二 微生物的选择培养和计数
必备知识·素养奠基
一、选择培养基
1.实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于目的菌生长的条件(包括营养、温度、pH等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。
2.选择培养基概念:在微生物学中,允许特定种类的微生物生长,同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
3.选择培养基配方的设计:
(1)原理:分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生NH3。
(2)培养基配方设计:以尿素为唯一氮源的选择培养基。
如果要从土壤中分离出固氮微生物,那么对培养基有什么要求呢?
提示:固氮微生物能利用空气中的N2,因此培养基中不应添加氮源,这样就只有固氮微生物才能生存。
二、微生物的选择培养
1.方法:对样品进行充分稀释,然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。
2.稀释涂布平板法的操作过程:
(1)系列梯度稀释操作:
(2)涂布平板操作。
①取菌液:取0.1__mL菌液,添加到培养基表面。?
②涂布器灭菌:取出浸在酒精中的涂布器,放在火焰上燃烧,酒精燃尽后,冷却涂布器。
③涂布过程:用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,涂布时可转动培养皿,使菌液分布均匀。
3.培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板倒置,放入恒温培养箱中培养,观察。
在进行稀释操作时,需要在酒精灯火焰附近操作吗?解释原因。
提示:需要。在进行稀释操作时,如果不在酒精灯火焰附近进行,就有可能造成杂菌污染。
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法:
(1)统计依据。
当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(2)操作。
①一般选择菌落数为30～300的平板进行计数。
②选用一定稀释范围的样品液进行培养,在同一稀释度下,应至少对3个平板进行重复计数,然后求平均值。
2.显微镜直接计数:利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下观察、计数,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
四、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题:如何分离土壤中分解尿素的细菌?每克土壤样品中含有多少分解尿素的细菌?
2.基础知识:
组分
含量
提供的主要营养
KH2PO4
1.4
g
无机盐
Na2HPO4
2.1
g
MgSO4·7H2O
0.2
g
葡萄糖
10.0
g
碳源
尿素
1.0
g
氮源
琼脂
15.0
g
凝固剂
H2O
定容至1
000
mL
水
3.实验设计:
(1)土壤取样:先铲去表层土,取距地表3～8
cm的土壤层,将样品装入纸袋中。
(2)样品稀释:一般选用1×__104、1×__105、1×__106倍的稀释液进行平板培养。?
(3)微生物的培养与观察:一般在30～37__℃的温度下培养1～2天,每隔24__h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果。?
4.操作提示:
选出下列关于实验操作的正确说法①②⑤。
①本实验耗时长,应提前制订好计划,提高效率。
②本实验用到的器材比较多,应该对试管和平板做好标记。
③取土样的铁铲和取样纸袋使用前都要经过消毒。
④为了防止杂菌污染,从酒精中取出的涂布器应该直接在酒精灯火焰上充分燃烧灭菌。
⑤过热的涂布器不能直接放在盛有酒精的烧杯中。
5.结果分析与评价:
结合实验过程,判断下列实验分析的正误:
(1)由于使用了选择培养基,因此本实验不需要设置对照
组。
(×)
提示:应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
(2)在同一稀释度下,至少要涂布3个平板。
(√)
(3)当菌落数目稳定时,选取菌落数在
30～300
的平板进行计数。
(√)
(4)应该仔细观察培养基上菌落的形状、大小、颜色等特征,并要做好记录。
(√)
(5)统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。
(×)
提示:统计的菌落数目还要经过计算才能代表样品中的活菌数目,而且数目偏低,因为当两个或多个细菌连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
选择培养基上生长分解尿素的细菌之后,pH会发生变化吗?解释原因。
提示:会升高。分解尿素的细菌可以将尿素分解成NH3,导致培养基的pH升高。
关键能力·素养形成
知识点一 微生物的选择培养与计数方法
1.选择培养的目的:从众多微生物中分离出需要的特定微生物。
2.筛选微生物常用培养基——选择培养基和鉴别培养基:
选择培养基
鉴别培养基
特殊成分
控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素)
加入某种指示剂或化学药品
目的
抑制其他微生物生长,促进目的微生物的生长
与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途
培养、分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
举例
培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素,抑制细菌生长;用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
3.稀释涂布平板法:
(1)主要操作环节:系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示:
(3)计算公式:
每克样品中的菌株数=×稀释倍数
(4)计数结果:由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,计算结果比实际值偏小。
4.稀释涂布平板法操作注意问题:
(1)稀释操作时:每支试管及其中的9
mL水、移液管等均需灭菌;操作时,试管口和移液管应在离火焰1～2
cm
处。
(2)涂布平板时。
①涂布器浸在体积分数为70%的酒精中,取出时,让多余酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适,移液管管头不接触任何物体。
(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上,经涂布、培养,计算出菌落平均数。
5.两种纯化方法的比较:
主要方法
平板划线法
稀释涂布平板法
主要步骤
接种环在固体培养基表面连续划线
系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具
接种环
涂布器
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用于计数
不能计数
可以计数,但是操作复杂,需涂布多个平板
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单细胞菌落,达到分离纯化微生物的目的,也可用于观察菌落特征
6.显微镜直接计数:
(1)原理:此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法:显微镜下观察,细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式:
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10
000×稀释倍数
(4)缺点:统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和,计算结果比实际值偏大。
(2020·全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解,会对环境造成污染,只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基,甲的组分为无机盐、水和S,乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题:
(1)实验时,盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是__________________。甲、乙培养基均属于________________培养基。?
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107
个/mL,若要在每个平板上涂布100
μL
稀释后的菌液,且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个,则至少应将摇瓶M中的菌液稀释__________倍。?
(3)在步骤⑤的筛选过程中,发现当培养基中的S超过某一浓度时,某菌株对S的降解量反而下降,其原因可能是________________________________(答出1点即可)。?
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数,请写出主要实验步骤____________________________________。?
(5)上述实验中,甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同,但都能为细菌的生长提供4类营养物质,即__________________。?
【解析】本题主要考查培养基的类型及其应用、无菌技术和微生物的分离与计数。
(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中③④过程可知,甲为液体培养基,乙为固体培养基,所以乙培养基中需要加入的Y为琼脂。甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株,因此均属于选择培养基。
(2)若要在每个平板上涂布100
μL稀释后的菌液,且每个平板上长出的菌落数不超过200个,根据计算公式:细菌细胞数=(C÷V)×M可知,稀释倍数M=2×107×V÷C=2×107÷1000×100÷200=104(倍)。
(3)当培养基中的S超过某一浓度后,可能会抑制菌株的生长,从而造成其对S的降解量下降。
(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数,可以取淤泥加无菌水制成菌悬液,稀释涂布到乙培养基上,培养后进行计数。
(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。
答案:(1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
(2)104 (3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)取淤泥加入无菌水,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数
(5)水、碳源、氮源和无机盐
【误区警示】稀释涂布平板法分离微生物常见误区
(1)误认为不用涂布均匀:用涂布器涂布平板时一定要涂布均匀,否则难以得到单菌落。
(2)误认为不用冷却:涂布器使用前应进行酒精浸泡,然后灼烧灭菌,冷却之后再涂布,否则会由于温度过高杀死菌种。
【素养·迁移】
(2020·枣庄高二检测)筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段,下列有关技术中不能筛选成功的是
( )
A.在全营养的LB培养基(普通培养基)中,筛选大肠杆菌
B.在尿素固体培养基中,筛选能够分解尿素的微生物
C.用纤维素为唯一碳源的培养基,筛选能分解纤维素的微生物
D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠,筛选抗盐突变体的微生物
【解析】选A。在全营养的LB培养基中,几乎所有细菌都能生长,不能筛选出大肠杆菌,A错误;在尿素固体培养基中,只有能分解尿素的微生物才能生长,不能分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长,能够筛选分解尿素的微生物,B正确;在纤维素为唯一碳源的培养基上,只有能分解纤维素的微生物才能生长,不能分解纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长,能筛选分解纤维素的微生物,C正确;在培养基中加入不同浓度的氯化钠,能筛选抗盐突变体微生物,D正确。
【补偿训练】
下列关于测定土壤中微生物数量的叙述,不正确的是
( )
A.显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大
B.当样品的稀释度足够高时,一个活菌会形成一个菌落
C.采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
D.统计菌落数目时,只要菌落数目在30～300的平板都可以计数,并以它们的平均值作为统计结果
【解析】选D。显微镜直接计数统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和,计算结果比实际值偏大,A正确;当样品的稀释度足够高时,一个活菌会形成一个菌落,B正确;采用平板计数法获得的菌落有可能是由多个细菌形成的,所以往往少于实际的活菌数,C正确;统计菌落数目时,应选择同一稀释倍数下涂布的菌落数量为30～300之间的平板进行计数,D错误。
知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分离菌种的原理:
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上,只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素,而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,会因缺乏氮源而无法生长繁殖。
2.实验流程示意图:
3.实验操作过程:
流程
具体操作
操作提示
土壤取样
先铲去表层土,取距地表
3～8
cm的土壤层,将样品装入纸袋中
①适宜在富含有机质,酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备培养基
分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组,用来判断选择培养基是否具有选择的作用
样品的稀释和涂布
①火焰旁称取土壤样本②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组
①注意无菌操作
②对所用的平板、试管做好标记③初次实验对于稀释的范围没有把握,可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
培养、观察和计数
①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养②每隔24
h统计一次菌落数目,比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等,并做好记录③当菌落数目稳定时,选取菌落数在30～300
的平板进行计数
①空白平板作为对照,检测培养基制备是否合格②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等③在同一稀释度下,至少对3个平板进行计数,然后求出平均值,并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
4.实验结果分析:
内 容
现 象
结 论
有无杂菌污染的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样,菌落数偏高
培养基中混入其他杂菌
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样,统计结果应接近
5.鉴定原理:分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3,使培养基的碱性增强,pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌,若指示剂变红,可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
【特别提醒】实验中的两种“对照组”与“重复组”
(1)两种对照组作用比较。
①判断培养基中“是否有杂菌污染”,需将未接种的培养基(空白对照组)同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”,需设置完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)进行接种培养,观察两种培养基上菌落数目,进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用:为排除偶然因素对实验结果的干扰,在每一稀释度下宜设置3个平板作为重复组,选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板,用“平均值”代入计数公式计算活菌数。
巴氏芽孢杆菌是一类具有较高脲酶活性,能够分解尿素的细菌,广泛分布在土壤、堆肥及污水中。这种细菌能够将氮肥中的尿素分解成氨态氮被植物吸收,对土壤的肥力有着重要作用。研究人员拟从土壤样品中分离该类细菌,如图所示为操作流程,①～⑤表示操作步骤。请回答下列问题:
(1)制备培养基时,按照培养基配方准确称量各组分,将其溶解、定容后,调节培养基的______________,及时对培养基进行分装,并进行______________灭菌。?
(2)步骤②富集培养所使用的培养基按用途来分应为______________培养基,步骤②的主要目的是__?_________________________________________。?
(3)在步骤④的培养基中加入______________指示剂,根据培养基是否变红来鉴定是否为尿素分解菌。若用该方法培养设置了3个培养皿,菌落数分别为163个、158个、159个,则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为______________个,运用这种方法统计的结果往往较实际值______________。?
(4)要进一步分离纯化巴氏芽孢杆菌采用步骤⑤______________法进行操作,在该操作过程中接种工具至少要灼烧______________次。?
【解题导引】解答本题的两个关键知识点:
(1)培养基灭菌的方法:常用高压蒸汽灭菌。
(2)培养基种类的判断:富集培养目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度,所使用的培养基属于选择培养基。
【解析】(1)制备培养基时,操作过程为计算、称量、溶化、配制培养液、调节pH、分装、包扎、灭菌、倒平板,培养基需要进行高压蒸汽灭菌。(2)图中步骤②富集培养所使用的培养基属于选择培养基,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量)。(3)鉴别尿素分解菌时需要使用酚红指示剂,根据培养基是否变红来鉴定是否为尿素分解菌。富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为(163+158+159)
÷3÷0.1×103=1.6×106个,用稀释涂布平板法进行计数时,由于一个菌落可能是两个或多个微生物细胞的后代形成的,所以统计的结果往往较实际值偏低。(4)图中⑤分离纯化巴氏芽孢杆菌采用的方法是平板划线法,图中划线区域共4个,所以该操作过程中接种工具至少要灼烧4+1=5次。
答案:(1)pH 高压蒸汽(湿热) (2)选择 增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量) (3)酚红 1.6×106 偏低
(4)平板划线 5
【误区警示】从土壤中分离微生物的注意事项
(1)一般步骤:土壤取样、选择(富集)培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。
(2)选择分离过程中需要使用选择培养基,要做到全过程无菌操作。
(3)常用的固体培养基上的接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
上题步骤②中用到的培养基的氮源是什么物质?
提示:步骤②中用到的培养基属于选择培养基,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量),应该以尿素为氮源。
(2)科学思维——演绎与推理
某同学发现他涂布的培养基上菌落数目过多连成一片,请你帮他分析可能的原因并提出合理的处理措施。
提示:可能是稀释倍数不够,导致菌液浓度过高,可以通过增大稀释倍数解决。
【素养·迁移】
尿素是一种重要的农业肥料,但若不经细菌的分解,就不能更好地被植物利用。下列有关土壤中尿素分解菌的分离和培养的叙述,正确的是
( )
A.培养基中加入尿素作为唯一碳源,该培养基是鉴别培养基
B.测定土壤中分解尿素的细菌数量和测定土壤中放线菌的数量可采用相同的稀释度
C.细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高
D.利用稀释涂布平板法可以直接完成土壤中分解尿素的细菌的分离计数和纯化鉴定
【解析】选C。培养基中加入尿素作为唯一碳源,该培养基是选择培养基,A错误;因为土壤中各类微生物的数量不同,故为获得不同类型的微生物,要按不同的稀释倍数进行分离,B错误;细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,可加入酚红指示剂进行检测,C正确;鉴定分解尿素的细菌应该用加酚红的鉴别培养基,D错误。
【补偿训练】
在做分离分解尿素的细菌实验时,A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落,而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有
( )
①土样不同 ②培养基被污染
③操作失误 ④没有设置对照
A.①②③
B.②③④
C.①③④
D.①②④
【解析】选A。土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果,对照的设置对实验结果没有影响。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.下列关于微生物的培养与计数的描述正确的是①③④⑤。
①分离分解尿素的细菌要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基
②对微生物计数可以使用平板划线法和稀释涂布平板法接种微生物
③使用显微镜直接计数的统计结果比样品中的实际活菌数偏高
④在实验过程中,应遵循平行重复原则,同一稀释倍数下至少涂布三个平板
⑤进行微生物培养时要每隔24
h统计一次菌落的数目
⑥获得菌落数目为30～300的平板就说明实验操作成功
【解析】选①③④⑤。在以尿素为唯一氮源的选择培养基上,只有能利用尿素的微生物才能生长,①正确;对微生物计数使用稀释涂布平板法接种微生物,平板划线法无法计数,②错误;使用显微镜直接计数统计的是活菌和死菌的数量,结果比样品中的实际活菌数偏高,③正确;在实验过程中,应遵循平行重复原则,同一稀释倍数下至少涂布三个平板,④正确;进行微生物培养时要每隔24
h统计一次菌落的数目,⑤正确;应是在同一稀释倍数下,获得菌落数目为30～300
的平板,且差距不能过大,说明实验操作成功,⑥错误。
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是
( )
A.CO2和N2
B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素
D.葡萄糖和尿素
【解析】选D。合成脲酶的微生物能够分解尿素,所以碳源是葡萄糖,氮源是尿素。
3.用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时
( )
①可以用相同的培养基
②都需要使用接种环进行接种
③都需要在酒精灯火焰旁进行接种
④都可以用来计数活菌
A.①②
B.③④
C.①③
D.②④
【解析】选C。平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基,可以使用相同的培养基,①正确;平板划线法采用接种环进行操作,而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作,②错误;纯化时,要进行无菌操作,需要在酒精灯火焰旁接种,避免空气中的微生物混入培养基,③正确;平板划线法一般用于分离而不是计数,④错误。
4.(2020·浙江7月选考改编)下列关于微生物培养及利用的叙述,错误的是
( )
A.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物
B.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C.酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D.适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化
【解析】选A。本题主要考查微生物的培养条件和应用。尿素固体培养基上,由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖,而保留利用尿素的微生物,并非迅速杀死其他微生物,A项错误;不同的微生物所需的pH不同,所以配制培养基时,应根据微生物的种类调整培养基的pH,B项正确;酵母菌不能直接利用淀粉,应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化,再用酵母菌发酵得到糯米酒,C项正确;醋酸菌在有氧条件下能利用酒精产生醋酸,所以适宜浓度的酒精可以使醋酸菌活化,D项正确。
5.下列关于菌种计数方法的叙述不正确的是
( )
A.当样品的稀释度足够高时,能在培养基表面形成单个菌落
B.应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C.为了保证结果准确,一般采用密度较大的平板进行计数
D.在某一浓度下涂布三个平板,以它们的平均值作为统计结果
【解析】选C。当样品的稀释度足够高时,培养基表面一个活菌会形成一个菌落,A正确;应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据,B正确;为了保证结果准确,一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数,C错误;在某一浓度下涂布三个平板,若三个平板统计的菌落数差别不大,则应以它们的平均值作为统计结果以减小实验误差,D正确。
【思维·跃迁】
6.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯,然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程,请回答有关问题。
(1)若取土样6
g,应加入________mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大,需要不断加以稀释,配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2
mL加入固体培养基上,用涂布器将菌液铺平,每个稀释度下至少涂布3个平板,这种接种方法称为________。将接种的培养皿放置在37
℃恒温培养箱中培养24～48
h,观察并统计菌落数,结果如下表,其中________倍的稀释比较合适,由此计算出每克土壤中的菌落数为________。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目________(填“低”或“高”)。?
稀释倍数
103
104
105
106
107
菌落数/个
1号平板
478
367
277
26
5
2号平板
496
354
261
20
8
3号平板
509
332
254
29
3
(2)若研究尿素分解菌的群体生长规律,可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时,接种环通过灼烧灭菌,在第二次及以后划线时,总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是___________________________。?
将分离纯化后的单个菌落进行液体培养,可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1
mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算,设5个中方格中总菌数为45,菌液稀释倍数为102
,那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
?
【解析】(1)根据题意分析,需要稀释10倍的土壤溶液,因此应该将6
g土样加入54
mL的无菌水进行配制;将103～107倍的稀释液分别吸取0.2
mL加入固体培养基上,用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上;估算样品中的活菌数时,往往选取菌落数在30到300之间的平板,分析表格中数据可知,稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围;每克土壤中的菌落数为(277+261+254)÷3×105÷0.2÷6=2.2×107。稀释涂布平板法进行微生物计数时,由于菌落之间会相互重叠,因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时,为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落,在第二次及以后划线时,总是从上一次的末端开始划线。若以一个大方格(体积为0.1
mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算,设5个中方格中总菌数为45,菌液稀释倍数为102
,那么原菌液的菌群密度=45×5÷0.1÷10-3×102=2.25×108个/mL。
答案:(1)54 稀释涂布平板法 105 2.2×107 低 (2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落 2.25×108
【拓展·探究】
7.反刍动物的瘤胃中有许多能分解尿素的微生物。为了研究利用尿素配制的反刍动物饲料,以替代部分蛋白质饲料,降低饲料成本,进行了相关实验。请回答下列问题:
(1)尿素是尿素分解菌的氮源,因此在配制培养基时________。?
A.葡萄糖在培养基中含量越多越好
B.尿素在培养基中含量越少越好
C.尿素分解菌无固氮能力,故培养基中的氮源为尿素
D.尿素分解菌有固氮能力,故培养基中尿素为无机氮
(2)瘤胃中的尿素分解菌能将尿素分解成________,其中的________可用于合成微生物蛋白,该蛋白质是反刍动物的优质氮源。?
(3)为研究瘤胃中尿素分解菌的种类,实验者配制以尿素为唯一氮源的培养基,该培养基从功能上属于________培养基。可在培养基中加入________指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素,为确证这些菌是尿素分解菌,可通过酶活性测定及基因数据库比对,只有具有脲酶活性和________基因的菌,才是真正的尿素分解菌。?
(4)研究发现,如果只饲喂尿素配制的饲料,会导致反刍动物氨中毒,请根据高中所学知识分析其原因是?_____________________________________。?
【解析】(1)尿素既可以作为尿素分解菌的氮源,也可以作为其碳源,葡萄糖在培养基中并不是越多越好,A项错误;添加尿素的目的是筛选尿素分解菌,其他微生物不能很好地生活在该培养基上,尿素在培养基中不是越少越好,过少就失去选择作用,过多又会使细胞失水死亡,B项错误;尿素分解菌没有固氮能力,故培养基中需要添加尿素作为有机氮源,C项正确,D项错误。(2)尿素分解菌能将尿素分解成CO2和NH3,其中的NH3可用于合成微生物蛋白,为反刍动物提供优质氮源。(3)以尿素为唯一氮源的培养基,尿素分解菌可以生存,而其他微生物不能存活,因此该培养基从功能上属于选择培养基;可在培养基中加入酚红指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素;为确证这些菌是尿素分解菌,可通过酶活性测定及基因数据库比对,只有具有脲酶活性和脲酶基因的菌,才是真正的尿素分解菌。(4)如果只饲喂尿素配制的饲料,会导致反刍动物氨中毒,原因是氨会使瘤胃液pH增大。
答案:(1)C (2)CO2和NH3 NH3 (3)选择 酚红 脲酶 (4)氨会使瘤胃液pH增大
三 微生物的选择培养和计数
(20分钟·70分)
一、选择题(共8小题,每小题5分,共40分)
1.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长;在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出
( )
①大肠杆菌 ②霉菌 ③放线菌 ④固氮细菌
A.④②③
B.①②③
C.①③④
D.只有③④
【解析】选A。缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长,而固氮细菌能生长;在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成,而霉菌属于真核生物,故能生长;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长,对放线菌的生长无影响。
2.稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是
( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
【解题关键】解答本题需明确梯度稀释的目的以及防止杂菌污染的做法。
【解析】选C。若菌液浓度过大,形成的菌落连在一起,得不到单个的菌落。
【互动探究】
(1)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落,原因是什么?
提示:可能是稀释度不够,聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
(2)题中如果不进行D项操作,培养基上得到的菌落可能有哪些变化?
提示:菌落种类和数目增多。
3.下列是关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述,其中错误的是
( )
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释倍数
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种的牛肉膏蛋白胨培养基作对照
C.将实验组和对照组平板倒置,25
℃恒温培养24～48小时
D.选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数
【解析】选C。利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释倍数,稀释倍数太低,菌落太多会长在一起,稀释倍数太高,平板上菌落数目过少,都不易进行计数,A正确;若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种了的没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基作对照,B正确;将实验组和对照组平板倒置,30～37
℃恒温培养24～48小时,C错误;计数时通常选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数,D正确。
【补偿训练】
下列关于能分解尿素的细菌的说法,正确的是
( )
A.能分解尿素的原因是能合成蛋白酶
B.分离该种细菌时以尿素作为唯一碳源
C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红
【解析】选D。酶具有专一性,分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成、分泌脲酶,A项错误;分离能分解尿素的细菌时以尿素作为唯一氮源,B项错误;环境中含有大量的尿素对分解尿素的细菌起了选择作用,而非诱导作用,C项错误;该菌产生的脲酶把尿素分解为氨后,使pH升高,可使酚红指示剂变红,但添加酸碱缓冲剂后,阻止了pH的升高,因此培养基不使酚红指示剂变红,D项正确。
4.关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中,下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的一组是
( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液
④涂布平板 ⑤微生物的培养
A.①②③④⑤ B.②③④⑤
C.③④⑤
D.②③④
【解析】选D。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验需进行无菌操作,其中①土壤取样是在室外进行,⑤微生物的培养是在恒温箱中进行,其余过程都需要在酒精灯火焰旁进行,D项正确。
5.某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量,并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是
( )
A.利用平板划线法对细菌进行计数
B.以石油为唯一碳源的培养基筛选
C.采用稀释涂布平板法分离菌种
D.称取和稀释土壤时应在酒精灯火焰旁
【解析】选A。平板划线法能对细菌分离纯化,但不能对细菌进行计数,稀释涂布平板法可以分离菌种还可进行计数,A错误。
6.下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述,错误的是
( )
A.常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B.平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C.稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D.用血细胞计数板计数统计的结果往往比稀释涂布平板法得到的结果偏大
【解析】选B。纤维素是纤维素分解菌的碳源,因此常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌;平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散,但不能用于微生物的计数;稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散并计数;用血细胞计数板计数微生物时,会将死的微生物计数在内,因此导致实验结果往往偏大。
7.(2020·绍兴高二检测)为研究泡菜腌制过程中起作用的微生物的种类及比例,需要进行分离培养。下列叙述错误的是
( )
A.配制培养基时,需要加适量的凝固剂
B.接种方法可选择平板划线分离法或稀释涂布平板法
C.需要设置未经接种的空白对照
D.培养需要在无氧条件下进行
【解析】选B。配制培养基时,需要加适量的凝固剂,制成固体培养基,用于微生物的分离,A正确;要研究微生物的种类及比例,应选用稀释涂布平板法进行接种,B错误。需要设置未经接种的空白对照,排除培养基被杂菌污染的可能,C正确;乳酸菌属于厌氧菌,需要在无氧条件下培养,D正确。
8.(2020·济南高二检测)如图为分离和纯化分解甲醛细菌的实验过程,其中LB培养基能使菌种成倍扩增,以下说法正确的是
( )
A.需要对活性污泥做灭菌处理
B.②中LB培养基应以甲醛为唯一碳源
C.目的菌种异化作用类型为厌氧型
D.经⑤处理后,应选择瓶中甲醛浓度最低的一组进一步纯化培养
【解析】选D。该实验是从活性污泥中分离和纯化分解甲醛细菌,则活性污泥不能灭菌,A错误;LB培养基使菌种成倍扩增,应用完全培养基培养,B错误;图示分解甲醛细菌进行振荡培养,属于需氧型细菌,C错误;经⑤处理后,瓶中甲醛浓度降低,甲醛浓度最低的一组中分解甲醛细菌纯度最高,可进一步纯化培养,D正确。
【互动探究】上题中从④到⑤在操作过程中的关键是什么?
提示:无菌操作:接种环需要灼烧灭菌,并等待接种环冷却后挑取菌种,防止菌种被高温杀死;操作完成后需将接种环在火焰上灼烧,以杀灭残留的微生物。
二、非选择题(共2小题,共30分)
9.(16分)(2020·乌鲁木齐高二检测)2020年,疫情期间,外卖成交量迅速攀升,外卖餐食的微生物污染状况也越来越多地受到人们的关注。研究人员通过实验探究了同种外卖餐食送达时的温度与其中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的数量关系。请回答下列有关问题:
(1)测量送达餐食的温度时,应测量餐食____________(填“表面”或“中心”)部位的温度。?
(2)通常采用固体培养基培养细菌并进行计数,在配制培养基时需加入____________作为凝固剂,并用____________法进行接种。?
(3)检测金黄色葡萄球菌时,通常在培养基中加入一定量的NaCl,像这样允许特定种类微生物生长的培养基称为____________培养基。为避免培养基中的菌落数太多影响计数,可对样品进行适度的____________。为了保证结果准确,一般选择菌落数为____________范围的平板进行计数。统计的菌落数往往会比活菌的实际数目低,原因是__?_____________________________________。?
(4)实验结果显示,送达温度与菌落数量呈负相关,因此送达温度较____________的餐食,合格率较高。
?
【解析】(1)餐食的表面温度较低,测量送达餐食的温度时,应测量餐食中心部位的温度。(2)固体培养基需要加入凝固剂琼脂,稀释涂布平板法可以用来对菌落进行计数,从而得知细菌的数目。(3)金黄色葡萄球菌有较高的耐盐性,通常在培养基中加入一定量的NaCl可以筛选金黄色葡萄球菌,像这样允许特定种类微生物生长的培养基称为选择培养基。培养基中的菌落数太多会影响计数,因此可对样品进行适度的稀释。菌落太少误差较大,菌落太多容易聚集成一个菌落,因此为了保证结果准确,一般选择菌落数为30～300范围的平板进行计数。统计的菌落数往往会比活菌的实际数目低,原因是当两个或多个细胞聚集在一起,平板上观察到的只是一个菌落。(4)送达温度与菌落数量呈负相关,因此送达温度较高的餐食,说明含菌量较少,合格率较高。
答案:(1)中心 (2)琼脂 稀释涂布平板 (3)选择 稀释 30～300 当两个或多个细胞聚集在一起,平板上观察到的只是一个菌落 (4)高
10.(14分)为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量,并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题:
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。将1
mL水样稀释1
000倍,在3个平板上用涂布法分别接入0.1
mL稀释液。经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为39、38和37,据此可得出每升水样中的活菌数为________个。?
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时,接种环通过________灭菌,为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落,在第二次及以后的划线时,一定要____________________________,示意图A和B中,________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常,对获得的纯菌种可以依据________对细菌进行初步的鉴定和分类。?
(3)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是:振荡培养能提高培养液中________的含量,同时可使菌体与培养液充分接触,提高________的利用率。?
【解析】(1)由题意知,1
mL水样中的菌落数是(39+38+37)÷3÷0.1×1
000
=3.8×105,每升水样中的活菌数为3.8×105×103=3.8×108(个)。(2)接种环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后的划线时,总是从上一次划线的末端开始划线,这样做的目的是通过划线次数的增加,将聚集的菌体逐渐稀释分散,使每次划线时菌体的数目逐渐减少,以便获得由单个细胞繁殖而来的单个菌落。图A是用平板划线法接种培养后得到的结果,图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小等特征对细菌进行初步的鉴定和分类。(3)振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量,同时还能使菌体与培养液充分接触,提高营养物质的利用率。
答案:(1)3.8×108 (2)灼烧 从上一次划线的末端开始划线 B 菌落的形状、大小等特征 (3)溶解氧 营养物质
(10分钟·30分)
1.(5分)(不定项)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图,有关叙述正确的是
( )
A.在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH后高压蒸汽灭菌
B.步骤③采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培养基中加入尿素
C.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力
D.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落
【解题关键】明确以下两个关键点:
(1)配制培养基时,应该在灭菌之前调节pH。
(2)培养基的选择:以尿素为唯一氮源的选择培养基。
【解析】选A、C、D。在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH后高压蒸汽灭菌,A正确;要筛选出能高效分解尿素的细菌,所选用的培养基要以尿素为唯一氮源,但牛肉膏和蛋白胨中都含有尿素,因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏蛋白胨,B错误;步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力,C正确;步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落,D正确。
【方法规律】筛选微生物的三种方法
(1)单菌落挑取法:利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面,直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法:利用选择培养基对微生物进行选择培养,直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法:利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征,然后筛选目的微生物。
2.(5分)(不定项)(2019·北京高考改编)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后,若细菌能分解淀粉,培养平板经稀碘液处理,会出现以菌落为中心的透明圈(如图),实验结果见表。
菌种
菌落直径:C(mm)
透明圈直径:H(mm)
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述,正确的是
( )
A.培养基除淀粉外还含有氮源、无机盐等其他营养物质
B.筛选分解淀粉的细菌时,菌液应稀释后涂布
C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【解题关键】解答本题的两个关键信息:
(1)培养基的主要营养物质:碳源(淀粉)、氮源、水、无机盐和生长因子等营养物质。
(2)淀粉是大分子物质,被淀粉酶水解后才能被细胞吸收。
【解析】选A、B、D。本题考查微生物的筛选与鉴定。培养基含有碳源(淀粉)、氮源、水、无机盐和生长因子等营养物质,A项正确;为了得到单个细菌形成的菌落,菌液应该稀释后进行涂布,B项正确;这两种细菌形成的菌落周围均出现透明圈,说明均能将淀粉酶分泌到细胞外,C项错误;H/C值不同反映这两种细菌分解淀粉的能力不同,D项正确。
3.(20分)(2020·江苏高考)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株,科研人员开展了相关研究。请回答下列问题:
(1)常规微生物实验中,下列物品及其灭菌方法错误的是______________(填编号)。?
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧
(2)称取1.0
g某土壤样品,转入99
mL无菌水中,制备成菌悬液,经______________后,获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1
mL菌悬液涂布在固体培养基上,其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落,则该样本中每克土壤约含酵母菌______________个。?
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力,对分离所得的菌株,采用射线辐照进行________________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以______________为唯一碳源的固体培养基上,培养一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选择直径____________的菌落,纯化后获得A、B两突变菌株。?
(4)在处理含油废水的同时,可获得单细胞蛋白,实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能,进行了培养研究,结果如图。据图分析,应选择菌株____________进行后续相关研究,理由是__?__________________________。?
【解析】本题主要考查了微生物培养的灭菌、计数、分离筛选等知识。
(1)培养基一般进行高压蒸汽灭菌,接种环可用火焰灼烧灭菌,培养皿一般通过干热灭菌,涂布器应该用酒精引燃灭菌,故①②③正确,错误的是④。
(2)稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后,获得细胞密度不同的菌悬液,然后涂布到平板上。根据题意,1.0
g土壤样品转入99
mL无菌水中,制备成菌悬液,经系列梯度稀释后,分别取0.1
mL菌悬液涂布在固体培养基上,则稀释的倍数为1
000倍,其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落,则总的稀释倍数为10
000倍,故每克土壤中含酵母菌数为46×10
000=4.6×105个。
(3)根据题意,欲提高酵母菌产酶能力,可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐照,该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产
脂肪酶酵母菌突变株,可配制以脂肪为唯一碳源的培养基,将辐照处理后的酵母菌涂布在该固体培养基上,形成单菌落;产脂肪酶能力越强的酵母菌,分解利用脂肪的能力越强,菌落生长越好,一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选取直径较大的菌落即可。
(4)据题图分析可知,相同时间内,菌株B的细胞密度高于菌株A,而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量,故进行相关研究可选择菌株B,原因是菌株B增殖速度快,单细胞蛋白的产量也高,同时降解脂肪的能力强,净化效果更好。
答案:(1)④
(2)梯度稀释
4.6×105(或460
000)
(3)诱变 脂肪(或油脂) 较大
(4)B 该菌株增殖速度快,单细胞蛋白产量高;降解脂肪能力强,净化效果好(共115张PPT)
二 微生物的选择培养和计数
必备知识·素养奠基
一、选择培养基
1.实验室中微生物筛选的原理:人为提供有利于_______生长的条件(包括营养、
温度、pH等),同时_____或_____其他微生物的生长。
2.选择培养基概念:在微生物学中,允许_________的微生物生长,同时
___________其他种类微生物生长的培养基。
3.选择培养基配方的设计:
(1)原理:分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解产生___。
(2)培养基配方设计:以_____为唯一氮源的选择培养基。
目的菌
抑制
阻止
特定种类
抑制或阻止
NH3
尿素
【激疑】如果要从土壤中分离出固氮微生物,那么对培养基有什么要求呢?
提示:固氮微生物能利用空气中的N2,因此培养基中不应添加氮源,这样就只有固氮微生物才能生存。
二、微生物的选择培养
1.方法:对样品进行充分稀释,然后将_____涂布到制备好的_____培养基上。
2.稀释涂布平板法的操作过程:
(1)_________稀释操作:
菌液
选择
系列梯度
(2)涂布平板操作。
①取菌液:取______菌液,添加到___________。?
②涂布器灭菌:取出浸在_____中的涂布器,放在_____上燃烧,酒精燃尽后,
_____涂布器。
③涂布过程:用涂布器将菌液_____地涂布在培养基表面,涂布时可_____培养皿,
使菌液分布_____。
3.培养:待涂布的菌液被培养基吸收后,将平板_____,放入___________中培养,
观察。
0.1mL
培养基表面
酒精
火焰
冷却
均匀
转动
均匀
倒置
恒温培养箱
【激疑】在进行稀释操作时,需要在酒精灯火焰附近操作吗?解释原因。
提示:需要。在进行稀释操作时,如果不在酒精灯火焰附近进行,就有可能造成杂菌污染。
三、微生物的数量测定
1.稀释涂布平板法:
(1)统计依据。
当样品的_______足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中
的一个_____。通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活
菌。
(2)操作。
①一般选择菌落数为________的平板进行计数。
②选用_____________的样品液进行培养,在同一稀释度下,应至少对__个平板进
行重复计数,然后求_______。
稀释度
活菌
30～300
一定稀释范围
3
平均值
2.显微镜直接计数:利用特定的细菌计数板或_____________,在显微镜下观
察、_____,然后再计算一定体积的样品中微生物的数量。
血细胞计数板
计数
四、探究·实践——土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.提出问题:如何_____土壤中分解尿素的细菌?每克土壤样品中含有多少分解
尿素的细菌?
分离
2.基础知识:
组分
含量
提供的主要营养
KH2PO4
1.4
g
_______
Na2HPO4
2.1
g
MgSO4·7H2O
0.2
g
葡萄糖
10.0
g
_____
尿素
1.0
g
_____
琼脂
15.0
g
_______
H2O
定容至
1
000
mL
水
无机盐
碳源
氮源
凝固剂
3.实验设计:
(1)土壤取样:先铲去_______,取距地表_____cm的土壤层,将样品装入_____中。
(2)样品稀释:一般选用______________________倍的稀释液进行平板培养。?
(3)微生物的培养与观察:一般在_________的温度下培养1～2天,每隔____统计
一次菌落数目,选取_____________时的记录作为结果。?
表层土
3～8
纸袋
1×104、1×105、1×106
30～37℃
24h
菌落数目稳定
4.操作提示:
选出下列关于实验操作的正确说法_______。
①本实验耗时长,应提前制订好计划,提高效率。
②本实验用到的器材比较多,应该对试管和平板做好标记。
③取土样的铁铲和取样纸袋使用前都要经过消毒。
④为了防止杂菌污染,从酒精中取出的涂布器应该直接在酒精灯火焰上充分燃
烧灭菌。
⑤过热的涂布器不能直接放在盛有酒精的烧杯中。
①②⑤
5.结果分析与评价:
结合实验过程,判断下列实验分析的正误:
(1)由于使用了选择培养基,因此本实验不需要设置对照组。
(
)
提示:应该设置未接种的平板和接种在牛肉膏蛋白胨培养基的平板作为对照。
(2)在同一稀释度下,至少要涂布3个平板。
(
)
(3)当菌落数目稳定时,选取菌落数在
30～300
的平板进行计数。
(
)
×
√
√
(4)应该仔细观察培养基上菌落的形状、大小、颜色等特征,并要做好记录。
(
)
(5)统计的分解尿素的细菌菌落数目就是样品中分解尿素的活菌数目。(
)
提示:统计的菌落数目还要经过计算才能代表样品中的活菌数目,而且数目偏
低,因为当两个或多个细菌连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落。
√
×
【激疑】选择培养基上生长分解尿素的细菌之后,pH会发生变化吗?解释原因。
提示:会升高。分解尿素的细菌可以将尿素分解成NH3,导致培养基的pH升高。
关键能力·素养形成
知识点一 微生物的选择培养与计数方法
1.选择培养的目的:从众多微生物中分离出需要的特定微生物。
2.筛选微生物常用培养基——选择培养基和鉴别培养基:
选择培养基
鉴别培养基
特殊
成分
控制某一条件(如唯一氮源)或加入某种物质(如青霉素)
加入某种指示剂或化学药品
目的
抑制其他微生物生长,促进目的微生物的生长
与微生物的代谢产物或培养基中的成分发生特定反应
用途
培养、分离出特定微生物
鉴别不同的微生物
举例
培养酵母菌和霉菌,可在培养基中加入青霉素,抑制细菌生长;用以尿素为唯一氮源的培养基来培养尿素分解菌
可用伊红—美蓝培养基鉴定饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有,菌落呈深紫色,并带有金属光泽)
3.稀释涂布平板法:
(1)主要操作环节:系列梯度稀释和涂布平板。
(2)系列梯度稀释和涂布平板后培养结果如图所示:
(3)计算公式:
每克样品中的菌株数=
×稀释倍数
(4)计数结果:由于当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落,计算结果比实际值偏小。
4.稀释涂布平板法操作注意问题:
(1)稀释操作时:每支试管及其中的9
mL水、移液管等均需灭菌;操作时,试管口和移液管应在离火焰1～2
cm
处。
(2)涂布平板时。
①涂布器浸在体积分数为70%的酒精中,取出时,让多余酒精在烧杯中滴尽,然后将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。
②不要将过热的涂布器放在盛放酒精的烧杯中,以免引燃其中的酒精。
③酒精灯与培养皿距离要合适,移液管管头不接触任何物体。
(3)同一稀释度的样液加到三个或三个以上的平板上,经涂布、培养,计算出菌落平均数。
5.两种纯化方法的比较:
主要方法
平板划线法
稀释涂布平板法
主要
步骤
接种环在固体培养基表面连续划线
系列梯度稀释操作和涂布平板操作
接种工具
接种环
涂布器
菌体获取
在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体
从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体
能否用
于计数
不能计数
可以计数,但是操作复杂,需涂布多个平板
共同点
都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单细胞菌落,达到分离纯化微生物的目的,也可用于观察菌落特征
6.显微镜直接计数:
(1)原理:此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量。
(2)方法:显微镜下观察,细菌计数板或血细胞计数板计数。
(3)计算公式:
每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×10
000×稀释倍数
(4)缺点:统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和,计算结果比实际值偏大。
【素养案例】
(2020·全国Ⅰ卷)某种物质S(一种含有C、H、N的有机物)难以降解,会对环境造成污染,只有某些细菌能降解S。研究人员按照下图所示流程从淤泥中分离得到能高效降解S的细菌菌株。实验过程中需要甲、乙两种培养基,甲的组分为无机盐、水和S,乙的组分为无机盐、水、S和Y。
回答下列问题:
(1)实验时,盛有水或培养基的摇瓶通常采用____________________的方法进行灭菌。乙培养基中的Y物质是__________________。甲、乙培养基均属于________________培养基。?
(2)实验中初步估测摇瓶M中细菌细胞数为2×107
个/mL,若要在每个平板上涂布100
μL
稀释后的菌液,且保证每个平板上长出的菌落数不超过200个,则至少应将摇瓶M中的菌液稀释__________倍。?
(3)在步骤⑤的筛选过程中,发现当培养基中的S超过某一浓度时,某菌株对S的降解量反而下降,其原因可能是________________________________(答出1点即可)。?
(4)若要测定淤泥中能降解S的细菌细胞数,请写出主要实验步骤____________________________________。?
(5)上述实验中,甲、乙两种培养基所含有的组分虽然不同,但都能为细菌的生长提供4类营养物质,即__________________。?
【解析】本题主要考查培养基的类型及其应用、无菌技术和微生物的分离与计数。
(1)常用高压蒸汽灭菌法处理盛有水或培养基的摇瓶。由图中③④过程可知,甲为液体培养基,乙为固体培养基,所以乙培养基中需要加入的Y为琼脂。甲和乙培养基可以用于筛选能降解S的菌株,因此均属于选择培养基。
(2)若要在每个平板上涂布100
μL稀释后的菌液,且每个平板上长出的菌落数不超过200个,根据计算公式:细菌细胞数=(C÷V)×M可知,稀释倍数M=2×107×V÷C=2×107÷1000×100÷200=104(倍)。
(3)当培养基中的S超过某一浓度后,可能会抑制菌株的生长,从而造成其对S的降解量下降。
(4)要测定淤泥中能降解S的细菌的细胞数,可以取淤泥加无菌水制成菌悬液,稀释涂布到乙培养基上,培养后进行计数。
(5)甲和乙培养基均含有水、无机盐、碳源、氮源等成分。
答案:(1)高压蒸汽灭菌 琼脂 选择
(2)104 (3)S的浓度超过某一值时会抑制菌株的生长
(4)取淤泥加入无菌水,涂布(或稀释涂布)到乙培养基上,培养后计数
(5)水、碳源、氮源和无机盐
【误区警示】稀释涂布平板法分离微生物常见误区
(1)误认为不用涂布均匀:用涂布器涂布平板时一定要涂布均匀,否则难以得到单菌落。
(2)误认为不用冷却:涂布器使用前应进行酒精浸泡,然后灼烧灭菌,冷却之后再涂布,否则会由于温度过高杀死菌种。
【素养·迁移】
(2020·枣庄高二检测)筛选是分离和培养微生物新类型常用的手段,下列有关技术中不能筛选成功的是
( )
A.在全营养的LB培养基(普通培养基)中,筛选大肠杆菌
B.在尿素固体培养基中,筛选能够分解尿素的微生物
C.用纤维素为唯一碳源的培养基,筛选能分解纤维素的微生物
D.在培养基中加入不同浓度的氯化钠,筛选抗盐突变体的微生物
【解析】选A。在全营养的LB培养基中,几乎所有细菌都能生长,不能筛选出大肠杆菌,A错误;在尿素固体培养基中,只有能分解尿素的微生物才能生长,不能分解尿素的微生物因缺乏氮源不能生长,能够筛选分解尿素的微生物,B正确;在纤维素为唯一碳源的培养基上,只有能分解纤维素的微生物才能生长,不能分解纤维素的微生物因缺乏碳源不能生长,能筛选分解纤维素的微生物,C正确;在培养基中加入不同浓度的氯化钠,能筛选抗盐突变体微生物,D正确。
【补偿训练】
下列关于测定土壤中微生物数量的叙述,不正确的是
( )
A.显微镜直接计数计算的结果比实际值偏大
B.当样品的稀释度足够高时,一个活菌会形成一个菌落
C.采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
D.统计菌落数目时,只要菌落数目在30～300的平板都可以计数,并以它们的平均值作为统计结果
【解析】选D。显微镜直接计数统计的结果一般是活细菌和死细菌的总和,计算结果比实际值偏大,A正确;当样品的稀释度足够高时,一个活菌会形成一个菌落,B正确;采用平板计数法获得的菌落有可能是由多个细菌形成的,所以往往少于实际的活菌数,C正确;统计菌落数目时,应选择同一稀释倍数下涂布的菌落数量为30～300之间的平板进行计数,D错误。
知识点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分离菌种的原理:
在以尿素为唯一氮源的选择培养基上,只有能产生脲酶的微生物才能分解尿素,而缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素,会因缺乏氮源而无法生长繁殖。
2.实验流程示意图:
3.实验操作过程:
流程
具体操作
操作提示
土壤取样
先铲去表层土,取距地表
3～8
cm的土壤层,将样品装入纸袋中
①适宜在富含有机质,酸碱度接近中性的潮湿土壤中取样
②取样用的铁铲和取样的纸袋使用前都需要灭菌
制备
培养基
分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基
牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组,用来判断选择培养基是否具有选择的作用
流程
具体操作
操作提示
样品的稀释
和涂布
①火焰旁称取土壤样本
②将稀释倍数为103～107的稀释液涂布平板。每个稀释度至少涂布三个平板作为重复组
①注意无菌操作
②对所用的平板、试管做好标记
③初次实验对于稀释的范围没有把握,可选择一个较为宽泛范围103～107倍的稀释液
流程
具体操作
操作提示
培养、观察
和计数
①将涂布好的平板和空白平板放在适宜温度下的培养箱中倒置培养
②每隔24
h统计一次菌落数目,比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等,并做好记录
③当菌落数目稳定时,选取菌落数在30～300
的平板进行计数
①空白平板作为对照,检测培养基制备是否合格
②观察时还要记录不同菌落的形状、大小、颜色等
③在同一稀释度下,至少对3个平板进行计数,然后求出平均值,并根据平板所对应的稀释度计算出样品中活菌的数目
4.实验结果分析:
内 容
现 象
结 论
有无杂
菌污染
的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样,菌落数偏高
培养基中混入其他杂菌
选择培养
基的筛选
作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的
稀释操作
得到3个或3个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的
结果
若选取同一种土样,统计结果应接近
5.鉴定原理:分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为NH3,使培养基的碱性增强,pH升高。在选择培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌,若指示剂变红,可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
【特别提醒】实验中的两种“对照组”与“重复组”
(1)两种对照组作用比较。
①判断培养基中“是否有杂菌污染”,需将未接种的培养基(空白对照组)同时进行培养。
②判断选择培养基“是否具有筛选作用”,需设置完全培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)进行接种培养,观察两种培养基上菌落数目,进行对比得出结论。
(2)重复组的设置及作用:为排除偶然因素对实验结果的干扰,在每一稀释度下宜设置3个平板作为重复组,选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板,用“平均值”代入计数公式计算活菌数。
【素养案例】
巴氏芽孢杆菌是一类具有较高脲酶活性,能够分解尿素的细菌,广泛分布在土壤、堆肥及污水中。这种细菌能够将氮肥中的尿素分解成氨态氮被植物吸收,对土壤的肥力有着重要作用。研究人员拟从土壤样品中分离该类细菌,如图所示为操作流程,①～⑤表示操作步骤。请回答下列问题:
(1)制备培养基时,按照培养基配方准确称量各组分,将其溶解、定容后,调节培养基的______________,及时对培养基进行分装,并进行______________灭菌。?
(2)步骤②富集培养所使用的培养基按用途来分应为______________培养基,步骤②的主要目的是________________________________。?
(3)在步骤④的培养基中加入______________指示剂,根据培养基是否变红来鉴定是否为尿素分解菌。若用该方法培养设置了3个培养皿,菌落数分别为163个、158个、159个,则可以推测富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为______________个,运用这种方法统计的结果往往较实际值______________。?
(4)要进一步分离纯化巴氏芽孢杆菌采用步骤⑤______________法进行操作,在该操作过程中接种工具至少要灼烧______________次。?
【解题导引】解答本题的两个关键知识点:
(1)培养基灭菌的方法:常用高压蒸汽灭菌。
(2)培养基种类的判断:富集培养目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度,所使用的培养基属于选择培养基。
【解析】(1)制备培养基时,操作过程为计算、称量、溶化、配制培养液、调节pH、分装、包扎、灭菌、倒平板,培养基需要进行高压蒸汽灭菌。(2)图中步骤②富集培养所使用的培养基属于选择培养基,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量)。(3)鉴别尿素分解菌时需要使用酚红指示剂,根据培养基是否变红来鉴定是否为尿素分解菌。富集培养后的菌液中每毫升含活菌数为(163+158+159)÷3÷0.1×103=1.6×106个,用稀释涂布平板法进行计数时,由于一个菌落可能是两个或多个微生物细胞的后代形成的,所以统计的结果往往较实际值偏低。(4)图中⑤分离纯化巴氏芽孢杆菌采用的方法是平板划线法,图中划线区域共4个,所以该操作过程中接种工具至少要灼烧4+1=5次。
答案:(1)pH 高压蒸汽(湿热) (2)选择 增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量) (3)酚红 1.6×106 偏低
(4)平板划线 5
【误区警示】从土壤中分离微生物的注意事项
(1)一般步骤:土壤取样、选择(富集)培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。
(2)选择分离过程中需要使用选择培养基,要做到全过程无菌操作。
(3)常用的固体培养基上的接种方法是稀释涂布平板法和平板划线法。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——分析与综合
上题步骤②中用到的培养基的氮源是什么物质?
提示:步骤②中用到的培养基属于选择培养基,目的是增加巴氏芽孢杆菌的浓度(数量),应该以尿素为氮源。
(2)科学思维——演绎与推理
某同学发现他涂布的培养基上菌落数目过多连成一片,请你帮他分析可能的原因并提出合理的处理措施。
提示:可能是稀释倍数不够,导致菌液浓度过高,可以通过增大稀释倍数解决。
【素养·迁移】
尿素是一种重要的农业肥料,但若不经细菌的分解,就不能更好地被植物利用。下列有关土壤中尿素分解菌的分离和培养的叙述,正确的是
( )
A.培养基中加入尿素作为唯一碳源,该培养基是鉴别培养基
B.测定土壤中分解尿素的细菌数量和测定土壤中放线菌的数量可采用相同的稀释度
C.细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高
D.利用稀释涂布平板法可以直接完成土壤中分解尿素的细菌的分离计数和纯化鉴定
【解析】选C。培养基中加入尿素作为唯一碳源,该培养基是选择培养基,A错误;因为土壤中各类微生物的数量不同,故为获得不同类型的微生物,要按不同的稀释倍数进行分离,B错误;细菌合成的脲酶能将尿素分解成氨,氨会使培养基的碱性增强,pH升高,可加入酚红指示剂进行检测,C正确;鉴定分解尿素的细菌应该用加酚红的鉴别培养基,D错误。
【补偿训练】
在做分离分解尿素的细菌实验时,A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落,而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生的原因可能有
( )
①土样不同 ②培养基被污染
③操作失误 ④没有设置对照
A.①②③
B.②③④
C.①③④
D.①②④
【解析】选A。土样不同、培养基被污染和操作失误都会影响实验结果,对照的设置对实验结果没有影响。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.下列关于微生物的培养与计数的描述正确的是_________。
①分离分解尿素的细菌要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基
②对微生物计数可以使用平板划线法和稀释涂布平板法接种微生物
③使用显微镜直接计数的统计结果比样品中的实际活菌数偏高
④在实验过程中,应遵循平行重复原则,同一稀释倍数下至少涂布三个平板
⑤进行微生物培养时要每隔24
h统计一次菌落的数目
⑥获得菌落数目为30～300的平板就说明实验操作成功
①③④⑤
【解析】选①③④⑤。在以尿素为唯一氮源的选择培养基上,只有能利用尿素的微生物才能生长,①正确;对微生物计数使用稀释涂布平板法接种微生物,平板划线法无法计数,②错误;使用显微镜直接计数统计的是活菌和死菌的数量,结果比样品中的实际活菌数偏高,③正确;在实验过程中,应遵循平行重复原则,同一稀释倍数下至少涂布三个平板,④正确;进行微生物培养时要每隔24
h统计一次菌落的数目,⑤正确;应是在同一稀释倍数下,获得菌落数目为30～300
的平板,且差距不能过大,说明实验操作成功,⑥错误。
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是
( )
A.CO2和N2
B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素
D.葡萄糖和尿素
【解析】选D。合成脲酶的微生物能够分解尿素,所以碳源是葡萄糖,氮源是尿素。
3.用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时
( )
①可以用相同的培养基
②都需要使用接种环进行接种
③都需要在酒精灯火焰旁进行接种
④都可以用来计数活菌
A.①②
B.③④
C.①③
D.②④
【解析】选C。平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基,可以使用相同的培养基,①正确;平板划线法采用接种环进行操作,而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作,②错误;纯化时,要进行无菌操作,需要在酒精灯火焰旁接种,避免空气中的微生物混入培养基,③正确;平板划线法一般用于分离而不是计数,④错误。
4.(2020·浙江7月选考改编)下列关于微生物培养及利用的叙述,错误的是( )
A.利用尿素固体培养基可迅速杀死其他微生物,而保留利用尿素的微生物
B.配制培养基时应根据微生物的种类调整培养基的pH
C.酵母菌不能直接利用糯米淀粉发酵得到糯米酒
D.适宜浓度的酒精可使醋酸菌活化
【解析】选A。本题主要考查微生物的培养条件和应用。尿素固体培养基上,由于不能利用尿素做氮源的微生物不能生长繁殖,而保留利用尿素的微生物,并非迅速杀死其他微生物,A项错误;不同的微生物所需的pH不同,所以配制培养基时,应根据微生物的种类调整培养基的pH,B项正确;酵母菌不能直接利用淀粉,应用酒曲中的根霉和米曲霉等微生物把淀粉糖化,再用酵母菌发酵得到糯米酒,C项正确;醋酸菌在有氧条件下能利用酒精产生醋酸,所以适宜浓度的酒精可以使醋酸菌活化,D项正确。
5.下列关于菌种计数方法的叙述不正确的是
( )
A.当样品的稀释度足够高时,能在培养基表面形成单个菌落
B.应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据
C.为了保证结果准确,一般采用密度较大的平板进行计数
D.在某一浓度下涂布三个平板,以它们的平均值作为统计结果
【解析】选C。当样品的稀释度足够高时,培养基表面一个活菌会形成一个菌落,A正确;应该选取培养基表面菌落数目稳定时的记录作为有效数据,B正确;为了保证结果准确,一般选取菌落数在30～300之间的平板进行计数,C错误;在某一浓度下涂布三个平板,若三个平板统计的菌落数差别不大,则应以它们的平均值作为统计结果以减小实验误差,D正确。
【思维·跃迁】
6.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯,然后进行数量的测定。下面是有关土壤中分解尿素的细菌分离和计数的实验过程,请回答有关问题。
(1)若取土样6
g,应加入________mL的无菌水配制成稀释10倍土壤溶液。因土壤中细菌密度很大,需要不断加以稀释,配制成101～107不同浓度的土壤溶液。将103～107倍的稀释液分别吸取0.2
mL加入固体培养基上,用涂布器将菌液铺平,每个稀释度下至少涂布3个平板,这种接种方法称为________。将接种的培养皿放置在37
℃恒温培养箱中培养24～48
h,观察并统计菌落数,结果如下表,
其中________倍的稀释比较合适,由此计算出每克土壤中的菌落数为________。这种方法测定的菌落数往往比活菌的实际数目________(填“低”或“高”)。?
稀释倍数
103
104
105
106
107
菌
落
数
/个
1号平板
478
367
277
26
5
2号平板
496
354
261
20
8
3号平板
509
332
254
29
3
(2)若研究尿素分解菌的群体生长规律,可采用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌。操作时,接种环通过灼烧灭菌,在第二次及以后划线时,总是从上一次的末端开始划线。这样做的目的是_____________________________________。?
将分离纯化后的单个菌落进行液体培养,可采用定期取样的方法进行计数。若以一个大方格(体积为0.1
mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算,设5个中方格中总菌数为45,菌液稀释倍数为102
,那么原菌液的菌群密度为________个/mL。
?
【解析】(1)根据题意分析,需要稀释10倍的土壤溶液,因此应该将6
g土样加入54
mL的无菌水进行配制;将103～107倍的稀释液分别吸取0.2
mL加入固体培养基上,用稀释涂布平板法将菌液用涂布器涂布到固体培养基上;估算样品中的活菌数时,往往选取菌落数在30到300之间的平板,分析表格中数据可知,稀释倍数为105的平板菌落数在这一范围;每克土壤中的菌落数为(277+261+254)÷3×
105÷0.2÷6=2.2×107。稀释涂布平板法进行微生物计数时,由于菌落之间会相互重叠,因此测定的菌落数往往比活菌的实际数目低。(2)用平板划线法分离土壤中的尿素分解菌时,为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落,在第二次及以后划线时,总是从上一次的末端开始划线。
若以一个大方格(体积为0.1
mm3)有25个中方格的计数板为例进行计算,设5个中方格中总菌数为45,菌液稀释倍数为102
,那么原菌液的菌群密度=45×5÷0.1÷10-3×102=2.25×108个/mL。
答案:(1)54 稀释涂布平板法 105 2.2×107 低 (2)将聚集的菌体逐步稀释以便获得(不连续)单个菌落 2.25×108
【拓展·探究】
7.反刍动物的瘤胃中有许多能分解尿素的微生物。为了研究利用尿素配制的反刍动物饲料,以替代部分蛋白质饲料,降低饲料成本,进行了相关实验。请回答下列问题:
(1)尿素是尿素分解菌的氮源,因此在配制培养基时________。?
A.葡萄糖在培养基中含量越多越好
B.尿素在培养基中含量越少越好
C.尿素分解菌无固氮能力,故培养基中的氮源为尿素
D.尿素分解菌有固氮能力,故培养基中尿素为无机氮
(2)瘤胃中的尿素分解菌能将尿素分解成________,其中的________可用于合成微生物蛋白,该蛋白质是反刍动物的优质氮源。?
(3)为研究瘤胃中尿素分解菌的种类,实验者配制以尿素为唯一氮源的培养基,该培养基从功能上属于________培养基。可在培养基中加入________指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素,为确证这些菌是尿素分解菌,可通过酶活性测定及基因数据库比对,只有具有脲酶活性和________基因的菌,才是真正的尿素分解菌。?
(4)研究发现,如果只饲喂尿素配制的饲料,会导致反刍动物氨中毒,请根据高中所学知识分析其原因是__________________________________________。?
【解析】(1)尿素既可以作为尿素分解菌的氮源,也可以作为其碳源,葡萄糖在
培养基中并不是越多越好,A项错误;添加尿素的目的是筛选尿素分解菌,其他微
生物不能很好地生活在该培养基上,尿素在培养基中不是越少越好,过少就失去
选择作用,过多又会使细胞失水死亡,B项错误;尿素分解菌没有固氮能力,故培
养基中需要添加尿素作为有机氮源,C项正确,D项错误。(2)尿素分解菌能将尿
素分解成CO2和NH3,其中的NH3可用于合成微生物蛋白,为反刍动物提供优质氮源。
(3)以尿素为唯一氮源的培养基,尿素分解菌可以生存,而其他微生物不能
存活,因此该培养基从功能上属于选择培养基;可在培养基中加入酚红指示剂以初步鉴定这些菌能够分解尿素;为确证这些菌是尿素分解菌,可通过酶活性测定及基因数据库比对,只有具有脲酶活性和脲酶基因的菌,才是真正的尿素分解菌。(4)如果只饲喂尿素配制的饲料,会导致反刍动物氨中毒,原因是氨会使瘤胃液pH增大。
答案:(1)C (2)CO2和NH3 NH3 (3)选择 酚红 脲酶 (4)氨会使瘤胃液pH增大
课时素养评价
三 微生物的选择培养和计数
【基础达标】
(20分钟·70分)
一、选择题(共8小题,每小题5分,共40分)
1.通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长;在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法能从混杂的微生物群体中分别分离出
( )
①大肠杆菌 ②霉菌 ③放线菌 ④固氮细菌
A.④②③
B.①②③
C.①③④
D.只有③④
【解析】选A。缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长,而固氮细菌能生长;在培养基中加青霉素可以抑制细菌和放线菌等原核生物细胞壁的合成,而霉菌属于真核生物,故能生长;在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长,对放线菌的生长无影响。
2.稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是
( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
【解题关键】解答本题需明确梯度稀释的目的以及防止杂菌污染的做法。
【解析】选C。若菌液浓度过大,形成的菌落连在一起,得不到单个的菌落。
【互动探究】
(1)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落,原因是什么?
提示:可能是稀释度不够,聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
(2)题中如果不进行D项操作,培养基上得到的菌落可能有哪些变化?
提示:菌落种类和数目增多。
3.下列是关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验操作的叙述,其中错误的是
( )
A.利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释倍数
B.若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种的牛肉膏蛋白胨培养基作对照
C.将实验组和对照组平板倒置,25
℃恒温培养24～48小时
D.选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数
【解析】选C。利用稀释涂布平板法准确估计菌落数目的关键是恰当的稀释倍数,稀释倍数太低,菌落太多会长在一起,稀释倍数太高,平板上菌落数目过少,都不易进行计数,A正确;若要判断选择培养基是否起到了选择作用,需设置接种了的没有选择作用的细菌通用的牛肉膏蛋白胨培养基作对照,B正确;将实验组和对照组平板倒置,30～37
℃恒温培养24～48小时,C错误;计数时通常选择菌落数在30～300之间的实验组平板进行计数,D正确。
【补偿训练】
下列关于能分解尿素的细菌的说法,正确的是
( )
A.能分解尿素的原因是能合成蛋白酶
B.分离该种细菌时以尿素作为唯一碳源
C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性
D.用以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红
【解析】选D。酶具有专一性,分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成、分泌脲酶,A项错误;分离能分解尿素的细菌时以尿素作为唯一氮源,B项错误;环境中含有大量的尿素对分解尿素的细菌起了选择作用,而非诱导作用,C项错误;该菌产生的脲酶把尿素分解为氨后,使pH升高,可使酚红指示剂变红,但添加酸碱缓冲剂后,阻止了pH的升高,因此培养基不使酚红指示剂变红,D项正确。
4.关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验中,下列操作需要在酒精灯火焰旁进行的一组是
( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液
④涂布平板 ⑤微生物的培养
A.①②③④⑤
B.②③④⑤
C.③④⑤
D.②③④
【解析】选D。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验需进行无菌操作,其中①土壤取样是在室外进行,⑤微生物的培养是在恒温箱中进行,其余过程都需要在酒精灯火焰旁进行,D项正确。
5.某学者欲研究被石油污染过的土壤中细菌数量,并从中筛选出能分解石油的细菌。下列操作错误的是
( )
A.利用平板划线法对细菌进行计数
B.以石油为唯一碳源的培养基筛选
C.采用稀释涂布平板法分离菌种
D.称取和稀释土壤时应在酒精灯火焰旁
【解析】选A。平板划线法能对细菌分离纯化,但不能对细菌进行计数,稀释涂布平板法可以分离菌种还可进行计数,A错误。
6.下列有关微生物分离、纯化及计数的叙述,错误的是
( )
A.常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌
B.平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散并计数
C.稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散
D.用血细胞计数板计数统计的结果往往比稀释涂布平板法得到的结果偏大
【解析】选B。纤维素是纤维素分解菌的碳源,因此常用富含纤维素的培养基富集培养纤维素分解菌;平板划线法通过连续划线将聚集的菌种分散,但不能用于微生物的计数;稀释涂布平板法通过系列梯度稀释可将微生物分散并计数;用血细胞计数板计数微生物时,会将死的微生物计数在内,因此导致实验结果往往偏大。
7.(2020·绍兴高二检测)为研究泡菜腌制过程中起作用的微生物的种类及比例,需要进行分离培养。下列叙述错误的是
( )
A.配制培养基时,需要加适量的凝固剂
B.接种方法可选择平板划线分离法或稀释涂布平板法
C.需要设置未经接种的空白对照
D.培养需要在无氧条件下进行
【解析】选B。配制培养基时,需要加适量的凝固剂,制成固体培养基,用于微生物的分离,A正确;要研究微生物的种类及比例,应选用稀释涂布平板法进行接种,B错误。需要设置未经接种的空白对照,排除培养基被杂菌污染的可能,C正确;乳酸菌属于厌氧菌,需要在无氧条件下培养,D正确。
8.(2020·济南高二检测)如图为分离和纯化分解甲醛细菌的实验过程,其中LB培养基能使菌种成倍扩增,以下说法正确的是
( )
A.需要对活性污泥做灭菌处理
B.②中LB培养基应以甲醛为唯一碳源
C.目的菌种异化作用类型为厌氧型
D.经⑤处理后,应选择瓶中甲醛浓度最低的一组进一步纯化培养
【解析】选D。该实验是从活性污泥中分离和纯化分解甲醛细菌,则活性污泥不能灭菌,A错误;LB培养基使菌种成倍扩增,应用完全培养基培养,B错误;图示分解甲醛细菌进行振荡培养,属于需氧型细菌,C错误;经⑤处理后,瓶中甲醛浓度降低,甲醛浓度最低的一组中分解甲醛细菌纯度最高,可进一步纯化培养,D正确。
【互动探究】上题中从④到⑤在操作过程中的关键是什么?
提示:无菌操作:接种环需要灼烧灭菌,并等待接种环冷却后挑取菌种,防止菌种被高温杀死;操作完成后需将接种环在火焰上灼烧,以杀灭残留的微生物。
二、非选择题(共2小题,共30分)
9.(16分)(2020·乌鲁木齐高二检测)2020年,疫情期间,外卖成交量迅速攀升,外卖餐食的微生物污染状况也越来越多地受到人们的关注。研究人员通过实验探究了同种外卖餐食送达时的温度与其中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的数量关系。请回答下列有关问题:
(1)测量送达餐食的温度时,应测量餐食____________(填“表面”或“中心”)部位的温度。?
(2)通常采用固体培养基培养细菌并进行计数,在配制培养基时需加入____________作为凝固剂,并用____________法进行接种。?
(3)检测金黄色葡萄球菌时,通常在培养基中加入一定量的NaCl,像这样允许特定种类微生物生长的培养基称为____________培养基。为避免培养基中的菌落数太多影响计数,可对样品进行适度的____________。为了保证结果准确,一般选择菌落数为____________范围的平板进行计数。统计的菌落数往往会比活菌的实际数目低,原因是_____________________________________。?
(4)实验结果显示,送达温度与菌落数量呈负相关,因此送达温度较____________的餐食,合格率较高。
?
【解析】(1)餐食的表面温度较低,测量送达餐食的温度时,应测量餐食中心部位的温度。(2)固体培养基需要加入凝固剂琼脂,稀释涂布平板法可以用来对菌落进行计数,从而得知细菌的数目。(3)金黄色葡萄球菌有较高的耐盐性,通常在培养基中加入一定量的NaCl可以筛选金黄色葡萄球菌,像这样允许特定种类微生物生长的培养基称为选择培养基。培养基中的菌落数太多会影响计数,因此可对样品进行适度的稀释。菌落太少误差较大,菌落太多容易聚集成一个菌落,因此为了保证结果准确,一般选择菌落数为30～300范围的平板进行计数。统计的菌落数往往会比活菌的实际数目低,原因是当两个或多个细胞聚集在一起,平板上观察到的只是一个菌落。(4)送达温度与菌落数量呈负相关,因此送达温度较高的餐食,说明含菌量较少,合格率较高。
答案:(1)中心 (2)琼脂 稀释涂布平板 (3)选择 稀释 30～300 当两个或多个细胞聚集在一起,平板上观察到的只是一个菌落 (4)高
10.(14分)为了调查某河流的水质状况,某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量,并进行了细菌分离和培养等工作。回答下列问题:
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。将1
mL水样稀释1
000倍,在3个平板上用涂布法分别接入0.1
mL稀释液。经适当培养后,3个平板上的菌落数分别为39、38和37,据此可得出每升水样中的活菌数为________个。?
?
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时,接种环通过________灭菌,为了将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落,在第二次及以后的划线时,一定要____________________________,示意图A和B中,________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。通常,对获得的纯菌种可以依据________对细菌进行初步的鉴定和分类。
(3)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀,一部分进行静置培养,另一部分进行振荡培养。结果发现:振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是:振荡培养能提高培养液中________的含量,同时可使菌体与培养液充分接触,提高________的利用率。?
【解析】(1)由题意知,1
mL水样中的菌落数是(39+38+37)÷3÷0.1×1
000
=3.8×105,每升水样中的活菌数为3.8×105×103=3.8×108(个)。(2)接种环用灼烧法进行灭菌。在第二次及以后的划线时,总是从上一次划线的末端开始划线,这样做的目的是通过划线次数的增加,将聚集的菌体逐渐稀释分散,使每次划线时菌体的数目逐渐减少,以便获得由单个细胞繁殖而来的单个菌落。图A是用平板划线法接种培养后得到的结果,图B表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。可以依据菌落的形状、大小等特征对细菌进行初步的鉴定和分类。(3)振荡培养可以增加液体培养基的氧气含量,同时还能使菌体与培养液充分接触,提高营养物质的利用率。
答案:(1)3.8×108 (2)灼烧 从上一次划线的末端开始划线 B 菌落的形状、大小等特征 (3)溶解氧 营养物质
【能力提升】(10分钟·30分)
1.(5分)(不定项)如图是研究人员从红棕壤中筛选高效分解尿素细菌的示意图,有关叙述正确的是
( )
A.在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH后高压蒸汽灭菌
B.步骤③采用涂布平板法接种,并需向牛肉膏蛋白胨培
养基中加入尿素
C.步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细
菌分解尿素的能力
D.步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落
【解题关键】明确以下两个关键点:
(1)配制培养基时,应该在灭菌之前调节pH。
(2)培养基的选择:以尿素为唯一氮源的选择培养基。
【解析】选A、C、D。在配制步骤②、③的培养基时,应先调pH后高压蒸汽灭菌,A正确;要筛选出能高效分解尿素的细菌,所选用的培养基要以尿素为唯一氮源,但牛肉膏和蛋白胨中都含有尿素,因此步骤③所用的培养基中不能含有牛肉膏蛋白胨,B错误;步骤④挑取③中不同种的菌落分别接种,比较细菌分解尿素的能力,C正确;步骤③纯化分解尿素细菌的原理是将聚集的细菌分散,可以获得单细胞菌落,D正确。
【方法规律】筛选微生物的三种方法
(1)单菌落挑取法:利用平板划线法或稀释涂布平板法接种到固体平板培养基表面,直接根据微生物菌落的特征利用单菌落挑取的方法获得目的微生物。
(2)选择培养法:利用选择培养基对微生物进行选择培养,直接获得目的微生物。
(3)鉴定培养法:利用鉴别培养基使目的微生物菌落呈现特有的特征,然后筛选目的微生物。
2.(5分)(不定项)(2019·北京高考改编)筛选淀粉分解菌需使用以淀粉为唯一碳源的培养基。接种培养后,若细菌能分解淀粉,培养平板经稀碘液处理,会出现以菌落为中心的透明圈(如图),实验结果见表。
菌种
菌落直径:
C(mm)
透明圈直径:
H(mm)
H/C
细菌Ⅰ
5.1
11.2
2.2
细菌Ⅱ
8.1
13.0
1.6
有关本实验的叙述,正确的是
( )
A.培养基除淀粉外还含有氮源、无机盐等其他营养物质
B.筛选分解淀粉的细菌时,菌液应稀释后涂布
C.以上两种细菌均不能将淀粉酶分泌至细胞外
D.H/C值反映了两种细菌分解淀粉能力的差异
【解题关键】解答本题的两个关键信息:
(1)培养基的主要营养物质:碳源(淀粉)、氮源、水、无机盐和生长因子等营养物质。
(2)淀粉是大分子物质,被淀粉酶水解后才能被细胞吸收。
【解析】选A、B、D。本题考查微生物的筛选与鉴定。培养基含有碳源(淀粉)、氮源、水、无机盐和生长因子等营养物质,A项正确;为了得到单个细菌形成的菌落,菌液应该稀释后进行涂布,B项正确;这两种细菌形成的菌落周围均出现透明圈,说明均能将淀粉酶分泌到细胞外,C项错误;H/C值不同反映这两种细菌分解淀粉的能力不同,D项正确。
3.(20分)(2020·江苏高考)产脂肪酶酵母可用于含油废水处理。为筛选产脂肪酶酵母菌株,科研人员开展了相关研究。请回答下列问题:
(1)常规微生物实验中,下列物品及其灭菌方法错误的是______________(填编号)。?
编号
①
②
③
④
物品
培养基
接种环
培养皿
涂布器
灭菌方法
高压蒸汽
火焰灼烧
干热
臭氧
(2)称取1.0
g某土壤样品,转入99
mL无菌水中,制备成菌悬液,经______________后,获得细胞密度不同的菌悬液。分别取0.1
mL菌悬液涂布在固体培养基上,其中10倍稀释的菌悬液培养后平均长出了46个酵母菌落,则该样本中每克土壤约含酵母菌______________个。?
(3)为了进一步提高酵母菌产酶能力,对分离所得的菌株,采用射线辐照进行________________育种。将辐照处理后的酵母菌涂布在以______________为唯一碳源的固体培养基上,培养一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选择直径____________的菌落,纯化后获得A、B两突变菌株。?
(4)在处理含油废水的同时,可获得单细胞蛋白,实现污染物资源化。为评价A、B两菌株的相关性能,进行了培养研究,结果如图。据图分析,应选择菌株____________进行后续相关研究,理由是__________________。
【解析】本题主要考查了微生物培养的灭菌、计数、分离筛选等知识。
(1)培养基一般进行高压蒸汽灭菌,接种环可用火焰灼烧灭菌,培养皿一般通过干热灭菌,涂布器应该用酒精引燃灭菌,故①②③正确,错误的是④。
(2)稀释涂布平板法是将样品进行一系列梯度稀释后,获得细胞密度不同的菌悬液,然后涂布到平板上。根据题意,1.0
g土壤样品转入99
mL无菌水中,制备成菌悬液,经系列梯度稀释后,分别取0.1
mL菌悬液涂布在固体培养基上,则稀释的倍数为1
000倍,其中10倍稀释的菌悬液培养后长出了46个酵母菌落,则总的稀释倍数为10
000倍,故每克土壤中含酵母菌数为46×10
000=4.6×105个。
(3)根据题意,欲提高酵母菌产酶能力,可对分离得到的产脂肪酶酵母菌菌株进行射线辐照,该育种方式为诱变育种。为了能筛选出符合要求的产
脂肪酶酵母菌突变株,可配制以脂肪为唯一碳源的培养基,将辐照处理后的酵母菌涂布在该固体培养基上,形成单菌落;产脂肪酶能力越强的酵母菌,分解利用脂肪的能力越强,菌落生长越好,一段时间后,按照菌落直径大小进行初筛,选取直径较大的菌落即可。
(4)据题图分析可知,相同时间内,菌株B的细胞密度高于菌株A,而菌株B的脂肪剩余量低于菌株A的脂肪剩余量,故进行相关研究可选择菌株B,原因是菌株B增殖速度快,单细胞蛋白的产量也高,同时降解脂肪的能力强,净化效果更好。
答案:(1)④
(2)梯度稀释
4.6×105(或460
000)
(3)诱变 脂肪(或油脂) 较大
(4)B 该菌株增殖速度快,单细胞蛋白产量高;降解脂肪能力强,净化效果好
