后的培养基进行灭菌。
【解析】选C。为防止杂菌污染,研究和应用微生物时应进行消毒和灭菌,实验室可以用紫外线或化学药物进行消毒,A正确;在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室时一定要洗手,以防止被微生物感染,B正确;接种环、接种针等金属用具,直接在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰部位灼烧灭菌,C错误;使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境,D正确。
【方法规律】灼烧灭菌的适用范围和方法
(1)灼烧灭菌适用于接种工具和试管口、瓶口的灭菌。
(2)接种工具灼烧灭菌:用酒精灯外焰按顺序充分燃烧;试管口、瓶口灭菌:迅速通过酒精灯外焰。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
某同学在实验过程中不小心将灭菌的培养皿和未灭菌的培养皿混合了,那么这些培养皿还能用于实验吗?为什么?
提示:不能。已灭菌的材料物品不能与周围物品接触,以防止污染。所以这位同学应将培养皿再次灭菌后才能用于实验。
(2)科学思维——演绎与推理
题中A项的化学药物消毒时,某同学想酒精浓度越高,消毒效果可能越好,于是他就用了95%的酒精进行消毒,他的这种做法对吗?解释原因。
提示:不对。用酒精消毒时,体积分数为70%的酒精消毒效果最好,原因是浓度过高,菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜,酒精不能渗入其中。
【素养·迁移】
在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题:
(1)在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具__________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。?
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法,与煮沸消毒法相比,这两种方法的优点是?______________________________________________。?
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能__________。在照射前,适量喷洒____________________________,可强化消毒效果。?
(4)水厂供应的自来水通常是经过__________________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。?
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度,最可能的原因是?______________________________________。?
【解析】(1)玻璃和金属材质的实验器具可以通过干热灭菌的方法来灭菌。
(2)巴氏消毒法是在70～75
℃煮30
min或在80
℃下煮15
min,可以杀死牛奶中的微生物,并使牛奶的营养成分不被破坏;高温瞬时消毒是在较短的时间内利用高温杀死微生物,由于时间较短,营养物质损失较少。
(3)紫外线有消毒、灭菌的作用,在照射前,适量喷洒消毒液,可以强化消毒效果。
(4)自来水消毒通常采用“氯气”或“紫外线”等方法。
(5)使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,但没有达到相应温度,最可能的原因是锅内冷空气没有排尽。
答案:(1)可以
(2)在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少
(3)破坏DNA结构 消毒液
(4)氯气
(5)未将锅内冷空气排尽
【补偿训练】
高温灭菌的原理是
( )
A.每种微生物生长的最适温度是一定的
B.微生物对高温环境不适应
C.高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸,影响其生命活动
D.高温降低了环境中氧的浓度
【解析】选C。高温灭菌的目的是利用高温杀死包括芽孢和孢子在内的一切微生物。原理是高温能使细菌的蛋白质变性,同时破坏核酸的结构,从而影响其正常的生命活动。
知识点三 酵母菌的纯培养
1.制备马铃薯琼脂培养基:
(1)配制培养基:
(2)灭菌:培养基转移至锥形瓶,加棉塞,包上牛皮纸,如图所示,然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌,培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。
(3)倒平板:待培养基冷却到50
℃左右时,在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程:
【特别提醒】关于制备培养基的四点提醒
(1)如果需要调节培养基的pH,应该在定容完成后,灭菌之前进行操作。
(2)灭菌之后,倒平板时培养基的温度是50
℃左右。因为凝固剂琼脂在98
℃以上熔化,在44
℃以下凝固,倒平板时高于50
℃则会烫手,低于50
℃时若不能及时操作,琼脂会凝固。
(3)倒平板的整个操作在酒精灯火焰旁进行,避免杂菌的污染。
(4)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间,否则此培养基不能用来培养微生物,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2.平板划线法接种和分离酵母菌:
(1)平板划线法:通过接种环在固体培养基表面连续划线操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
(2)平板划线法结果:
平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)如下图所示。
(3)几次灼烧的目的:
灼烧时期
目的
第一次操作(取菌种前)
杀死接种环上原有的微生物,避免污染培养物
每次划线之前
杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线菌种数目减少
划线结束
杀死接种环上残存的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
【特别提醒】(1)灼烧接种环后,要冷却后才能进行操作,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
(3)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(4)最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
3.培养酵母菌:接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
4.结果分析与评价:
(1)培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长,则说明培养基被污染,应该重新制备;若无菌落生长,则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落,这些菌落在颜色、形状和大小上相似,酵母菌菌落一般表面光滑,多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落,原因可能是菌液不纯,混入其他杂菌,或在实验操作过程中被杂菌污染。
如图表示酵母菌纯培养的部分操作步骤,下列有关叙述正确的是
( )
A.步骤①操作时,待倒入的培养基冷却凝固后,盖上培养皿盖,将其倒置
B.步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧消毒,接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C.步骤③沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,最后一次的划线不能与第一次的相连
D.步骤④是将培养皿放在培养箱中培养,也需倒置,一段时间后所得到的都是酵母菌的菌落
【解题导引】本题的解题思路是:
【解析】选C。分析步骤①,倒完平板后立即盖上培养皿盖,冷却凝固后将平板倒过来放置,A错误;分析步骤②,接种环和试管口需要先在火焰上灼烧灭菌,待冷却后才可以蘸取菌液进行平板划线,B错误;分析步骤③,沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,最后一次的划线不能与第一次的相连,培养后可出现单个的菌落,C正确;步骤④是将培养皿放在培养箱中培养,也需倒置,如果操作过程受到污染,一段时间后所得到的不一定都是酵母菌的菌落,D错误。
【误区警示】本题常见误区有以下两种
(1)误认为需将培养基冷却后再盖上培养皿盖:倒完平板后立即盖上培养皿,而不是等培养基冷却凝固后盖上培养皿盖。
(2)误认为只要有菌落,就是纯培养物:培养结果不一定是纯培养物,只有无菌操作合格时培养的微生物才是纯培养物。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
若要按照如图④的区域进行划线,那么在接种划线的操作过程中,共灼烧了几次接种环?
提示:图中共划了5个区域,在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌,因此共需要灼烧接种环6次。
(2)科学思维——演绎与推理
在划线操作时,如果接种环不慎划破培养基,可以继续正常进行操作吗?为什么?
提示:不能继续使用。因为划破培养基会造成划线不均匀,难以分离单菌落,可能导致微生物的无氧呼吸或杂菌污染等。
【素养·迁移】
微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。如图甲、乙、丙是酵母菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图,请据图回答有关问题:
(1)上图甲所示的是制备固体培养基时的实验操作步骤之一,它称为________,若用该培养基培养大肠杆菌,除考虑营养条件外,还要考虑________、________和渗透压等条件。?
(2)培养酵母菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是________________________________。?
(3)上图乙是平板划线法接种操作示意图,正确的操作顺序是A→B→__________________(用字母和箭头表示);找出图乙中两处错误的操作(用字母表示):________、________。?
(4)上图丙是某同学用平板划线法接种后的培养基培养12
h后的实验结果,如果培养基上?
______________,则说明无菌操作基本符合要求。?
【解析】(1)图甲所示操作为倒平板,需要在酒精灯火焰旁进行操作。培养基中除营养成分外,还应考虑pH、氧气、无菌、温度、渗透压等条件。
(2)检测培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生,如有菌落,说明该培养基已被污染。
(3)平板划线法的操作顺序为灼烧接种环,冷却,挑取菌种,划线,灼烧接种环,划线,灼烧接种环,平板倒置培养,即A→B→G→F→E→C→D→H。图乙中C操作应在酒精灯附近进行,D中划线的首尾不应该相连。
(4)同一菌种的菌落颜色、形状、大小基本一致,如有杂菌污染,会有异常菌落出现,可根据菌落的特征确定该菌落是否为酵母菌。
答案:(1)倒平板 温度(氧气) pH(无菌)
(2)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生
(3)G→F→E→C→D→H C D
(4)生长的菌落颜色、形状、大小基本一致,并符合酵母菌菌落的特点
【补偿训练】
在酵母菌的纯培养实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示,且甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是
( )
A.配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B.甲中a区域为划线的起始位置
C.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D.图示实验过程中接种环灼烧了5次
【解析】选B。为了能彻底灭菌,配制的培养基需进行高压蒸汽灭菌,A正确;起始划线的区域长出的菌落多且密,根据甲、乙对应区域对比,甲中a区域为划线的结束位置,B错误;连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落,C正确;由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌,从图示甲中4次划线接种就可推出,接种过程中接种环灼烧了5次,D正确。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.防止杂菌入侵,获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提。请分析下列关于微生物的纯培养操作,错误的是________。?
①无菌技术的关键是杀灭实验室中所有的微生物
②干热灭菌可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
③经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭,所以不能在常温下长期保存
④培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑤将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,可以迅速彻底地灭菌
⑥无菌技术中,若处理对象为液体,则只能消毒,不能灭菌
⑦为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
【解析】选①②⑥⑦。无菌技术的关键是防止杂菌的污染,①错误;灭菌能杀灭环境中一切微生物,包括孢子和芽孢,②错误;经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭,所以不能在常温下长期保存,③正确;培养基用高压蒸汽灭菌,④正确;将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,可以迅速彻底地灭菌,⑤正确;无菌技术中,若处理对象为液体,可以用高压蒸汽灭菌法灭菌,⑥错误。接种环经火焰灭菌后冷却后才能挑取菌落,⑦错误。
2.培养下列微生物,培养基中不用添加有机碳源的是
( )
A.蓝细菌
B.酵母菌
C.醋酸菌
D.乳酸菌
【解析】选A。酵母菌、醋酸菌、乳酸菌是异养微生物,蓝细菌是自养微生物,培养基不需要添加有机碳源。
3.下列有关常见无菌操作的叙述,错误的是
( )
A.用酒精擦拭双手
B.用氯气对水源消毒
C.实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭
【解析】选D。用酒精擦拭双手属于使用化学药剂消毒;用氯气消毒水源也属于使用化学药剂消毒;实验操作应在酒精灯火焰附近进行,因为高温可防止杂菌污染;玻璃器皿(吸管、培养皿)等应用干热灭菌法灭菌,利用酒精擦拭不能将所有微生物杀灭。
4.2020年,疫情中的最美逆行者,在给患者治疗时,要充分消毒并防护,以下说法中正确的是
( )
A.医务人员进入工作区要全身灭菌
B.接种疫苗前要对注射区域进行消毒
C.消毒与灭菌的含义本质是相同的
D.常用的消毒方法有灼烧法和高压蒸汽法
【解析】选B。医务人员进入工作区要全身消毒,A错误;接种疫苗前要对注射区域进行消毒,B正确;灭菌是将处理物体中的一切生物全部杀灭,在经过灭菌后的物体中,不再存在任何活着的生命;消毒是仅杀死物体表面或内部的一部分微生物,C错误;常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等,D错误。
5.(2020·江苏高考)为纯化菌种,在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌,培养结果如图所示。下列叙述正确的是
( )
A.倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多,不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后,可被刚果红染成红色
【解析】选B。本题主要考查平板划线法的相关使用技巧。倒平板后不需要晃动,A错误;Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落,说明细菌数量太多,故应从Ⅲ区挑取单菌落,B正确;出现单菌落即达到了菌种纯化的目的,C错误;刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应,D错误。
【思维·跃迁】
6.生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类,研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板,然后在平板上划分数区,将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域,培养结果如图所示,下列说法正确的是
( )
A.倒成平板后直接培养可判断有无污染
B.倒成平板后需要进行灭菌处理
C.图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
D.生长图形法不能用于某些菌种的筛选
【解析】选A。倒成平板后直接培养若有杂菌生长说明已被污染,若无杂菌生长说明没有污染,A正确;灭菌应在倒平板之前,B错误;图示结果表明需要两种生长因子乙和丙,C错误;根据某些菌种需要特殊的生长因子,可用生长图形法进行筛选,D错误。
7.无菌操作是微生物接种技术的关键。传统发酵技术和微生物分离、纯化、应用过程均要无菌操作。回答下列相关问题:
(1)消毒和灭菌是两个不同的概念,下列哪些事物适用于消毒处理________。?
①皮肤 ②饮用水 ③牛奶 ④注射器 ⑤培养皿
⑥接种环 ⑦培养基 ⑧果汁 ⑨酱油 ⑩手术刀
A.①②③⑧⑨ B.④⑤⑥⑦⑩
C.①②③④⑤
D.④⑤⑥⑧⑨
(2)如下图所示,利用________法进行酵母菌接种。?
如图A、B、C、D所示的四种划线方法,正确的是________。?
(3)培养酵母菌常用的培养基是______________,此培养基的氮源是______________。氮源进入酵母菌细胞后,可参与合成的生物大分子有______________、______________等。在接种前需要检测培养基是否被污染。对培养基的检测方法是____________________________________________,?
观察培养基上是否有菌落产生。
【解析】(1)皮肤可用70%酒精消毒,饮用水用氯气消毒,牛奶、果汁、酱油用巴氏消毒法进行消毒,注射器、培养基可用高压蒸汽灭菌,培养皿、手术刀用干热灭菌或高压蒸汽灭菌,接种环进行灼烧灭菌,①②③⑧⑨应采用消毒,④⑤⑥⑦⑩应采用灭菌。(2)题图是采用平板划线法接种,需要注意的是连续划线时,每次划线前后要灼烧接种环,同时最后一次划线不能与第一次相连。A图很难得到由单个细胞繁殖而来的菌落,A错误;B图划线从上次划线末端开始,容易得到由单个细胞繁殖而来的菌落,B正确;C图划线没有从上次划线的末端开始,接种环上没有菌种,不能得到由单个细胞繁殖而来的菌落,C错误;D图划线不是从上次划线末端开始,不容易得到由单个细胞繁殖而来的菌落,D错误。(3)培养酵母菌常用的培养基是马铃薯琼脂培养基,提供氮源的是马铃薯,细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等,氮源可参与以上物质的合成。检测培养基是否被污染,方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当时间,观察培养基上是否有菌落产生。
答案:(1)A (2)平板划线 B
(3)马铃薯琼脂培养基 马铃薯 蛋白质 核酸 将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当时间
【拓展·探究】
8.我国中科院的科研人员从污水处理厂的活性污泥中分离了一种独特的微生物——“惠芳中科微菌”,它是全世界科学家“最想要”的28个活性污泥核心微生物类群之一。微生物是活性污泥有效清除各种污染物的“主力军”,每克活性污泥中有1012个微生物细胞。这些复杂的微生物与废水中的有机营养物形成了复杂的“生态网”。“惠芳菌”除了分解各种有机污染物(如碳水化合物、芳香族化合物和短链脂肪酸)外,还具有还原硝酸盐和积累磷的能力,所以它的脱氮除磷效果远高于其他微生物。
(1)下列关于分离和培养“惠芳中科微菌”的过程,描述不正确的是________。?
A.分离和培养过程的关键是防止外来杂菌的入侵
B.培养“惠芳菌”的培养基应灭菌后才能使用
C.接种过程要将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环的金属丝烧红
D.用平板划线法接种后,一定会得到“惠芳菌”的单菌落
(2)“惠芳菌”在生态系统中属于________,培养“惠芳菌”的培养基中应含有__________________等营养物质。?
(3)“惠芳菌”还有哪些方面的应用?试举例说明。
【解析】(1)分离和培养微生物过程的关键是防止外来杂菌的入侵,A正确;培养基应灭菌后才能使用,B正确;接种环放在火焰上灼烧,为了灭菌充分,应该将接种环的金属丝烧红,C正确;用平板划线法接种,由于操作过程和划线次数等原因,不一定会得到单菌落,D错误。(2)由材料可知“惠芳菌”是分解者。培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源等营养物质。(3)从题干中可分析出“惠芳菌”具有还原硝酸盐和积累磷的能力,脱氮除磷效果远高于其他微生物,所以可以用于吸收环境中的氮和磷。
答案:(1)D (2)分解者 水、无机盐、碳源、氮源
(3)“惠芳菌”脱氮除磷效果好,还可以应用于治理水体富营养化等(合理即可)。
二 微生物的基本培养技术
(20分钟·70分)
一、选择题(共8小题,每小题5分,共40分)
1.下表为某培养基的配方,下列叙述正确的是
( )
成分
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10
g
10
g
2
g
0.4
g
0.065
g
1
000
mL
A.从物理性质看该培养基属于固体培养基
B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖,属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供生长因子的物质
D.该培养基不能培养异养微生物
【解析】选B。分析表中成分可知,该培养基中没有凝固剂,为液体培养基,A错误;该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源,也是碳源,而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源,B正确;该培养基中存在的蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子,C错误;该培养基中含有有机碳源,能用于培养异养微生物,D错误。
【补偿训练】
将相同的大肠杆菌样液分别接种于成分不同的三种培养基中,36小时后统计菌落数,结果如下表。下列叙述不正确的是
( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A.葡萄糖是培养基中的碳源也是能源
B.配制培养基过程中应先灭菌后倒平板
C.Ⅰ和Ⅱ对照,说明生长因子不利于大肠杆菌的生长
D.Ⅱ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖
【解析】选C。葡萄糖是培养基中的碳源也是能源,A正确;配制培养基过程中应先灭菌后倒平板,B正确;Ⅰ和Ⅱ对照,说明大肠杆菌的生长需要生长因子,C错误;Ⅱ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖,D正确。
2.(2020·徐州高二检测)不同的微生物对营养物质的需要各不相同。一种自养微生物在以CO2为唯一碳源的培养基中培养,下列说法不正确的是
( )
A.氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B.碳源物质也为该微生物提供能量
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
【解析】选B。培养基中的氮源物质可以为该微生物提供必要的氮素,A正确;该微生物只能以二氧化碳作为唯一碳源,二氧化碳不能为该微生物提供能量,B错误;无机盐可以为微生物提供碳、氮以外的重要元素,是该微生物不可缺少的营养物质,C正确;水是生物体新陈代谢不可缺少的物质,是该微生物的营养要素之一,D正确。
3.金黄色葡萄球菌有很强的致病力,常引起骨髓炎等,还可能引起食物中毒。下列实验结束后的做法错误的是
( )
A.对接种环进行灼烧处理
B.带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉
C.做完实验后,在实验室内可以饮水
D.接种后双手必须经肥皂洗净,再用70%的酒精棉球擦拭
【解析】选C。实验结束后应将金黄色葡萄球菌杀死,以免使人致病,接种环应用灼烧灭菌,A正确;带菌的培养基要经高压蒸汽灭菌后才能倒掉,以免污染环境,B正确;在微生物培养的实验室中,不能吃东西、饮水等,C错误;接种后双手必须用肥皂洗净,再用70%的酒精棉球擦拭,D正确。
4.关于酵母菌的纯培养实验操作,下列说法正确的是
( )
A.配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B.倒平板时,倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C.划线接种时,灼烧接种环后立即进行再次划线
D.划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养
【解析】选D。配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行,A错误。倒平板时,应立即盖上培养皿的皿盖,B错误。划线接种时,灼烧接种环冷却后进行再次划线,C错误。划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养,D正确。
5.下列依次表示倒平板、接种的位置,以及平板划线法接种的路径示意图,其中错误的是
( )
【解析】选D。倒平板时,用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖,防止空气中的杂菌污染,A正确;左手将培养皿打开一条缝隙,右手将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内,B正确;不同区域内划线,而且每次转换划线角度后再进行划线,让菌种来源于上一次划线末端,C正确;下一次划线没有从上一次划线末端开始,D错误。
6.产生标准菌落的最初数目和培养基分别是
( )
A.同种少数细菌,液体培养基
B.许多细菌,液体培养基
C.同种少数细菌,固体培养基
D.许多细菌,
固体培养基
【解析】选C。菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体,形成于固体培养基上,有一定的形态结构,所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落,形态结构是相同的;如果有许多细菌形成的菌落,
就不可能有比较标准的形态,所以C项正确。
7.(2020·郑州高二检测)下列有关微生物培养及培养基的描述错误的是
( )
A.培养基必须包含的成分有碳源、氮源、水、无机盐、生长因子及琼脂
B.根据物理性质不同,培养基可分为固体培养基和液体培养基
C.培养细菌时需要把培养基的pH调至中性或微碱性
D.平板划线法接种时需要在酒精灯火焰旁进行操作
【解析】选A。各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求,A错误;根据物理性质不同,培养基可分为固体培养基和液体培养基,B正确;培养细菌时需要把培养基的pH调至中性或微碱性,C正确;平板划线法接种时需要在酒精灯火焰旁进行操作,防止杂菌污染,D正确。
8.接种是微生物培养和分离等过程的必要步骤之一。下列关于接种的叙述不正确的是
( )
A.接种通常指无菌条件下将微生物接入培养基的操作
B.接种前需要对接种环灼烧灭菌,接种后则无须灭菌
C.接种通常在酒精灯火焰附近进行
D.接种环不能将培养基的表面划破
【解析】选B。无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程称为接种,A正确;接种前需要对接种环灼烧灭菌,接种后也需灭菌,防止污染环境和感染操作者,B错误;为避免杂菌污染,接种通常在酒精灯火焰附近进行,C正确;接种时接种环不能将培养基的表面划破,D正确。
二、非选择题(共2小题,共30分)
9.(12分)将马铃薯去皮切块,加水煮沸至马铃薯软烂,过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量葡萄糖和琼脂,用蒸馏水定容后灭菌,得到马铃薯琼脂培养基。回答下列问题:
(1)马铃薯琼脂培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有______________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有________________________(答出两点即可)。?
(2)分离培养酵母菌通常使用马铃薯琼脂培养基,该培养基在进行接种前要进行______________。将酵母菌菌种划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是__?______________________________________。?
(3)该培养基按物理性质划分属于________培养基,若要对酵母菌进行扩大培养,此培养基中不应加入的物质是________。?
【解析】(1)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质,因此,除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(2)培养基在使用前常用高压蒸汽灭菌法灭菌;菌落概念见答案。(3)该培养基中有凝固剂,属于固体培养基,对微生物进行扩大培养,一般用液体培养基。
答案:(1)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(2)(高压蒸汽)灭菌 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
(3)固体 琼脂
10.(18分)自然界中有多种微生物,将其进行合理筛选、培养和应用,能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题。
(1)对培养基进行灭菌时,多采取____________法,即将培养基置于____________条件下维持15～30分钟,目的是杀死培养基中的____________。对接种环灭菌时则用____________法。?
(2)若要将微生物采用平板划线法进行分离操作,在固体培养基表面连续进行了4次划线,则需要对接种环灼烧____________次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时,要从上次划线的____________开始划线,最后一次划的线不能与第一次划的线____________。?
(3)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中____________培养,以减少培养基中的水分挥发。其中,培养未接种的固体培养基是为了__________________________________________________。?
【解析】(1)对培养基进行灭菌时,多采取高压蒸汽灭菌法,即将培养基置于压力100
kPa、温度121
℃条件下维持15～30分钟,目的是杀死培养基中的所有微生物(微生物和芽孢、孢子)。对接种环灭菌用灼烧灭菌法。(2)接种环在每次接种前都要灼烧灭菌,最后一次接种完也要灭菌,所以在固体培养基表面连续进行了4次划线,则需要对接种环灼烧5次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时,要从上次划线的末端开始划线,使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终获得由单个菌体形成的单个菌落。最后一次划的线不能与第一次划的线相连。(3)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中倒置培养,以减少培养基中的水分挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组,排除培养基被杂菌污染。
答案:(1)高压蒸汽灭菌 压力100
kPa、温度121
℃ 所有微生物(微生物和芽孢、孢子)
灼烧灭菌
(2)5 末端 相连(或相接、相交等意思正确即可)
(3)倒置 作为对照组,排除培养基被杂菌污染
【互动探究】
在平板划线法操作过程中,为什么在第二次及以后划线时,总是从上一次划线的末端开始?
提示:目的是将聚集的菌种逐步稀释,以便得到单菌落。
(10分钟·30分)
1.(5分)下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,甲、丙都不能。下列说法正确的是
( )
粉状硫10
g
K2HPO44
g
FeSO40.5
g
蔗糖10
g
(NH4)2SO40.4
g
H2O100
mL
MgSO49.25
g
CaCl20.5
g
Ⅰ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A.甲、乙、丙都是异养微生物
B.甲、乙都是自养微生物、丙是异养微生物
C.甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物
D.甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物
【解析】选C。甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能,而Ⅰ培养基缺氮,说明甲能够自身固氮,属于固氮微生物。乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,而甲和丙都不能,Ⅱ培养基中没有有机碳源,说明乙能够合成有机物,属于自养微生物。丙不能在Ⅰ培养基生长繁殖,说明不能固氮,又不能在Ⅱ培养基中生长繁殖,说明不能合成有机物,只能在Ⅲ培养基中生长繁殖,说明属于异养微生物。
2.(5分)(不定项)(2019·江苏高考改编)下列关于微生物实验操作的叙述,正确的是
( )
A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B.接种前后,接种环都要在酒精灯火焰的充分燃烧层进行灼烧
C.接种后的培养皿要倒置,以防培养基污染
D.可以使用固体培养基将菌种分离并获得纯培养物
【解析】选B、C、D。接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理,接种环等常用灼烧灭菌法处理,吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理,培养基等用高压蒸汽灭菌法处理,A错误;为了防止杂菌污染,每次接种前后,接种环都要进行灼烧灭菌,B正确;接种后,培养皿需要倒置,以防皿盖上水珠落入培养基造成污染,C正确;分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法,所用培养基为固体培养基,分离得到的单菌落即纯培养物,D正确。
3.(5分)(不定项)某研究小组用平板划线法从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是
( )
A.培养基转移到培养皿后进行灭菌
B.转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C.接种时不能划破培养基,否则难以达到分离单菌落的目的
D.划线操作时完全打开皿盖,划完立即盖上
【解析】选B、C。在配制培养基的过程中要先高压蒸汽灭菌后分装到培养皿,A错误;转换划线角度后要对接种环进行灼烧灭菌,冷却后再进行划线,B正确;接种环不应划破培养基表面,否则不能分离得到单菌落,C正确;划线时皿盖打开一条缝,右手于火焰附近处将接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线,盖上皿盖,而不是完全打开皿盖,D错误。
4.(15分)(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是______________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是______________________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________________(填“能够”或“不能”)生长,原因是__?_________________________________________________。?
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板____________(填“倒置”或“正置”)。?
(3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是________________________。?
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过______________处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。?
【解析】(1)蛋白胨含有C、H、O、N等元素,葡萄糖只含有C、H、O,NaNO3不含有C,所以培养基中蛋白胨能同时提供碳源和氮源。不同细菌生长繁殖所需要的pH不同,因此培养不同的细菌,需要调节培养基的不同pH。硝化细菌属于化能自养型细菌,可以将空气中的二氧化碳等无机物合成为有机物,它可以在没有碳源的培养基上生长。
(2)用平板培养基培养细菌时,一般需要将平板倒置,以防止培养皿盖上凝结的水珠滴落,导致污染。
(3)不同种的微生物在一定条件下培养,可在培养基上形成大小、颜色、形状等不同的菌落,这是一种比较稳定的特征,可根据菌落的特征区分不同种的微生物。
(4)使用后的培养基需要用强烈的物理或化学手段进行灭菌,以杀灭其中所有的微生物,避免污染环境。
答案:(1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌(共133张PPT)
第2节 微生物的培养技术及应用
一 微生物的基本培养技术
必备知识·素养奠基
一、培养基的配制
1.培养基的概念:人们按照微生物对_________的不同需求,配制出供其
_________的营养基质——培养基,用以培养、分离、鉴定、_____微生物或积累
其代谢物。
2.培养基的分类:按照物理性质不同分为两类。
(1)液体培养基:呈_________的培养基,不加入凝固剂(如琼脂)。
(2)固体培养基:呈_________的培养基,加入凝固剂(如琼脂)。
3.营养组成:各种培养基一般都含有___、_____、_____和无机盐,此外还需要
满足微生物生长对___、特殊营养物质以及__的需求。
营养物质
生长繁殖
保存
液体状态
固体状态
水
碳源
氮源
pH
O2
4.培养基特殊需求:
(1)培养乳酸杆菌时,在培养基中添加_______。
(2)培养霉菌时,将培养基调至_____。
(3)培养细菌时,将培养基调至_____________。
(4)培养厌氧微生物时,需要提供___________。
维生素
酸性
中性或弱碱性
无氧的条件
【激疑】有同学认为液体培养基含有水,而固体培养基是没有水的,这种想法对吗?为什么?
提示:不对。液体培养基和固体培养基都含有水分,它们的区别为是否添加凝固剂。
二、无菌技术
1.无菌技术关键:_____________。
2.消毒与灭菌:
(1)概念:
①消毒:使用较为_____的物理、化学或生物等方法仅杀死物体_____或内部的
_____微生物(不包括___________)。
②灭菌:使用_____的理化方法杀死物体内外_____的微生物(包括___________)。
防止杂菌污染
温和
表面
部分
芽孢和孢子
强烈
所有
芽孢和孢子
(2)类型与方法:
连一连:将无菌技术类型、常用方法和适用对象用线连起来。
【激疑】在无菌技术中,为什么许多实验操作都要在酒精灯火焰附近进行?
提示:酒精灯火焰周围温度高,细菌少,甚至无菌,这样可以避免周围环境中微生物的污染。
三、微生物的纯培养
1.微生物纯培养的概念:由_________繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物,
获得_________的过程就是纯培养。
2.酵母菌的纯培养:
(1)纯培养的原理:设法在培养基上得到由___________繁殖形成的纯培养物
(单菌落)。
(2)纯培养方法:___________和稀释涂布平板法。
单一个体
纯培养物
单个微生物
平板划线法
(3)纯培养过程:
①制备培养基:___________→灭菌→_______
②接种和分离酵母菌:用_________法在马铃薯培养基表面接种酵母菌。下列接
种过程正确的顺序是________
配制培养基
倒平板
平板划线
baefcgd
③培养酵母菌:待菌液被_______吸收,将接种后的平板和一个未接种的平板
_____,放入28
℃左右恒温箱中培养________。
(4)结果分析与评价:
结合酵母菌纯培养的过程,判断下列分析的正误:
①未接种的平板上没有菌种,此实验没有必要培养。
(
)
提示:培养未接种的平板起到对照作用,可以检验培养基的制备是否合格。
②在未接种的培养基表面长出了菌落,说明培养基制备不合格。
(
)
培养基
倒置
24～48h
×
√
③若无菌操作合格,在接种酵母菌的培养基上应观察到不同形态、不同颜色的
酵母菌菌落。
(
)
提示:应该是观察到形态、颜色一致的酵母菌单菌落。
④如果将酵母菌放置在35
℃恒温箱中培养,相同时间后观察,菌落会比28
℃
条件下的大,数量多。
(
)
提示:酵母菌适宜生长温度为28
℃,35
℃条件下由于温度较高,酵母菌生长
慢。
×
×
⑤某同学使用平板划线法纯化酵母菌,培养48
h后,只在培养基的第一划线区
域长出密集的菌落,其他区域未长出菌落,可能是这位同学第二次灼烧接种环
未冷却就直接划线导致的。
(
)
√
【激疑】将接种后的平板放在恒温培养箱中培养有必要吗?为什么?
提示:有必要。恒温培养箱可以提供微生物生长的适宜温度。
关键能力·素养形成
知识点一 培养基的配制
1.培养基的成分及功能:
营养要素
来 源
功 能
碳源
(提供
碳元
素的
物质)
无机
碳源
NaHCO3等含碳无机物
①构成细胞物质和一些代谢产物;
②有机碳既是碳源又是能源
有机
碳源
糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油等
氮源
(提供
氮元
素的
物质)
无机
氮源
铵盐、硝酸盐等
将无机氮合成含氮的代谢产物
有机
氮源
牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等
合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物
营养要素
来 源
功 能
生长因子
(生长必不
可少的微
量有机物)
维生素、氨基酸、碱基
①酶和核酸的组成成分;
②参与代谢过程中的酶促反应
水
外界摄入
①良好的溶剂
②维持生物大分子结构的稳定
无机盐
无机物
为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素
【特别提醒】有关培养基营养物质的三点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)微生物需要补充生长因子,是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(3)微生物需要量最大的是碳源。能合成含碳有机物的是自养型,反之则为异养型。
2.培养基的种类:
分类
标准
培养基种类
培养基特点
作 用
物理
性质
固体培养基
加凝固剂,如琼脂
微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种
半固体培养基
容器放倒不致流出,剧烈震动则破散
观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基
不加凝固剂
常用于工业生产
功能
选择培养基
根据某种微生物的特殊营养要求配制
选择、分离
鉴别培养基
加入能与目的菌的代谢产物发生显色反应的指示剂
鉴定
续表
分类
标准
培养基种类
培养基特点
作 用
成分
来源
天然培养基
含化学成分不明确的天然物质
工业生产
合成培养基
用已知的化学物质配制
分类鉴定
【素养案例】
微生物种类繁多,培养条件也各不相同。下列关于微生物培养基的描述正确的是
( )
A.同一物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量,氮源有些也能提供能量
C.牛肉膏蛋白胨培养基是培养细菌、病毒等常用的培养基
D.培养硝化细菌,可用无机碳源的培养基
【解题导引】
【解析】选D。对异养微生物来说,含C、H、O、N的化合物既是碳源,又是氮源,如牛肉膏,A错误;有机碳源能提供能量,无机碳源不能提供能量,有些氮源也能提供能量,B错误;病毒必须寄生在活细胞内才能生活,不能用普通培养基培养,必须先培养细胞再培养病毒,C错误;硝化细菌是自养微生物,可以通过化能合成作用合成含碳有机物,D正确。
【误区警示】微生物的碳源、氮源和能源物质的两个认识“误区”
(1)误认为所有碳源和氮源都可提供能量:有机碳源和有机氮源是异养微生物的能源物质。
(2)误认为所有微生物的能源都是有机碳源:自养微生物的碳源一般是CO2,光能自养微生物的能源是光能,例如蓝细菌等;化能自养微生物的能源是化学物质,例如硝化细菌的能源物质是NH3。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与推理
结合病毒的特点,试分析如何培养病毒,写出简要思路。
提示:可以先在特定培养基上培养病毒的宿主细胞,然后让病毒侵染宿主细胞,从而达到培养病毒的目的。
(2)科学思维——演绎与推理
结合相关知识,判断下面培养基的各种成分能提供的营
养物质类别:
提示:碳源 氮源(无机盐) 无机盐 生长因子
成分
蔗糖
(NH4)2SO4
FeSO4
维生素
提供的
营养
____?
____?
____?
____?
【素养·迁移】
下表是某微生物培养基成分,请据此回答:
编号
成分
含量
①
粉状硫
10
g
②
(NH4)2SO4
0.4
g
③
K2HPO4
4.0
g
④
MgSO4
9.25
g
⑤
FeSO4
0.5
g
⑥
CaCl2
0.5
g
⑦
H2O
100
mL
(1)上表培养基可培养的微生物类型是____________。?
(2)若除去成分②,加入(CH2O),该培养基可用于培养________________。?
(3)表中营养成分共有________类。?
(4)不论何种培养基,在各种成分都溶化后分装前,要进行的是________________________。?
(5)若上表培养基用于菌种鉴定,应该增加的成分是________________。?
【解析】(1)由题表可知,该培养基中没有碳源,说明培养的微生物是从外界环境中获取碳源的,因此培养的微生物是自养型微生物。
(2)该培养基若加入(CH2O),培养基中就有了碳源,但除去成分②,培养基中就没有了氮源,该培养基就只能用于培养固氮微生物。
(3)题表中的营养物质有水、无机盐、无机氮源三类,缺乏碳源和特殊营养物质。
(4)微生物生长需要一定的pH,所以培养基装瓶前需要调节pH。
(5)该培养基中无凝固剂,为液体培养基。菌种的纯化和鉴定通常利用固体平板培养基以获得单细胞菌落,因此需要加入凝固剂,如琼脂,将液体培养基转变成固体培养基。
答案:(1)自养型微生物
(2)固氮微生物
(3)3 (4)调节pH
(5)琼脂(或凝固剂)
【补偿训练】
下列关于培养基的叙述,错误的是
( )
A.氮源、无机盐、水等是微生物生长不可缺少的营养物质
B.根据微生物自身的特点,使用不同碳源的培养基
C.可在培养基中加入磷酸氢二钾或磷酸二氢钾,用于维持pH的相对稳定
D.若要将微生物扩大培养,应使用固体培养基
【解析】选D。微生物的营养物质主要有碳源、氮源、无机盐、水和生长因子,A正确;根据微生物自身的特点,使用含不同碳源的培养基,例如培养自养型的细菌,在培养基中不需加入碳源,B正确;微生物培养基调节pH时可以用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾,C正确;若要将微生物扩大培养,一般用液体培养基,D错误。
知识点二 无菌技术
1.无菌技术的概念:防止外来杂菌的入侵,并保持已灭菌物品及无菌区域不再被污染的方法,称为无菌技术。
2.无菌技术的目的:
(1)可防止实验室的培养物被其他微生物污染。
(2)有效避免操作者自身被微生物感染。
3.无菌技术的选择原则:
(1)考虑效果:灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力:活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法,而不能采用灭菌的方法。
4.无菌技术的方法——消毒与灭菌:
方法
条件
应用范围
消毒
煮沸
消毒法
在100
℃下煮沸5～6min
一般物品,如家庭餐具等生活用品
巴氏
消毒法
62～65
℃消毒
30
min或80～90
℃处理30
s～1
min
一些不耐高温的液体,如牛奶、啤酒、果酒和酱油等
化学
药物
消毒法
70%～75%的酒精、碘酒、氯气、石炭酸、煤酚皂溶液等
用于双手、皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、水源、手术器械、塑料或玻璃器皿等消毒
紫外线
消毒法
30
W紫外灯照射30
min
接种室、接种箱、超净工作台
方法
条件
应用范围
灭菌
灼烧
灭菌
在酒精灯火焰充分燃烧层灼烧
涂布器、接种环、接种针或其他金属用具等;接种过程中的试管口或瓶口灭菌
干热
灭菌
干热灭菌箱内160～170
℃下灭菌2～3
h
玻璃器皿、金属用具等不适宜用其他方法灭菌需要保持干燥和能耐高温的物品
湿热
灭菌
高压蒸汽灭菌锅:100
kPa、121
℃条件下15～30
min灭菌
培养基及容器的灭菌
【特别提醒】
消毒和灭菌的两点提醒
(1)作用原理是借助理化因素,通过使蛋白质变性来抑制微生物生命活动或杀死微生物。
(2)最根本区别是芽孢和孢子是否灭活,灭菌能杀死芽孢和孢子,因而灭菌更彻底。
【素养案例】
防止杂菌入侵,获得纯净的培养物,是研究和应用微生物的前提。下列叙述错误的是
( )
A.实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒
B.在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室时一定要洗手,以防止被微生物感染
C.接种环、接种针等金属用具,直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌
D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境
【解题导引】明确以下三个关键点:
(1)对操作空间消毒的方法:紫外线消毒、化学药物消毒。
(2)适于灼烧灭菌的物品:接种环、接种针等金属用具。
(3)防止微生物感染:做好自身防护,对使用后的培养基进行灭菌。
【解析】选C。为防止杂菌污染,研究和应用微生物时应进行消毒和灭菌,实验室可以用紫外线或化学药物进行消毒,A正确;在实验室中,不可吃东西、喝水,离开实验室时一定要洗手,以防止被微生物感染,B正确;接种环、接种针等金属用具,直接在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰部位灼烧灭菌,C错误;使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理,以免污染环境,D正确。
【方法规律】灼烧灭菌的适用范围和方法
(1)灼烧灭菌适用于接种工具和试管口、瓶口的灭菌。
(2)接种工具灼烧灭菌:用酒精灯外焰按顺序充分燃烧;试管口、瓶口灭菌:迅速通过酒精灯外焰。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
某同学在实验过程中不小心将灭菌的培养皿和未灭菌的培养皿混合了,那么这些培养皿还能用于实验吗?为什么?
提示:不能。已灭菌的材料物品不能与周围物品接触,以防止污染。所以这位同学应将培养皿再次灭菌后才能用于实验。
(2)科学思维——演绎与推理
题中A项的化学药物消毒时,某同学想酒精浓度越高,消毒效果可能越好,于是他就用了95%的酒精进行消毒,他的这种做法对吗?解释原因。
提示:不对。用酒精消毒时,体积分数为70%的酒精消毒效果最好,原因是浓度过高,菌体表面蛋白质凝固成一层保护膜,酒精不能渗入其中。
【素养·迁移】
在生产、生活和科研实践中,经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。回答下列问题:
(1)在实验室中,玻璃和金属材质的实验器具???????????????????????(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。?
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法,与煮沸消毒法相比,这两种方法的优点是?????????????????????????????????????????????????。?
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒,其原因是紫外线能????????
??????????。在照射前,适量喷洒????????????????????????????,可强化消毒效果。?
(4)水厂供应的自来水通常是经过????????????(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。?
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,而锅内并没有达到相应温度,最可能的原因是????????????????????????。
【解析】(1)玻璃和金属材质的实验器具可以通过干热灭菌的方法来灭菌。
(2)巴氏消毒法是在70～75
℃煮30
min或在80
℃下煮15
min,可以杀死牛奶中的微生物,并使牛奶的营养成分不被破坏;高温瞬时消毒是在较短的时间内利用高温杀死微生物,由于时间较短,营养物质损失较少。
(3)紫外线有消毒、灭菌的作用,在照射前,适量喷洒消毒液,可以强化消毒效果。
(4)自来水消毒通常采用“氯气”或“紫外线”等方法。
(5)使用高压蒸汽灭菌锅时,若压力达到设定要求,但没有达到相应温度,最可能的原因是锅内冷空气没有排尽。
答案:(1)可以
(2)在达到消毒目的的同时,营养物质损失较少
(3)破坏DNA结构 消毒液
(4)氯气
(5)未将锅内冷空气排尽
【补偿训练】
高温灭菌的原理是
( )
A.每种微生物生长的最适温度是一定的
B.微生物对高温环境不适应
C.高温破坏了细胞内的蛋白质、核酸,影响其生命活动
D.高温降低了环境中氧的浓度
【解析】选C。高温灭菌的目的是利用高温杀死包括芽孢和孢子在内的一切微生物。原理是高温能使细菌的蛋白质变性,同时破坏核酸的结构,从而影响其正常的生命活动。
知识点三 酵母菌的纯培养
1.制备马铃薯琼脂培养基:
(1)配制培养基:
(2)灭菌:培养基转移至锥形瓶,加棉塞,包上牛皮纸,如图所示,然后放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌,培养皿包扎后放入干热灭菌箱内灭菌。
(3)倒平板:待培养基冷却到50
℃左右时,在酒精灯火焰附近进行。具体操作过程:
【特别提醒】关于制备培养基的四点提醒
(1)如果需要调节培养基的pH,应该在定容完成后,灭菌之前进行操作。
(2)灭菌之后,倒平板时培养基的温度是50
℃左右。因为凝固剂琼脂在98
℃以上熔化,在44
℃以下凝固,倒平板时高于50
℃则会烫手,低于50
℃时若不能及时操作,琼脂会凝固。
(3)倒平板的整个操作在酒精灯火焰旁进行,避免杂菌的污染。
(4)倒平板时不要将培养基溅在皿盖与皿底之间,否则此培养基不能用来培养微生物,因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。
2.平板划线法接种和分离酵母菌:
(1)平板划线法:通过接种环在固体培养基表面连续划线操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。
(2)平板划线法结果:
平板划线示意图(A)及培养后菌落分布示意图(B)如下图所示。
(3)几次灼烧的目的:
灼烧时期
目的
第一次操作
(取菌种前)
杀死接种环上原有的微生物,避免污染培养物
每次划
线之前
杀死上次划线后接种环上残留的菌种,使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端,使每次划线菌种数目减少
划线结束
杀死接种环上残存的菌种,避免微生物污染环境和感染操作者
【特别提醒】(1)灼烧接种环后,要冷却后才能进行操作,以免温度太高杀死菌种。
(2)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始,能使微生物的数目随着划线次数的增加而逐渐减少,最终得到由单个细胞繁殖而来的菌落。
(3)划线用力大小要适当,防止用力过大将培养基划破。
(4)最后一次的划线不要与第一次的划线相连。
3.培养酵母菌:接种和未接种的平板在温度适宜的恒温箱中培养。
4.结果分析与评价:
(1)培养未接种的培养基的目的是检查培养基制备是否合格。未接种的培养基表面若有菌落生长,则说明培养基被污染,应该重新制备;若无菌落生长,则说明未被污染。
(2)在接种酵母菌的培养基上可观察到独立的菌落,这些菌落在颜色、形状和大小上相似,酵母菌菌落一般表面光滑,多呈乳白色。
(3)若在培养基中观察到不同形态的菌落,原因可能是菌液不纯,混入其他杂菌,或在实验操作过程中被杂菌污染。
【素养案例】
如图表示酵母菌纯培养的部分操作步骤,下列有关叙述正确的是
( )
A.步骤①操作时,待倒入的培养基冷却凝固后,盖上培养皿盖,将其倒置
B.步骤②接种环和试管口应先在火焰上灼烧消毒,接种环冷却后再放入试管中蘸取菌液
C.步骤③沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,最后一次的划线不能与第一次的相连
D.步骤④是将培养皿放在培养箱中培养,也需倒置,一段时间后所得到的都是酵母菌的菌落
【解题导引】本题的解题思路是:
【解析】选C。分析步骤①,倒完平板后立即盖上培养皿盖,冷却凝固后将平板倒过来放置,A错误;分析步骤②,接种环和试管口需要先在火焰上灼烧灭菌,待冷却后才可以蘸取菌液进行平板划线,B错误;分析步骤③,沿多个方向划线,使接种物逐渐稀释,最后一次的划线不能与第一次的相连,培养后可出现单个的菌落,C正确;步骤④是将培养皿放在培养箱中培养,也需倒置,如果操作过程受到污染,一段时间后所得到的不一定都是酵母菌的菌落,D错误。
【误区警示】本题常见误区有以下两种
(1)误认为需将培养基冷却后再盖上培养皿盖:倒完平板后立即盖上培养皿,而不是等培养基冷却凝固后盖上培养皿盖。
(2)误认为只要有菌落,就是纯培养物:培养结果不一定是纯培养物,只有无菌操作合格时培养的微生物才是纯培养物。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
若要按照如图④的区域进行划线,那么在接种划线的操作过程中,共灼烧了几次接种环?
提示:图中共划了5个区域,在每次划线前后均需要对接种环灼烧灭菌,因此共需要灼烧接种环6次。
(2)科学思维——演绎与推理
在划线操作时,如果接种环不慎划破培养基,可以继续正常进行操作吗?为什么?
提示:不能继续使用。因为划破培养基会造成划线不均匀,难以分离单菌落,可能导致微生物的无氧呼吸或杂菌污染等。
【素养·迁移】
微生物的分离和培养是现代生物工程应用中的重要环节。如图甲、乙、丙是酵母菌分离和培养过程中部分操作和实验结果示意图,请据图回答有关问题:
(1)上图甲所示的是制备固体培养基时的实验操作步骤之一,它称为________,若用该培养基培养大肠杆菌,除考虑营养条件外,还要考虑________、________和渗透压等条件。?
(2)培养酵母菌时,在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是__________。?
(3)上图乙是平板划线法接种操作示意图,正确的操作顺序是A→B→__________________(用字母和箭头表示);找出图乙中两处错误的操作(用字母表示):________、________。?
?
(4)上图丙是某同学用平板划线法接种后的培养基培养12
h后的实验结果,如果培养基上_________________,则说明无菌操作基本符合要求。
【解析】(1)图甲所示操作为倒平板,需要在酒精灯火焰旁进行操作。培养基中除营养成分外,还应考虑pH、氧气、无菌、温度、渗透压等条件。
(2)检测培养基是否被污染的方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生,如有菌落,说明该培养基已被污染。
(3)平板划线法的操作顺序为灼烧接种环,冷却,挑取菌种,划线,灼烧接种环,划线,灼烧接种环,平板倒置培养,即A→B→G→F→E→C→D→H。图乙中C操作应在酒精灯附近进行,D中划线的首尾不应该相连。
(4)同一菌种的菌落颜色、形状、大小基本一致,如有杂菌污染,会有异常菌落出现,可根据菌落的特征确定该菌落是否为酵母菌。
答案:(1)倒平板 温度(氧气) pH(无菌)
(2)将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间,观察培养基上是否有菌落产生
(3)G→F→E→C→D→H C D
(4)生长的菌落颜色、形状、大小基本一致,并符合酵母菌菌落的特点
【补偿训练】
在酵母菌的纯培养实验中,划线接种(甲)、培养结果(乙)如图所示,且甲、乙的对应位置不变。下列有关叙述错误的是
( )
A.配制培养基时需进行高压蒸汽灭菌
B.甲中a区域为划线的起始位置
C.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落
D.图示实验过程中接种环灼烧了5次
【解析】选B。为了能彻底灭菌,配制的培养基需进行高压蒸汽灭菌,A正确;起始划线的区域长出的菌落多且密,根据甲、乙对应区域对比,甲中a区域为划线的结束位置,B错误;连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落,C正确;由于每次使用接种环前后都要灼烧灭菌,从图示甲中4次划线接种就可推出,接种过程中接种环灼烧了5次,D正确。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.防止杂菌入侵,获得纯净的微生物培养物是研究和应用微生物的前提。请分析下列关于微生物的纯培养操作,错误的是________。?
①无菌技术的关键是杀灭实验室中所有的微生物
②干热灭菌可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢
③经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭,所以不能在常温下长期保存
④培养基要进行高压蒸汽灭菌
⑤将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,可以迅速彻底地灭菌
⑥无菌技术中,若处理对象为液体,则只能消毒,不能灭菌
⑦为了防止污染,接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
【解析】选①②⑥⑦。无菌技术的关键是防止杂菌的污染,①错误;灭菌能杀灭环境中一切微生物,包括孢子和芽孢,②错误;经巴氏消毒法处理的食品因微生物未被彻底消灭,所以不能在常温下长期保存,③正确;培养基用高压蒸汽灭菌,④正确;将接种环直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧,可以迅速彻底地灭菌,⑤正确;无菌技术中,若处理对象为液体,可以用高压蒸汽灭菌法灭菌,⑥错误。接种环经火焰灭菌后冷却后才能挑取菌落,⑦错误。
2.培养下列微生物,培养基中不用添加有机碳源的是
( )
A.蓝细菌
B.酵母菌
C.醋酸菌
D.乳酸菌
【解析】选A。酵母菌、醋酸菌、乳酸菌是异养微生物,蓝细菌是自养微生物,培养基不需要添加有机碳源。
3.下列有关常见无菌操作的叙述,错误的是
( )
A.用酒精擦拭双手
B.用氯气对水源消毒
C.实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭
【解析】选D。用酒精擦拭双手属于使用化学药剂消毒;用氯气消毒水源也属于使用化学药剂消毒;实验操作应在酒精灯火焰附近进行,因为高温可防止杂菌污染;玻璃器皿(吸管、培养皿)等应用干热灭菌法灭菌,利用酒精擦拭不能将所有微生物杀灭。
4.2020年,疫情中的最美逆行者,在给患者治疗时,要充分消毒并防护,以下说法中正确的是
( )
A.医务人员进入工作区要全身灭菌
B.接种疫苗前要对注射区域进行消毒
C.消毒与灭菌的含义本质是相同的
D.常用的消毒方法有灼烧法和高压蒸汽法
【解析】选B。医务人员进入工作区要全身消毒,A错误;接种疫苗前要对注射区域进行消毒,B正确;灭菌是将处理物体中的一切生物全部杀灭,在经过灭菌后的物体中,不再存在任何活着的生命;消毒是仅杀死物体表面或内部的一部分微生物,C错误;常用的消毒方法有煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法等,D错误。
5.(2020·江苏高考)为纯化菌种,在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌,培养结果如图所示。下列叙述正确的是
( )
A.倒平板后需间歇晃动,以保证表面平整
B.图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多,应从Ⅲ区挑取单菌落
C.该实验结果因单菌落太多,不能达到菌种纯化的目的
D.菌落周围的纤维素被降解后,可被刚果红染成红色
【解析】选B。本题主要考查平板划线法的相关使用技巧。倒平板后不需要晃动,A错误;Ⅰ区、Ⅱ区没有出现单菌落,说明细菌数量太多,故应从Ⅲ区挑取单菌落,B正确;出现单菌落即达到了菌种纯化的目的,C错误;刚果红是一种染料,它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物,但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应,D错误。
【思维·跃迁】
6.生长图形法是一种测定微生物营养需求的简便方法。为探究某嗜热菌所需生长因子的种类,研究小组把该菌的悬浮液与不含任何生长因子但含有其他必需营养物质的培养基混合后倒成平板,然后在平板上划分数区,将甲、乙、丙三种生长因子分别添加到不同区域,培养结果如图所示,下列说法正确的是( )
A.倒成平板后直接培养可判断有无污染
B.倒成平板后需要进行灭菌处理
C.图示结果表明该菌需要生长因子乙或丙
D.生长图形法不能用于某些菌种的筛选
【解析】选A。倒成平板后直接培养若有杂菌生长说明已被污染,若无杂菌生长说明没有污染,A正确;灭菌应在倒平板之前,B错误;图示结果表明需要两种生长因子乙和丙,C错误;根据某些菌种需要特殊的生长因子,可用生长图形法进行筛选,D错误。
7.无菌操作是微生物接种技术的关键。传统发酵技术和微生物分离、纯化、应用过程均要无菌操作。回答下列相关问题:
(1)消毒和灭菌是两个不同的概念,下列哪些事物适用于消毒处理________。?
①皮肤 ②饮用水 ③牛奶 ④注射器 ⑤培养皿
⑥接种环 ⑦培养基 ⑧果汁 ⑨酱油 ⑩手术刀
A.①②③⑧⑨
B.④⑤⑥⑦⑩
C.①②③④⑤
D.④⑤⑥⑧⑨
(2)如下图所示,利用________法进行酵母菌接种。?
如图A、B、C、D所示的四种划线方法,正确的是________。?
(3)培养酵母菌常用的培养基是______________,此培养基的氮源是______________。氮源进入酵母菌细胞后,可参与合成的生物大分子有______________、______________等。在接种前需要检测培养基是否被污染。对培养基的检测方法是____________________________________________,?
观察培养基上是否有菌落产生。
【解析】(1)皮肤可用70%酒精消毒,饮用水用氯气消毒,牛奶、果汁、酱油用巴
氏消毒法进行消毒,注射器、培养基可用高压蒸汽灭菌,培养皿、手术刀用干热
灭菌或高压蒸汽灭菌,接种环进行灼烧灭菌,①②③⑧⑨应采用消毒,④⑤⑥⑦
⑩应采用灭菌。(2)题图是采用平板划线法接种,需要注意的是连续划线时,每
次划线前后要灼烧接种环,同时最后一次划线不能与第一次相连。A图很难得到
由单个细胞繁殖而来的菌落,A错误;B图划线从上次划线末端开始,容易得到由
单个细胞繁殖而来的菌落,B正确;C图划线没有从上次划线的末端开始,接种环
上没有菌种,不能得到由单个细胞繁殖而来的菌落,C错误;D图划线不是从上次
划线末端开始,不容易得到由单个细胞繁殖而来的菌落,D错误。(3)培养酵母菌常用的培养基是马铃薯琼脂培养基,提供氮源的是马铃薯,细胞中含有氮元素的生物大分子有蛋白质、核酸等,氮源可参与以上物质的合成。检测培养基是否被污染,方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当时间,观察培养基上是否有菌落产生。
答案:(1)A (2)平板划线 B
(3)马铃薯琼脂培养基 马铃薯 蛋白质 核酸 将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当时间
【拓展·探究】
8.我国中科院的科研人员从污水处理厂的活性污泥中分离了一种独特的微生物——“惠芳中科微菌”,它是全世界科学家“最想要”的28个活性污泥核心微生物类群之一。微生物是活性污泥有效清除各种污染物的“主力军”,每克活性污泥中有1012个微生物细胞。这些复杂的微生物与废水中的有机营养物形成了复杂的“生态网”。“惠芳菌”除了分解各种有机污染物(如碳水化合物、芳香族化合物和短链脂肪酸)外,还具有还原硝酸盐和积累磷的能力,所以它的脱氮除磷效果远高于其他微生物。
(1)下列关于分离和培养“惠芳中科微菌”的过程,描述不正确的是________。?
A.分离和培养过程的关键是防止外来杂菌的入侵
B.培养“惠芳菌”的培养基应灭菌后才能使用
C.接种过程要将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环的金属丝烧红
D.用平板划线法接种后,一定会得到“惠芳菌”的单菌落
(2)“惠芳菌”在生态系统中属于________,培养“惠芳菌”的培养基中应含有__________________等营养物质。?
(3)“惠芳菌”还有哪些方面的应用?试举例说明。
【解析】(1)分离和培养微生物过程的关键是防止外来杂菌的入侵,A正确;培养基应灭菌后才能使用,B正确;接种环放在火焰上灼烧,为了灭菌充分,应该将接种环的金属丝烧红,C正确;用平板划线法接种,由于操作过程和划线次数等原因,不一定会得到单菌落,D错误。(2)由材料可知“惠芳菌”是分解者。培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源等营养物质。(3)从题干中可分析出“惠芳菌”具有还原硝酸盐和积累磷的能力,脱氮除磷效果远高于其他微生物,所以可以用于吸收环境中的氮和磷。
答案:(1)D (2)分解者 水、无机盐、碳源、氮源
(3)“惠芳菌”脱氮除磷效果好,还可以应用于治理水体富营养化等(合理即可)。
课时素养评价
二 微生物的基本培养技术
【基础达标】(20分钟·70分)
一、选择题(共8小题,每小题5分,共40分)
1.下表为某培养基的配方,下列叙述正确的是
( )
成分
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
含量
10
g
10
g
2
g
0.4
g
0.065
g
1
000
mL
A.从物理性质看该培养基属于固体培养基
B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖,属于氮源的物质是蛋白胨
C.该培养基缺少提供生长因子的物质
D.该培养基不能培养异养微生物
【解析】选B。分析表中成分可知,该培养基中没有凝固剂,为液体培养基,A错误;该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源,也是碳源,而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源,B正确;该培养基中存在的蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子,C错误;该培养基中含有有机碳源,能用于培养异养微生物,D错误。
【补偿训练】
将相同的大肠杆菌样液分别接种于成分不同的三种培养基中,36小时后统计菌落数,结果如下表。下列叙述不正确的是
( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A.葡萄糖是培养基中的碳源也是能源
B.配制培养基过程中应先灭菌后倒平板
C.Ⅰ和Ⅱ对照,说明生长因子不利于大肠杆菌的生长
D.Ⅱ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖
【解析】选C。葡萄糖是培养基中的碳源也是能源,A正确;配制培养基过程中应先灭菌后倒平板,B正确;Ⅰ和Ⅱ对照,说明大肠杆菌的生长需要生长因子,C错误;Ⅱ和Ⅲ对照,说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖,D正确。
2.(2020·徐州高二检测)不同的微生物对营养物质的需要各不相同。一种自养微生物在以CO2为唯一碳源的培养基中培养,下列说法不正确的是
( )
A.氮源物质为该微生物提供必要的氮素
B.碳源物质也为该微生物提供能量
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
【解析】选B。培养基中的氮源物质可以为该微生物提供必要的氮素,A正确;该微生物只能以二氧化碳作为唯一碳源,二氧化碳不能为该微生物提供能量,B错误;无机盐可以为微生物提供碳、氮以外的重要元素,是该微生物不可缺少的营养物质,C正确;水是生物体新陈代谢不可缺少的物质,是该微生物的营养要素之一,D正确。
3.金黄色葡萄球菌有很强的致病力,常引起骨髓炎等,还可能引起食物中毒。下列实验结束后的做法错误的是
( )
A.对接种环进行灼烧处理
B.带菌培养基必须经高压蒸汽灭菌锅灭菌后才能倒掉
C.做完实验后,在实验室内可以饮水
D.接种后双手必须经肥皂洗净,再用70%的酒精棉球擦拭
【解析】选C。实验结束后应将金黄色葡萄球菌杀死,以免使人致病,接种环应用灼烧灭菌,A正确;带菌的培养基要经高压蒸汽灭菌后才能倒掉,以免污染环境,B正确;在微生物培养的实验室中,不能吃东西、饮水等,C错误;接种后双手必须用肥皂洗净,再用70%的酒精棉球擦拭,D正确。
4.关于酵母菌的纯培养实验操作,下列说法正确的是
( )
A.配制培养基、倒平板、接种需要在酒精灯火焰旁进行
B.倒平板时,倒入的培养基冷却后盖上培养皿的皿盖
C.划线接种时,灼烧接种环后立即进行再次划线
D.划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养
【解析】选D。配制培养基不需要在酒精灯火焰旁进行,A错误。倒平板时,应立即盖上培养皿的皿盖,B错误。划线接种时,灼烧接种环冷却后进行再次划线,C错误。划线接种结束后,需将平板倒置后放入培养箱中培养,D正确。
5.下列依次表示倒平板、接种的位置,以及平板划线法接种的路径示意图,其中错误的是
( )
【解析】选D。倒平板时,用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙,右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿,左手立即盖上培养皿的皿盖,防止空气中的杂菌污染,A正确;左手将培养皿打开一条缝隙,右手将蘸有菌种的接种环迅速伸入平板内,B正确;不同区域内划线,而且每次转换划线角度后再进行划线,让菌种来源于上一次划线末端,C正确;下一次划线没有从上一次划线末端开始,D错误。
6.产生标准菌落的最初数目和培养基分别是
( )
A.同种少数细菌,液体培养基
B.许多细菌,液体培养基
C.同种少数细菌,固体培养基
D.许多细菌,
固体培养基
【解析】选C。菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体,形成于固体培养基上,有一定的形态结构,所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落,形态结构是相同的;如果有许多细菌形成的菌落,
就不可能有比较标准的形态,所以C项正确。
7.(2020·郑州高二检测)下列有关微生物培养及培养基的描述错误的是( )
A.培养基必须包含的成分有碳源、氮源、水、无机盐、生长因子及琼脂
B.根据物理性质不同,培养基可分为固体培养基和液体培养基
C.培养细菌时需要把培养基的pH调至中性或微碱性
D.平板划线法接种时需要在酒精灯火焰旁进行操作
【解析】选A。各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐,此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求,A错误;根据物理性质不同,培养基可分为固体培养基和液体培养基,B正确;培养细菌时需要把培养基的pH调至中性或微碱性,C正确;平板划线法接种时需要在酒精灯火焰旁进行操作,防止杂菌污染,D正确。
8.接种是微生物培养和分离等过程的必要步骤之一。下列关于接种的叙述不正确的是
( )
A.接种通常指无菌条件下将微生物接入培养基的操作
B.接种前需要对接种环灼烧灭菌,接种后则无须灭菌
C.接种通常在酒精灯火焰附近进行
D.接种环不能将培养基的表面划破
【解析】选B。无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程称为接种,A正确;接种前需要对接种环灼烧灭菌,接种后也需灭菌,防止污染环境和感染操作者,B错误;为避免杂菌污染,接种通常在酒精灯火焰附近进行,C正确;接种时接种环不能将培养基的表面划破,D正确。
二、非选择题(共2小题,共30分)
9.(12分)将马铃薯去皮切块,加水煮沸至马铃薯软烂,过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量葡萄糖和琼脂,用蒸馏水定容后灭菌,得到马铃薯琼脂培养基。回答下列问题:
(1)马铃薯琼脂培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质,营养物质类型除氮源外还有______________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后,可参与合成的生物大分子有________________________(答出两点即可)。?
(2)分离培养酵母菌通常使用马铃薯琼脂培养基,该培养基在进行接种前要进行______________。将酵母菌菌种划线接种在平板上,培养一段时间后可观察到菌落,菌落的含义是__________________________。
(3)该培养基按物理性质划分属于__________培养基,若要对酵母菌进行扩大培养,此培养基中不应加入的物质是__________。?
【解析】(1)马铃薯浸出液中含有淀粉、蛋白质、脂质、无机盐、水等多种物质,因此,除氮源外其中还有微生物生长所需要的碳源、无机盐等营养要素。进入细胞的氮源可参与合成蛋白质、核酸(DNA、RNA)等含氮的生物大分子。(2)培养基在使用前常用高压蒸汽灭菌法灭菌;菌落概念见答案。(3)该培养基中有凝固剂,属于固体培养基,对微生物进行扩大培养,一般用液体培养基。
答案:(1)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(2)(高压蒸汽)灭菌 分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成的肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体
(3)固体 琼脂
10.(18分)自然界中有多种微生物,将其进行合理筛选、培养和应用,能给医药和化工等生产领域带来巨大经济效益。回答下列问题。
(1)对培养基进行灭菌时,多采取____________法,即将培养基置于____________条件下维持15～30分钟,目的是杀死培养基中的____________。对接种环灭菌时则用____________法。?
(2)若要将微生物采用平板划线法进行分离操作,在固体培养基表面连续进行了4次划线,则需要对接种环灼烧____________次。平板划线在做第二次及其后的划线操作时,要从上次划线的____________开始划线,最后一次划的线不能与第一次划的线____________。?
(3)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱中____________培养,以减少培养基中的水分挥发。其中,培养未接种的固体培养基是为了______________________。?
【解析】(1)对培养基进行灭菌时,多采取高压蒸汽灭菌法,即将培养基置于压
力100
kPa、温度121
℃条件下维持15～30分钟,目的是杀死培养基中的所有微
生物(微生物和芽孢、孢子)。对接种环灭菌用灼烧灭菌法。(2)接种环在每次
接种前都要灼烧灭菌,最后一次接种完也要灭菌,所以在固体培养基表面连续进
行了4次划线,则需要对接种环灼烧5次。平板划线在做第二次及其后的划线操
作时,要从上次划线的末端开始划线,使菌体的数目随着划线次数的增加而逐渐
减少,最终获得由单个菌体形成的单个菌落。最后一次划的线不能与第一次划
的线相连。(3)将接种后的固体培养基和一个未接种的固体培养基放入恒温箱
中倒置培养,以减少培养基中的水分挥发。培养未接种的固体培养基是为了作为对照组,排除培养基被杂菌污染。
答案:(1)高压蒸汽灭菌 压力100
kPa、温度121
℃ 所有微生物(微生物和芽孢、孢子)
灼烧灭菌
(2)5 末端 相连(或相接、相交等意思正确即可)
(3)倒置 作为对照组,排除培养基被杂菌污染
【互动探究】
在平板划线法操作过程中,为什么在第二次及以后划线时,总是从上一次划线的末端开始?
提示:目的是将聚集的菌种逐步稀释,以便得到单菌落。
【能力提升】(10分钟·30分)
1.(5分)下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖;甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能;乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,甲、丙都不能。下列说法正确的是
( )
粉状硫
10
g
K2HPO4
4
g
FeSO4
0.5
g
蔗糖
10
g
(NH4)2SO4
0.4
g
H2O
100
mL
MgSO4
9.25
g
CaCl2
0.5
g
Ⅰ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A.甲、乙、丙都是异养微生物
B.甲、乙都是自养微生物、丙是异养微生物
C.甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物
D.甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物
【解析】选C。甲能在Ⅰ中正常生长繁殖,而乙和丙都不能,而Ⅰ培养基缺氮,说明甲能够自身固氮,属于固氮微生物。乙能在Ⅱ中正常生长繁殖,而甲和丙都不能,Ⅱ培养基中没有有机碳源,说明乙能够合成有机物,属于自养微生物。丙不能在Ⅰ培养基生长繁殖,说明不能固氮,又不能在Ⅱ培养基中生长繁殖,说明不能合成有机物,只能在Ⅲ培养基中生长繁殖,说明属于异养微生物。
2.(5分)(不定项)(2019·江苏高考改编)下列关于微生物实验操作的叙述,正确的是
( )
A.培养微生物的试剂和器具都要进行高压蒸汽灭菌
B.接种前后,接种环都要在酒精灯火焰的充分燃烧层进行灼烧
C.接种后的培养皿要倒置,以防培养基污染
D.可以使用固体培养基将菌种分离并获得纯培养物
【解析】选B、C、D。接种室、接种箱等常用紫外线消毒法处理,接种环等常用灼烧灭菌法处理,吸管、培养皿等常用干热灭菌法处理,培养基等用高压蒸汽灭菌法处理,A错误;为了防止杂菌污染,每次接种前后,接种环都要进行灼烧灭菌,B正确;接种后,培养皿需要倒置,以防皿盖上水珠落入培养基造成污染,C正确;分离菌种可以用平板划线法和稀释涂布平板法,所用培养基为固体培养基,分离得到的单菌落即纯培养物,D正确。
3.(5分)(不定项)某研究小组用平板划线法从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是
( )
A.培养基转移到培养皿后进行灭菌
B.转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线
C.接种时不能划破培养基,否则难以达到分离单菌落的目的
D.划线操作时完全打开皿盖,划完立即盖上
【解析】选B、C。在配制培养基的过程中要先高压蒸汽灭菌后分装到培养皿,A错误;转换划线角度后要对接种环进行灼烧灭菌,冷却后再进行划线,B正确;接种环不应划破培养基表面,否则不能分离得到单菌落,C正确;划线时皿盖打开一条缝,右手于火焰附近处将接种环迅速伸入平板内,划三至五条平行线,盖上皿盖,而不是完全打开皿盖,D错误。
4.(15分)(2019·全国卷Ⅲ)回答下列与细菌培养相关的问题。
(1)在细菌培养时,培养基中能同时提供碳源、氮源的成分是_________
______________(填“蛋白胨”“葡萄糖”或“NaNO3”)。通常,制备培养基时要根据所培养细菌的不同来调节培养基的pH,其原因是__________________
______________________________________。硝化细菌在没有碳源的培养基上________________(填“能够”或“不能”)生长,原因是___________。?
(2)用平板培养细菌时一般需要将平板____________(填“倒置”或“正置”)。?
(3)单个细菌在平板上会形成菌落,研究人员通常可根据菌落的形状、大小、颜色等特征来初步区分不同种的微生物,原因是___________________________
____________________________________________。?
(4)有些使用后的培养基在丢弃前需要经过______________处理,这种处理可以杀死丢弃物中所有的微生物。?
【解析】(1)蛋白胨含有C、H、O、N等元素,葡萄糖只含有C、H、O,NaNO3不含有C,所以培养基中蛋白胨能同时提供碳源和氮源。不同细菌生长繁殖所需要的pH不同,因此培养不同的细菌,需要调节培养基的不同pH。硝化细菌属于化能自养型细菌,可以将空气中的二氧化碳等无机物合成为有机物,它可以在没有碳源的培养基上生长。
(2)用平板培养基培养细菌时,一般需要将平板倒置,以防止培养皿盖上凝结的水珠滴落,导致污染。
(3)不同种的微生物在一定条件下培养,可在培养基上形成大小、颜色、形状等不同的菌落,这是一种比较稳定的特征,可根据菌落的特征区分不同种的微生物。
(4)使用后的培养基需要用强烈的物理或化学手段进行灭菌,以杀灭其中所有的微生物,避免污染环境。
答案:(1)蛋白胨 不同细菌生长繁殖所需的pH不同 能够 硝化细菌可以利用空气中的CO2作为碳源
(2)倒置
(3)在一定的培养条件下,不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征
(4)灭菌
