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第3章 基
因
工
程
第1节 重组DNA技术的基本工具
必备知识·素养奠基
一、基因工程的诞生和发展
判一判:基于基因工程相关基础理论的突破和技术的创新,判断下列说法的正
误。
1.1953年,沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型,并用实验证明了DNA分
子的半保留复制。
(
)
提示:DNA分子半保留复制是梅塞尔森和斯塔尔用实验证明的。
2.1970年,在细菌体内发现了第一个限制酶,后来又发现了多种限制酶、DNA连
接酶等。
(
)
×
√
3.1972年,伯格首先在体外进行DNA改造,并构建了第一个体外重组DNA分子。
(
)
4.1983年,科学家采用花粉管通道法培育了世界上第一例转基因烟草。
(
)
提示:第一例转基因烟草是用农杆菌转化法培育的。
5.1984年,我国科学家朱作言领导的团队培育了世界上第一条转基因鱼。
(
)
6.基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来
的。
(
)
√
×
√
√
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.来源:主要来自_________。
2.特点:具有_____性。
(1)识别DNA分子的_______________。
(2)切割特定部位的两个核苷酸之间的_________键。
原核生物
专一
特定核苷酸序列
磷酸二酯
3.结果:
【激疑】限制酶来源于原核生物,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?
提示:细菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,限制酶无法识别这些DNA,故不能剪切。
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用:将____________“缝合”起来,恢复被_______切开的两个核苷酸之间的
___________。
2.种类:
种 类
来 源
特 点
_____
DNA连接酶
_________
只能“缝合”具有_____________的双链DNA片段
T4DNA
连接酶
T4噬菌体
既可以“缝合”双链DNA片段互补的
_________,又可以“缝合”双链DNA
片段的_______
双链DNA片段
限制酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
互补黏性末端
黏性末端
平末端
E.coli
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.种类:质粒、_______、动植物病毒等。
2.常用载体——质粒
(1)本质:质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞
________之外,并具有自我复制能力的____________分子。
(2)作为载体的三个条件。
①质粒DNA分子上有一个或多个___________位点。
②能在细胞内自我复制,或整合到________上,随受体DNA同步复制。
③含有特殊的_____基因。
噬菌体
拟核DNA
环状双链DNA
限制酶切割
受体DNA
标记
五、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理:
(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在_______________方面有差异,选用适当的物
理或化学方法对它们进行提取。
①DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于_____,分离DNA和蛋白质。
②DNA能溶于__mol/L的NaCl溶液。
(2)DNA遇_______试剂会呈现蓝色。
物理和化学性质
酒精
2
二苯胺
2.方法步骤:
(1)研磨:取30g洋葱切碎,倒入10
mL研磨液研磨。
(2)除杂:漏斗中垫上纱布过滤后,在4
℃冰箱静置后取_______,1
500
r/min的
转速下离心后取_______。
(3)提取:加入体积相等、体积分数95%酒精,溶液出现白色的丝状物是____。
方法一:用玻璃杯按_____(填“一个”或“两个”)方向搅拌,卷起丝状物,用滤
纸吸去上面的水分。
方法二:10
000
r/min的转速下离心5
min,取_______晾干。
上清液
上清液
DNA
一个
沉淀物
(4)鉴定:
项目
A
B
2
mol/L的NaCl溶液
5
mL
丝状物或沉淀物
不加
加入
_______试剂4
mL
_______加热5
min
现象
无色
_____
二苯胺
沸水中
蓝色
【激疑】
DNA的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热,它们有什么不同?
提示:还原糖加斐林试剂后,置于55～65
℃热水中加热;而DNA加二苯胺试剂后,置于沸水中加热。
关键能力·素养形成
知识点一 基因工程中的工具酶
1.限制酶:
(1)限制酶的作用。
限制酶具有特殊的识别和切割功能,在基因工程中,一方面被用于切割含目的
基因的DNA分子,以获取目的基因;另一方面用于切割载体。
(2)识别序列的特点:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基,还是偶数个碱基,
都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排
列的。如
以中心线为轴,两侧碱基互补对称;
以
为轴,
两侧碱基互补对称。
(3)限制酶切割方式:
①上下交错切割:限制酶在DNA双链的不同位置切割DNA(即在识别序列的中轴线两侧切割),产生的DNA片段的末端两条链一长一短,不是平齐的,即黏性末端,
如图:
②上下对称切割:限制酶在DNA双链的相同位置切割DNA(即沿着识别序列的中轴线切割),这样产生的末端两条链平齐,即平末端,如图:
2.DNA连接酶:
(1)作用:
将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式:
DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来,相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来,形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3.与DNA相关的五种酶的比较:
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA
连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA
聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA
(水
解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之
间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
【特别提醒】限制酶和DNA连接酶
(1)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割,但同样能相互连接。
(2)限制酶和DNA连接酶作用部位相同,但作用正好相反,都作用于特定部位的磷酸二酯键,前者是“切割”,后者是“缝合”。
(3)DNA连接酶种类少:DNA连接酶无识别的特异性,对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。所以,限制酶种类多,DNA连接酶种类少。
【素养案例】
如表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点,请回答下列问题:
(1)从表中4种酶的切割位点看,可以切出平末端的酶是____________。?
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是______________酶,它的作用是形成磷酸二酯键;两条链间的碱基对通过____________连接起来。?
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶____________切割。?
(4)在相关酶的作用下,图1中的甲与图2中的乙________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由:____________________________________。?
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】(1)由表中4种限制酶的切割位点可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接,形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知,质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成链状DNA。(4)由图可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
答案:(1)SmaⅠ
(2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ
(4)能 二者具有相同的黏性末端
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——模型与建模
如图是某同学画出的限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割产生的黏性末端,判断他的写法是否正确?如果不正确,请改正。
提示:限制酶BamHⅠ切割产生的黏性末端不正确,限制酶HindⅢ切割产生的黏性末端正确。
限制酶BamHⅠ产生的黏性末端为
-G GATCC-
-CCTAG G-
(2)科学思维——批判性思维
某同学认为同一限制酶切割产生相同的黏性末端,DNA连接酶可以连接相同的黏性末端,因此基因工程必须使用同一种限制酶处理后的黏性末端才能用DNA连接酶连接,这个同学的说法正确吗?说明你的理由。
提示:不对。不同的限制酶也可能产生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶处理获得相同的黏性末端。
【素养·迁移】
下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的
( )
A.1种 B.2种 C.3种 D.4种
【解析】选C。图中③④为相同的平末端,可能由同一种限制酶切割所得,所以图示四种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
【补偿训练】
在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是
( )
A.限制酶和DNA连接酶
B.限制酶和水解酶
C.限制酶和载体
D.DNA连接酶和载体
【解析】选A。基因工程中的操作工具有3种,即“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”。限制酶的作用是通过识别和切割从DNA分子上获取目的基因,而DNA连接酶是将目的基因连接到载体上,载体起运输工具的作用,携带着目的基因进入受体细胞。显然,对基因起修饰改造作用的是限制酶和DNA连接酶。
知识点二 基因工程中常用的载体
1.特点:质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
2.本质:质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型DNA分子,不是细胞器。
3.质粒作为载体所具备的条件:
条 件
分 析
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个
限制酶切割位点
可携带多个
或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
4.标记基因的筛选原理:
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示:
【特别提醒】
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同:
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA),也可能是生物,如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同:
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。
【素养案例】
某细菌质粒如图所示,通过标记基因可以推知外源基因插入的位置,图示中的a、b、c是外源基因插入位置,请根据表中提供的细菌生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是
( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况
细菌在含四环素的培养基上的生长状况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
【解题导引】解答本题注意两个方面:
(1)理解抗性基因:
抗四环素基因:使细菌能在含四环素的培养基上生长。
抗氨苄青霉素基因:使细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长。
(2)质粒上标记基因的作用:用于重组DNA分子的筛选。
【解析】选A。①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长,说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏,所以插入点是c;②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,而不能在含四环素的培养基上生长,说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏,故插入点为b;③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长,能在含四环素的培养基上生长,说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏,故插入点为a。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——演绎与推理
将外源基因插入质粒中需要借助哪些工具酶?
提示:限制酶和DNA连接酶。
(2)科学探究——结果的讨论与交流
天然的质粒可以直接用作基因工程载体吗?为什么?
提示:不能,自然存在的质粒DNA分子并不完全具备作为载体条件,都要进行人工改造后才能用作基因工程载体。
【素养·迁移】
限制酶MunⅠ和限制酶EcoR
Ⅰ的识别序列及切割位点分别是
和
。如图表示四种质粒和目的基因,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是( )
【解题关键】作为载体的质粒必须与目的基因具有相同的限制酶切点,并且该切点不能破坏质粒的标记基因。
【解析】选A。用限制酶MunⅠ切割A质粒后,不会破坏标记基因,而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端,适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因,不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因,但用限制酶切割后会被破坏,因此不适于作为目的基因的载体。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.“工欲善其事,必先利其器”基因工程对体外DNA分子“切割”“拼接”并导入受体细胞中至少需要三种工具,下列有关基因工程中的三种工具的描述合理的是________。?
①DNA重组技术的原理是基因突变
②限制酶和解旋酶的作用部位相同
③作为载体,必须要有标记基因等结构
④T4DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端
⑤DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端,故该酶没有专一性
【解析】选③④。DNA重组技术的原理是基因重组,①错误;限制酶作用于磷酸二酯键,解旋酶作用于氢键,②错误;作为载体,必须能进行自我复制、具有标记基因、有一个或多个限制酶切割位点等,③正确;T4DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端,④正确;任何酶都具有专一性。酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化学反应,黏性末端相连接属于一类合成反应,⑤错误。
2.下列关于基因工程工具酶的说法,正确的是
( )
A.E.coli
DNA连接酶既能够连接平末端,也可以连接黏性末端
B.每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割,体现了酶的专一性
C.DNA连接酶连接的是碱基间的氢键
D.限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程常用的工具酶
【解析】选B。E.coli
DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端,A项错误;每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点上切割DNA分子,体现了酶的专一性,B项正确;DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,C项错误;限制酶和DNA连接酶是基因工程常用的工具酶,但质粒是载体,不是工具酶,D项错误。
3.如图表示限制酶切割某DNA的过程,从图中可知,该限制酶能识别的碱基序列及切点是
( )
A.CTTAAG,切点在C和T之间
B.CTTAAG,切点在G和A之间
C.GAATTC,切点在G和A之间
D.CTTAAC,切点在C和T之间
【解析】选C。据图分析可知,识别的序列为GAATTC,切割的位点在GA之间。
4.如图为DNA分子的某一片段,其中①②③分别表示某种酶的作用部位,则相应的酶依次是
( )
A.DNA连接酶、限制酶、解旋酶
B.限制酶、解旋酶、DNA连接酶
C.限制酶、DNA连接酶、解旋酶
D.解旋酶、限制酶、DNA连接酶
【解析】选D。①是氢键,是解旋酶的作用位点;②是磷酸二酯键,限制酶可将其断裂;③是DNA连接酶,可将DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来。
5.作为目的基因的运输工具——质粒,必须具备的条件之一及理由是( )
A.能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因
B.具有多个限制酶切割位点,以便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因,以便为目的基因的表达提供条件
D.能够在受体细胞中复制并稳定保存,以便于进行筛选
【解析】选A。作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达,必须能够在受体细胞内稳定地保存并大量复制,以便通过复制提供大量目的基因。同时要具有某些标记基因,是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞,从而进行筛选受体细胞。载体要具有多个限制酶切割位点,则是为了便于与外源基因连接。
【思维·跃迁】
6.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有______________
(答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。?
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是___________;?
并且____________和________________________的细胞也是不能区分的,其原因是________________________________________________。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有________________的固体培养基。?
(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自____________。?
【解题关键】解答本题的关键有两点:
(1)理解基因工程中载体的特点。
(2)熟悉导入重组质粒的微生物的筛选方法。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。
(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为:具有一个或多个限制酶切割位点;具有自我复制能力;带有标记基因;对受体细胞无害。
(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长,这两种也不可区分。因目的基因
插入位点在四环素抗性基因上,四环素抗性基因被破坏,在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上,不能生长的为要筛选的菌落,即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(3)噬菌体营寄生生活,能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
答案:(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
【拓展·探究】
7.如图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列,并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图,请回答以下问题:
(1)关于限制酶的描述,错误的是
( )
A.EcoRⅠ识别的序列为GAATTC,在GA之间切割
B.HpaⅠ识别的序列为GTTAAC,在AT之间切割
C.EcoRⅠ切割后产生的为黏性末端,可用T4DNA连接酶连接
D.HpaⅠ切割后产生的为平末端,可用E.coli
DNA连接酶连接
(2)由图解可以看出,限制酶的作用特点是____________________________
______________________________________。?
(3)如果甲中G碱基发生基因突变,EcoRⅠ还可以识别该片段吗?为什么?
【解析】
(1)EcoRⅠ识别的序列为GAATTC,切点在G、A之间,A正确;HpaⅠ识别的序列为GTTAAC,切点在A、T之间,B正确;EcoRⅠ切口在识别序列中轴线两侧,形成黏性末端,T4DNA连接酶既能连接黏性末端也可连接平末端,C正确;HpaⅠ切口在识别序列中轴线处,形成平末端,E.coli
DNA连接酶只能连接黏性末端不能连接平末端,D错误。(2)(3)限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列,并从特定位点切割DNA分子。当特定核苷酸序列变化后,就不能被相应限制酶识别。
答案:(1)D
(2)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列,并从特定的位点将DNA分子切开(或特异性)
(3)不能。因为限制酶具有特异性,每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点切割。
课时素养评价
十二 重组DNA技术的基本工具
【基础达标】
(20分钟·70分)
一、选择题(共7小题,每小题5分,共35分)
1.下列说法中不正确的有
( )
①限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的
②DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的
③所有限制酶识别的核苷酸序列均由6个核苷酸组成
④有的质粒是单链DNA
A.①②③
B.①②④
C.②③④
D.①③④
【解析】选C。限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,也有少数来自真核生物——酵母菌,①正确;T4
DNA连接酶来源于T4噬菌体(一种病毒),②错误;EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶识别的序列均为6个核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,③错误;所有的质粒都是双链的环状DNA分子,④错误。
2.如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤,这一步骤需用到的工具酶是
( )
A.DNA连接酶和解旋酶
B.DNA聚合酶和限制性内切核酸酶
C.限制性内切核酸酶和DNA连接酶
D.DNA聚合酶和RNA聚合酶
【解析】选C。目的基因和载体结合需“分子手术刀”——限制性内切核酸酶和“分子缝合针”——DNA连接酶。此过程不涉及DNA复制,不需要DNA聚合酶和解旋酶。
3.据图分析下列有关基因工程的工具酶功能的叙述,不正确的是
( )
A.切断a处的酶为限制性内切核酸酶
B.连接a处的酶为DNA连接酶
C.切断b处的酶为解旋酶
D.切断b处的酶为限制性内切核酸酶
【解析】选D。a为磷酸二酯键,可被限制性内切核酸酶切断,A正确;a为磷酸二酯键,可被DNA连接酶连接起来,B正确;b为氢键,可被解旋酶切断,C正确;b为氢键,而限制性内切核酸酶切断的是磷酸二酯键,D错误。
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是
( )
A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
【解析】选C。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,形成黏性末端或平末端,因此①符合;DNA聚合酶用于DNA分子的复制,能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来,因此④符合;DNA连接酶能在具有相同或互补碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,因此②符合;解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开,因此③符合。
5.下列有关如图所示的黏性末端的说法,错误的是
( )
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重组DNA分子,但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点是b处
D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
【解析】选C。据图可知,切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶识别序列与切
割位点分别是—GAATTC—(在G与A之间切割)、—CAATTG—(在C与A之间切
割)、—CTTAAG—(在C与T之间切割),即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产
生的,A正确。甲、乙的黏性末端互补,所以甲、乙可以形成重组DNA分子;甲、
丙的黏性末端不互补,所以甲、丙无法形成重组DNA分子,B正确。DNA连接酶可
以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,而b处是氢键,C错误。甲、
乙黏性末端形成的重组DNA分子片段为
,其中没有切割产生甲的限制
酶的识别序列及酶切位点,所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末
端形成的重组DNA分子片段,D正确。
6.下列关于E.coli
DNA连接酶的叙述正确的是
( )
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之间的连接
②催化具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接
③催化具有平末端的DNA片段之间的连接
④催化单个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
A.①②
B.②④
C.②③
D.①④
【解析】选A。E.coli
DNA连接酶来源于大肠杆菌,可用于连接相同或互补的黏性末端,不能连接平末端。DNA连接酶不能连接单个的脱氧核苷酸,在DNA复制时,DNA聚合酶将一个一个的脱氧核苷酸聚合在一起。
7.基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图判断下列操作正确的是
( )
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
【解析】选D。解此题要明确目的基因要从DNA片段上切下,质粒只要切开。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—,单独使用时可以把目的基因和质粒都切断;限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,只能把它们切开,单独使用时不能切断,所以目的基因用限制酶Ⅱ切割,质粒用限制酶Ⅰ切割;因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ,所以只能用GeneⅠ作为标记基因。
二、非选择题(共2小题,共35分)
8.(17分)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有_________和____。?
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
该酶识别的序列为________________________,切割的部位是__________。?
(3)为使切割后的载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外,还可用限制酶Y切割,原因是______________________________。?
(4)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即____________DNA连接酶和____________DNA连接酶,其中后者只能连接一种末端。?
(5)基因工程中除质粒外,________________和________________也可作为载体。?
【解析】
(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端,即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—,互补链是—CTTAAG—,切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割,也可以用另一种限制酶切割,说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同或者互补。(4)基因工程使用的DNA连接酶,按来源可分为E.coliDNA连接酶和T4
DNA连接酶,其中只能连接黏性末端的是E.coliDNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒。
答案:(1)黏性末端 平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG— G和A之间的磷酸二酯键 (3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同或互补 (4)T4 E.coli (5)噬菌体 动植物病毒
9.(18分)如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,据图回答下列问题:
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是__________,二者还具有其他共同点,如①__________________,②________________________(写出两条即可)。?
(2)若质粒DNA分子的切割末端为
,则与之连接的目的基因切割末端应为______________;可使用 ________________把质粒和目的基因连接在一起。?
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为__________________________,?
其作用是____________________________________________。?
(4)下列常在基因工程中用作载体的是
( )
A.苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B.土壤农杆菌中的RNA分子
C.大肠杆菌的质粒
D.动物细胞的染色体
【解析】(1)据图可知,a是位于拟核部位的DNA分子,跟质粒的化学本质一样。
作为DNA分子,二者都能自我复制,其上的基因能完成表达,即具有遗传效应
等。
(2)与
具有相同或互补黏性末端的DNA片段都可与之连接,即
或
写成
。DNA连接酶催化连接相同或互补的黏性末端。
(3)抗性基因常作为标记基因,供重组DNA的鉴定和筛选。
(4)大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体,载体的本质为DNA,RNA分子不
能用作载体。抗虫基因属于目的基因,不属于载体。染色体的主要成分为DNA
和蛋白质,不能用作载体。
答案:(1)DNA 能够自我复制 具有遗传效应
(2)CGCG—
— DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和筛选 (4)C
【能力提升】(10分钟·30分)
1.(6分)如图为农杆菌Ti质粒的T-DNA区段结构示意图。农杆菌附着植物细胞后,T-DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制,然后进入植物细胞并整合到染色体上,继而诱发细胞异常生长和分裂,形成植物肿瘤。以下有关叙述不正确的是
( )
A.Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外
B.植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达有关
C.清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长
D.利用T-DNA进行转基因时需保留LB、RB序列
【解析】选C。Ti质粒是环状的DNA分子,存在于农杆菌的拟核DNA之外,A正确;A、B两个基因导入受体细胞的染色体上,进行表达,继而诱发细胞异常生长和分裂,形成植物肿瘤,B正确;农杆菌将自身Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体上,诱发了植物肿瘤的形成,故清除肿瘤组织中的农杆菌后,肿瘤仍可继续生长,C错误;只有T-DNA保留LB、RB序列,T-DNA才能在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制,然后进入植物细胞并整合到染色体上,D正确。
2.(6分)(不定项)图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点,ampr表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
( )
A.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后,含有4个游离的磷酸基团
B.在构建重组质粒时,可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C.用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割,可以保证重组DNA序列的唯一性
D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
【解析】选A、B、D。甲中的质粒只有一个BamHⅠ切割位点,切割后形成一个直链DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;BamHⅠ切割位点在目的基因上,不能用该酶切割外源DNA,B错误;用PstⅠ和HindⅢ切割质粒切成两个片段,用PstⅠ和Hind
Ⅲ能将外源DNA切开,只有含目的基因的片段通过DNA连接酶与质粒连接形成的重组质粒符合要求,从而保证重组DNA序列的唯一性,C正确;导入目的基因的大肠杆菌,其重组质粒是用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割的,其中的ampr(氨苄青霉素抗性基因)已被破坏,D错误。
【实验·探究】
3.(18分)啤酒酵母菌是啤酒生产上常用的典型的发酵酵母菌。除用于酿造啤酒及其他的饮料酒外,还可发酵面包。菌体维生素、蛋白质含量高,可食用、药用和作饲料。科学家将大麦细胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如图:
(1)该技术定向改变了啤酒酵母菌的性状,这在可遗传变异的来源中属于________。?
(2)为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所用的载体是________。?
(3)题图中C进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是____________________________________________。
【解析】(1)由题图可知该技术属于基因工程,该变异属于基因重组。(2)据题图可以看出,载体来自大肠杆菌,一定是质粒。(3)由于质粒上抗四环素基因被破坏,所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培养基上能存活,但在含有四环素的培养基上不能存活。
答案:(1)基因重组
(2)(大肠杆菌的)质粒
(3)在含有青霉素的培养基上能存活,但在含有四环素的培养基上不能存活第3章 基
因
工
程
第1节 重组DNA技术的基本工具
必备知识·素养奠基
一、基因工程的诞生和发展
判一判:基于基因工程相关基础理论的突破和技术的创新,判断下列说法的正误。
1.1953年,沃森和克里克建立了DNA分子双螺旋结构模型,并用实验证明了DNA分子的半保留复制。
(×)
提示:DNA分子半保留复制是梅塞尔森和斯塔尔用实验证明的。
2.1970年,在细菌体内发现了第一个限制酶,后来又发现了多种限制酶、DNA连接酶等。
(√)
3.1972年,伯格首先在体外进行DNA改造,并构建了第一个体外重组DNA分子。
(√)
4.1983年,科学家采用花粉管通道法培育了世界上第一例转基因烟草。
(×)
提示:第一例转基因烟草是用农杆菌转化法培育的。
5.1984年,我国科学家朱作言领导的团队培育了世界上第一条转基因鱼。
(√)
6.基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的。
(√)
二、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
1.来源:主要来自原核生物。
2.特点:具有专一性。
(1)识别DNA分子的特定核苷酸序列。
(2)切割特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
3.结果:
限制酶来源于原核生物,为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA?
提示:细菌DNA缺乏特定的核苷酸序列,限制酶无法识别这些DNA,故不能剪切。
三、DNA连接酶——“分子缝合针”
1.作用:将双链DNA片段“缝合”起来,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
2.种类:
种 类
来 源
特 点
E.coliDNA连接酶
大肠杆菌
只能“缝合”具有互补黏性末端的双链DNA片段
T4DNA连接酶
T4噬菌体
既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端
四、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
1.种类:质粒、噬菌体、动植物病毒等。
2.常用载体——质粒
(1)本质:质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外,并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
(2)作为载体的三个条件。
①质粒DNA分子上有一个或多个限制酶切割位点。
②能在细胞内自我复制,或整合到受体DNA上,随受体DNA同步复制。
③含有特殊的标记基因。
五、DNA的粗提取与鉴定
1.实验原理:
(1)DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面有差异,选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。
①DNA不溶于酒精,某些蛋白质溶于酒精,分离DNA和蛋白质。
②DNA能溶于2mol/L的NaCl溶液。
(2)DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。
2.方法步骤:
(1)研磨:取30g洋葱切碎,倒入10
mL研磨液研磨。
(2)除杂:漏斗中垫上纱布过滤后,在4
℃冰箱静置后取上清液,1
500
r/min的转速下离心后取上清液。
(3)提取:加入体积相等、体积分数95%酒精,溶液出现白色的丝状物是DNA。
方法一:用玻璃杯按一个(填“一个”或“两个”)方向搅拌,卷起丝状物,用滤纸吸去上面的水分。
方法二:10
000
r/min的转速下离心5
min,取沉淀物晾干。
(4)鉴定:
项目
A
B
2
mol/L的NaCl溶液
5
mL
丝状物或沉淀物
不加
加入
二苯胺试剂4
mL
沸水中加热5
min
现象
无色
蓝色
DNA的鉴定和还原糖的鉴定都需要加热,它们有什么不同?
提示:还原糖加斐林试剂后,置于55～65
℃热水中加热;而DNA加二苯胺试剂后,置于沸水中加热。
关键能力·素养形成
知识点一 基因工程中的工具酶
1.限制酶:
(1)限制酶的作用。
限制酶具有特殊的识别和切割功能,在基因工程中,一方面被用于切割含目的基因的DNA分子,以获取目的基因;另一方面用于切割载体。
(2)识别序列的特点:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱基,还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如以中心线为轴,两侧碱基互补对称;
以为轴,两侧碱基互补对称。
(3)限制酶切割方式:
①上下交错切割:限制酶在DNA双链的不同位置切割DNA(即在识别序列的中轴线两侧切割),产生的DNA片段的末端两条链一长一短,不是平齐的,即黏性末端,
如图:
②上下对称切割:限制酶在DNA双链的相同位置切割DNA(即沿着识别序列的中轴线切割),这样产生的末端两条链平齐,即平末端,如图:
2.DNA连接酶:
(1)作用:
将具有相同或互补黏性末端以及具有平末端的DNA片段“缝合”成新的DNA分子。
(2)连接方式:
DNA连接酶可把黏性末端和平末端之间的缝隙“缝合”起来,相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来,形成两个磷酸二酯键。DNA连接酶与碱基之间的氢键形成无关。
3.与DNA相关的五种酶的比较:
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA
(水解)酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链,形成两条长链
【特别提醒】限制酶和DNA连接酶
(1)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端,相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割,但同样能相互连接。
(2)限制酶和DNA连接酶作用部位相同,但作用正好相反,都作用于特定部位的磷酸二酯键,前者是“切割”,后者是“缝合”。
(3)DNA连接酶种类少:DNA连接酶无识别的特异性,对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。所以,限制酶种类多,DNA连接酶种类少。
如表所示为4种限制酶的识别序列及其切割位点,请回答下列问题:
(1)从表中4种酶的切割位点看,可以切出平末端的酶是____________。?
(2)限制酶切割的DNA片段的缝合依靠的是______________酶,它的作用是形成磷酸二酯键;两条链间的碱基对通过____________连接起来。?
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶____________切割。?
(4)在相关酶的作用下,图1中的甲与图2中的乙________(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由:____________________________________。?
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】(1)由表中4种限制酶的切割位点可知,SmaⅠ可切出平末端。(2)限制酶切割的DNA片段缝合时用DNA连接酶进行连接,形成磷酸二酯键;两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知,质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割,切割后形成链状DNA。(4)由图可知,甲和乙的黏性末端相同,在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
答案:(1)SmaⅠ
(2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ
(4)能 二者具有相同的黏性末端
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——模型与建模
如图是某同学画出的限制酶BamHⅠ和HindⅢ切割产生的黏性末端,判断他的写法是否正确?如果不正确,请改正。
提示:限制酶BamHⅠ切割产生的黏性末端不正确,限制酶HindⅢ切割产生的黏性末端正确。
限制酶BamHⅠ产生的黏性末端为
(2)科学思维——批判性思维
某同学认为同一限制酶切割产生相同的黏性末端,DNA连接酶可以连接相同的黏性末端,因此基因工程必须使用同一种限制酶处理后的黏性末端才能用DNA连接酶连接,这个同学的说法正确吗?说明你的理由。
提示:不对。不同的限制酶也可能产生相同的黏性末端,因此基因工程中也可使用不同的限制酶处理获得相同的黏性末端。
【素养·迁移】
下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的
( )
①AATTC- ②AATTG- ③CTA- ④-TAG
G- C- GAT- -ATC
A.1种 B.2种 C.3种 D.4种
【解析】选C。图中③④为相同的平末端,可能由同一种限制酶切割所得,所以图示四种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
【补偿训练】
在基因工程中用来修饰改造生物基因的工具是
( )
A.限制酶和DNA连接酶
B.限制酶和水解酶
C.限制酶和载体
D.DNA连接酶和载体
【解析】选A。基因工程中的操作工具有3种,即“分子手术刀”“分子缝合针”“分子运输车”。限制酶的作用是通过识别和切割从DNA分子上获取目的基因,而DNA连接酶是将目的基因连接到载体上,载体起运输工具的作用,携带着目的基因进入受体细胞。显然,对基因起修饰改造作用的是限制酶和DNA连接酶。
知识点二 基因工程中常用的载体
1.特点:质粒是一种裸露的、结构简单、具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
2.本质:质粒是独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外的小型DNA分子,不是细胞器。
3.质粒作为载体所具备的条件:
条 件
分 析
稳定并能复制
目的基因稳定存在且数量可扩大
有一个至多个限制酶切割位点
可携带多个或多种外源基因
具有特殊的标记基因
便于重组DNA的鉴定和选择
无毒害作用
避免受体细胞受到损伤
4.标记基因的筛选原理:
载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因,而未导入该基因的受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。
将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上,能够生存的是被导入了基因表达载体的受体细胞。如图所示:
【特别提醒】
细胞膜上的载体与基因工程中的载体的两个“不同”
(1)化学本质不同:
①细胞膜上的载体化学成分是蛋白质。
②基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA),也可能是生物,如噬菌体、动植物病毒等。
(2)功能不同:
①细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞。
②基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。
某细菌质粒如图所示,通过标记基因可以推知外源基因插入的位置,图示中的a、b、c是外源基因插入位置,请根据表中提供的细菌生长情况,推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点,正确的一组是
( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况
细菌在含四环素的培养基上的生长状况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A.①是c;②是b;③是a
B.①是a和b;②是a;③是b
C.①是a和b;②是b;③是a
D.①是c;②是a;③是b
【解题导引】解答本题注意两个方面:
(1)理解抗性基因:
抗四环素基因:使细菌能在含四环素的培养基上生长。
抗氨苄青霉素基因:使细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长。
(2)质粒上标记基因的作用:用于重组DNA分子的筛选。
【解析】选A。①细菌能在含氨苄青霉素和四环素的培养基上生长,说明抗氨苄青霉素基因和抗四环素基因没有被破坏,所以插入点是c;②细菌能在含氨苄青霉素的培养基上生长,而不能在含四环素的培养基上生长,说明其抗氨苄青霉素基因正常而抗四环素基因被破坏,故插入点为b;③细菌不能在含氨苄青霉素的培养基上生长,能在含四环素的培养基上生长,说明其抗氨苄青霉素基因被插入而破坏,故插入点为a。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——演绎与推理
将外源基因插入质粒中需要借助哪些工具酶?
提示:限制酶和DNA连接酶。
(2)科学探究——结果的讨论与交流
天然的质粒可以直接用作基因工程载体吗?为什么?
提示:不能,自然存在的质粒DNA分子并不完全具备作为载体条件,都要进行人工改造后才能用作基因工程载体。
【素养·迁移】
限制酶MunⅠ和限制酶EcoR
Ⅰ的识别序列及切割位点分别是和。如图表示四种
质粒和目的基因,其中,质粒上箭头所指部位为酶的识别位点,阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是
( )
【解题关键】作为载体的质粒必须与目的基因具有相同的限制酶切点,并且该切点不能破坏质粒的标记基因。
【解析】选A。用限制酶MunⅠ切割A质粒后,不会破坏标记基因,而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端,适于作为目的基因的载体。B项中质粒没有标记基因,不适于作为目的基因的载体。C、D质粒含有标记基因,但用限制酶切割后会被破坏,因此不适于作为目的基因的载体。
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.“工欲善其事,必先利其器”基因工程对体外DNA分子“切割”“拼接”并导入受体细胞中至少需要三种工具,下列有关基因工程中的三种工具的描述合理的是________。?
①DNA重组技术的原理是基因突变
②限制酶和解旋酶的作用部位相同
③作为载体,必须要有标记基因等结构
④T4DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端
⑤DNA连接酶能连接所有相同或互补的黏性末端,故该酶没有专一性
【解析】选③④。DNA重组技术的原理是基因重组,①错误;限制酶作用于磷酸二酯键,解旋酶作用于氢键,②错误;作为载体,必须能进行自我复制、具有标记基因、有一个或多个限制酶切割位点等,③正确;T4DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端,④正确;任何酶都具有专一性。酶的专一性是指一种酶只能催化一种或一类化学反应,黏性末端相连接属于一类合成反应,⑤错误。
2.下列关于基因工程工具酶的说法,正确的是
( )
A.E.coli
DNA连接酶既能够连接平末端,也可以连接黏性末端
B.每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点进行切割,体现了酶的专一性
C.DNA连接酶连接的是碱基间的氢键
D.限制酶、DNA连接酶和质粒是基因工程常用的工具酶
【解析】选B。E.coli
DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端,A项错误;每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定的位点上切割DNA分子,体现了酶的专一性,B项正确;DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,C项错误;限制酶和DNA连接酶是基因工程常用的工具酶,但质粒是载体,不是工具酶,D项错误。
3.如图表示限制酶切割某DNA的过程,从图中可知,该限制酶能识别的碱基序列及切点是
( )
A.CTTAAG,切点在C和T之间
B.CTTAAG,切点在G和A之间
C.GAATTC,切点在G和A之间
D.CTTAAC,切点在C和T之间
【解析】选C。据图分析可知,识别的序列为GAATTC,切割的位点在GA之间。
4.如图为DNA分子的某一片段,其中①②③分别表示某种酶的作用部位,则相应的酶依次是
( )
A.DNA连接酶、限制酶、解旋酶
B.限制酶、解旋酶、DNA连接酶
C.限制酶、DNA连接酶、解旋酶
D.解旋酶、限制酶、DNA连接酶
【解析】选D。①是氢键,是解旋酶的作用位点;②是磷酸二酯键,限制酶可将其断裂;③是DNA连接酶,可将DNA片段之间的磷酸二酯键连接起来。
5.作为目的基因的运输工具——质粒,必须具备的条件之一及理由是
( )
A.能够在受体细胞中稳定地保存下来并大量复制,以便提供大量的目的基因
B.具有多个限制酶切割位点,以便于目的基因的表达
C.具有某些标记基因,以便为目的基因的表达提供条件
D.能够在受体细胞中复制并稳定保存,以便于进行筛选
【解析】选A。作为载体要携带目的基因进入受体细胞并使之表达,必须能够在受体细胞内稳定地保存并大量复制,以便通过复制提供大量目的基因。同时要具有某些标记基因,是为了通过标记基因是否表达来判断目的基因是否进入了受体细胞,从而进行筛选受体细胞。载体要具有多个限制酶切割位点,则是为了便于与外源基因连接。
【思维·跃迁】
6.(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示,外源DNA插入Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因,Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后,与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合,加入DNA连接酶进行连接反应,用得到的混合物直接转化大肠杆菌,结果大肠杆菌有的未被转化,有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种,分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题:
(1)质粒载体作为基因工程的工具,应具备的基本条件有______________
____________________________(答出两点即可)。而作为基因表达载体,除满足上述基本条件外,还需具有启动子和终止子。?
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选,在上述四种大肠杆菌细胞中,未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的,其原因是____________
________________;?并且____________和________________________的细胞也是不能区分的,其原因是_____________________________________。在上述筛选的基础上,若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落,还需使用含有________________的固体培养基。?
(3)基因工程中,某些噬菌体经改造后可以作为载体,其DNA复制所需的原料来自____________。?
【解题关键】解答本题的关键有两点:
(1)理解基因工程中载体的特点。
(2)熟悉导入重组质粒的微生物的筛选方法。
【解析】本题考查基因工程的相关知识。
(1)质粒被选用为基因工程的载体是因为:具有一个或多个限制酶切割位点;具有自我复制能力;带有标记基因;对受体细胞无害。
(2)未转化的和仅含环状目的基因的细胞都不能在含有氨苄青霉素的培养基上生长,故这两种不可区分。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞在含有氨苄青霉素的培养基上都能生长,这两种也不可区分。因目的基因插入位点在四环素抗性基因上,四环素抗性基因被破坏,在获得的单个菌落中各挑取少许分别接种到含有四环素的培养基上,不能生长的为要筛选的菌落,即含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。
(3)噬菌体营寄生生活,能利用宿主细胞内的原料和场所进行自身DNA的复制和蛋白质的合成。
答案:(1)能自我复制、具有标记基因
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因,在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
【拓展·探究】
7.如图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列,并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图,请回答以下问题:
(1)关于限制酶的描述,错误的是
( )
A.EcoRⅠ识别的序列为GAATTC,在GA之间切割
B.HpaⅠ识别的序列为GTTAAC,在AT之间切割
C.EcoRⅠ切割后产生的为黏性末端,可用T4DNA连接酶连接
D.HpaⅠ切割后产生的为平末端,可用E.coli
DNA连接酶连接
(2)由图解可以看出,限制酶的作用特点是____________________
______________________________________。?
(3)如果甲中G碱基发生基因突变,EcoRⅠ还可以识别该片段吗?为什么?
【解析】
(1)EcoRⅠ识别的序列为GAATTC,切点在G、A之间,A正确;HpaⅠ识别的序列为GTTAAC,切点在A、T之间,B正确;EcoRⅠ切口在识别序列中轴线两侧,形成黏性末端,T4DNA连接酶既能连接黏性末端也可连接平末端,C正确;HpaⅠ切口在识别序列中轴线处,形成平末端,E.coli
DNA连接酶只能连接黏性末端不能连接平末端,D错误。(2)(3)限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列,并从特定位点切割DNA分子。当特定核苷酸序列变化后,就不能被相应限制酶识别。
答案:(1)D
(2)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列,并从特定的位点将DNA分子切开(或特异性)
(3)不能。因为限制酶具有特异性,每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列,并在特定位点切割。
十二 重组DNA技术的基本工具
(20分钟·70分)
一、选择题(共7小题,每小题5分,共35分)
1.下列说法中不正确的有
( )
①限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的
②DNA连接酶都是从原核生物中分离得到的
③所有限制酶识别的核苷酸序列均由6个核苷酸组成
④有的质粒是单链DNA
A.①②③
B.①②④
C.②③④
D.①③④
【解析】选C。限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的,也有少数来自真核生物——酵母菌,①正确;T4
DNA连接酶来源于T4噬菌体(一种病毒),②错误;EcoRⅠ、SmaⅠ限制酶识别的序列均为6个核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成,③错误;所有的质粒都是双链的环状DNA分子,④错误。
2.如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤,这一步骤需用到的工具酶是
( )
A.DNA连接酶和解旋酶
B.DNA聚合酶和限制性内切核酸酶
C.限制性内切核酸酶和DNA连接酶
D.DNA聚合酶和RNA聚合酶
【解析】选C。目的基因和载体结合需“分子手术刀”——限制性内切核酸酶和“分子缝合针”——DNA连接酶。此过程不涉及DNA复制,不需要DNA聚合酶和解旋酶。
3.据图分析下列有关基因工程的工具酶功能的叙述,不正确的是
( )
A.切断a处的酶为限制性内切核酸酶
B.连接a处的酶为DNA连接酶
C.切断b处的酶为解旋酶
D.切断b处的酶为限制性内切核酸酶
【解析】选D。a为磷酸二酯键,可被限制性内切核酸酶切断,A正确;a为磷酸二酯键,可被DNA连接酶连接起来,B正确;b为氢键,可被解旋酶切断,C正确;b为氢键,而限制性内切核酸酶切断的是磷酸二酯键,D错误。
4.如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化,图中依次表示限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是
( )
A.①②③④
B.①②④③
C.①④②③
D.①④③②
【解析】选C。限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂,形成黏性末端或平末端,因此①符合;DNA聚合酶用于DNA分子的复制,能在单链上将一个个脱氧核苷酸连接起来,因此④符合;DNA连接酶能在具有相同或互补碱基末端的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,因此②符合;解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开,因此③符合。
5.下列有关如图所示的黏性末端的说法,错误的是
( )
A.甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B.甲、乙具有相同的黏性末端,可形成重组DNA分子,但甲、丙之间不能
C.DNA连接酶的作用位点是b处
D.切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
【解析】选C。据图可知,切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶识别序列与切割位点分别是—GAATTC—(在G与A之间切割)、—CAATTG—(在C与A之间切割)、—CTTAAG—(在C与T之间切割),即甲、乙、
丙是由不同的限制酶切割产生的,A正确。甲、乙的黏性末端互补,所以甲、乙可以形成重组DNA分子;甲、丙的黏性末端不互补,所以甲、丙无法形成重组DNA分子,B正确。DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键,而b处是氢键,C错误。甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段为-CAATTC-GTTAAG,其中没有切割产生甲的限制酶的识别序列及酶切位点,所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段,D正确。
6.下列关于E.coli
DNA连接酶的叙述正确的是
( )
①催化具有相同黏性末端的DNA片段之间的连接
②催化具有互补黏性末端的DNA片段之间的连接
③催化具有平末端的DNA片段之间的连接
④催化单个脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成
A.①②
B.②④
C.②③
D.①④
【解析】选A。E.coli
DNA连接酶来源于大肠杆菌,可用于连接相同或互补的黏性末端,不能连接平末端。DNA连接酶不能连接单个的脱氧核苷酸,在DNA复制时,DNA聚合酶将一个一个的脱氧核苷酸聚合在一起。
7.基因工程中,需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒,便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图判断下列操作正确的是
( )
A.目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B.目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C.质粒用限制酶Ⅱ切割,目的基因用限制酶Ⅰ切割
D.质粒用限制酶Ⅰ切割,目的基因用限制酶Ⅱ切割
【解析】选D。解此题要明确目的基因要从DNA片段上切下,质粒只要切开。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—,单独使用时可以把目的基因和质粒都切断;限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—,只能把它们切开,单独使用时不能切断,所以目的基因用限制酶Ⅱ切割,质粒用限制酶Ⅰ切割;因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ,所以只能用GeneⅠ作为标记基因。
二、非选择题(共2小题,共35分)
8.(17分)根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有____________和
________________。?
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下:
AATTC……G
G……CTTAA
该酶识别的序列为________________________,切割的部位是____________
______________________。?
(3)为使切割后的载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外,还可用限制酶Y切割,原因是______________________________。?
(4)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即____________DNA连接酶和____________DNA连接酶,其中后者只能连接一种末端。?
(5)基因工程中除质粒外,________________和________________也可作为载体。?
【解析】
(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端,即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—,互补链是—CTTAAG—,切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割,也可以用另一种限制酶切割,说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同或者互补。(4)基因工程使用的DNA连接酶,按来源可分为E.coliDNA连接酶和T4
DNA连接酶,其中只能连接黏性末端的是E.coliDNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒。
答案:(1)黏性末端 平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG— G和A之间的磷酸二酯键 (3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同或互补 (4)T4 E.coli (5)噬菌体 动植物病毒
9.(18分)如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图,据图回答下列问题:
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是__________,二者还具有其他共同点,如①__________________,②________________________(写出两条即可)。?
(2)若质粒DNA分子的切割末端为
,则与之连接的目的基因切割末端应为 ______________;可使用 ________________把质粒和目的基因连接在一起。?
(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上被称为________________________,?
其作用是____________________________________________。?
(4)下列常在基因工程中用作载体的是
( )
A.苏云金芽孢杆菌抗虫基因
B.土壤农杆菌中的RNA分子
C.大肠杆菌的质粒
D.动物细胞的染色体
【解析】(1)据图可知,a是位于拟核部位的DNA分子,跟质粒的化学本质一样。作为DNA分子,二者都能自我复制,其上的基因能完成表达,即具有遗传效应等。
(2)与
具有相同或互补黏性末端的DNA片段都可与之连接,即
或写成
。DNA连接酶催化连接相同或互补的黏性末端。
(3)抗性基因常作为标记基因,供重组DNA的鉴定和筛选。
(4)大肠杆菌的质粒是基因工程中最常用的载体,载体的本质为DNA,RNA分子不能用作载体。抗虫基因属于目的基因,不属于载体。染色体的主要成分为DNA和蛋白质,不能用作载体。
答案:(1)DNA 能够自我复制 具有遗传效应
(2)CGCG—
— DNA连接酶
(3)标记基因 供重组DNA的鉴定和筛选 (4)C
(10分钟·30分)
1.(6分)如图为农杆菌Ti质粒的T-DNA区段结构示意图。农杆菌附着植物细胞后,T-DNA首先在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制,然后进入植物细胞并整合到染色体上,继而诱发细胞异常生长和分裂,形成植物肿瘤。以下有关叙述不正确的是
( )
A.Ti质粒存在于农杆菌的拟核DNA之外
B.植物肿瘤的形成与A、B两个基因的表达有关
C.清除植物肿瘤组织中的农杆菌后肿瘤不再生长
D.利用T-DNA进行转基因时需保留LB、RB序列
【解析】选C。Ti质粒是环状的DNA分子,存在于农杆菌的拟核DNA之外,A正确;A、B两个基因导入受体细胞的染色体上,进行表达,继而诱发细胞异常生长和分裂,形成植物肿瘤,B正确;农杆菌将自身Ti质粒的T-DNA整合到植物染色体上,诱发了植物肿瘤的形成,故清除肿瘤组织中的农杆菌后,肿瘤仍可继续生长,C错误;只有T-DNA保留LB、RB序列,T-DNA才能在农杆菌中从右边界到左边界被剪切、复制,然后进入植物细胞并整合到染色体上,D正确。
2.(6分)(不定项)图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点,ampr表示氨苄青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列叙述不正确的是
( )
A.图甲中的质粒用BamHⅠ切割后,含有4个游离的磷酸基团
B.在构建重组质粒时,可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C.用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割,可以保证重组DNA序列的唯一性
D.导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
【解析】选A、B、D。甲中的质粒只有一个BamHⅠ切割位点,切割后形成一个直链DNA,含2个游离的磷酸基团,A错误;BamHⅠ切割位点在目的基因上,不能用该酶切割外源DNA,B错误;用PstⅠ和HindⅢ切割质粒切成两个片段,用PstⅠ和Hind
Ⅲ能将外源DNA切开,只有含目的基因的片段通过DNA连接酶与质粒连接形成的重组质粒符合要求,从而保证重组DNA序列的唯一性,C正确;导入目的基因的大肠杆菌,其重组质粒是用PstⅠ和Hind
Ⅲ切割的,其中的ampr(氨苄青霉素抗性基因)已被破坏,D错误。
【实验·探究】
3.(18分)啤酒酵母菌是啤酒生产上常用的典型的发酵酵母菌。除用于酿造啤酒及其他的饮料酒外,还可发酵面包。菌体维生素、蛋白质含量高,可食用、药用和作饲料。科学家将大麦细胞的LTP1基因植入啤酒酵母菌中,获得的啤酒酵母菌种可产生LTP1蛋白,并酿出泡沫丰富的啤酒。基本的操作过程如图:
(1)该技术定向改变了啤酒酵母菌的性状,这在可遗传变异的来源中属于________。?
(2)为了将LTP1基因导入酵母菌细胞内,所用的载体是________。?
(3)题图中C进入的啤酒酵母菌分别在含有青霉素、四环素的两种选择培养基上的生长情况是?____________________________________________________。?
【解析】(1)由题图可知该技术属于基因工程,该变异属于基因重组。(2)据题图可以看出,载体来自大肠杆菌,一定是质粒。(3)由于质粒上抗四环素基因被破坏,所以含有C的酵母菌在含有青霉素的培养基上能存活,但在含有四环素的培养基上不能存活。
答案:(1)基因重组
(2)(大肠杆菌的)质粒
(3)在含有青霉素的培养基上能存活,但在含有四环素的培养基上不能存活
