第2节 基因工程的基本操作程序
必备知识·素养奠基
一、目的基因的筛选与获取(第一步)
1.目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物的基因。
2.筛选合适目的基因的方法:从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理:DNA半保留复制。
(2)DNA复制所需的基本条件:
参与的组分
DNA复制的作用
解旋酶(体外用高温)
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制模板
4种脱氧核苷酸
合成DNA子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
(3)过程:
填一填:基于PCR的过程,完成下列问题:
过程Ⅰ为变性,该阶段的温度为90__℃以上,目的是使双链DNA解聚为单链。?
过程Ⅱ为复性,该阶段的温度为50__℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。?
过程Ⅲ为延伸,该阶段的温度为72__℃左右,该过程需要在[D]耐高温的DNA聚合酶的催化下,利用4种脱氧核苷酸为原料,根据碱基互补配对原则从子链的3'
端延伸合成新的子链DNA。?
(4)仪器:PCR扩增仪。
(5)鉴定方法:琼脂糖凝胶电泳。
PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补?说明理由。
提示:不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3'端互补结合,而DNA的两条单链的3'端碱基序列往往不同,如果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的结合。
二、基因表达载体的构建(第二步)
1.基因表达载体作用:
(1)使基因在受体细胞中稳定存在,并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2.基因表达载体组成:
填一填:基于基因表达载体的结构模式图,完成下列问题:
(1)[A]启动子,RNA聚合酶识别和结合的部位,可以驱动基因转录出mRNA,[B]目的基因。
(2)[C]终止子,转录停止的部位。
(3)[D]复制原点,[E]标记基因。
3.构建过程:
(1)用适宜的限制酶切割载体。
(2)用同种限制酶或能产生相同黏性末端的限制酶切割目的基因。
(3)用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体上。
构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里?为什么?
提示:启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。
三、将目的基因导入受体细胞(第三步)
1.植物细胞:
(1)花粉管通道法——我国独创的方法
(2)农杆菌转化法——常用的方法
转化是指目的基因进入受体细胞内,并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2.动物细胞:
利用显微注射直接将目的基因导入受精卵中。
3.原核生物:
用Ca2+处理,使细胞处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态,将重组的基因表达载体导入其中。
四、目的基因的检测与鉴定(第四步)
1.分子水平的检测:
连一连:将检测目的和方法连线
2.个体生物学水平的检测:如饲喂法等。
关键能力·素养形成
知识点一 PCR技术
1.PCR过程:
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90
℃以上时,双链DNA解旋为单链
复性
温度下降到50
℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
72
℃左右时,耐高温的
DNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸
2.PCR扩增的计算:理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA
提供模板,则循环n
次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA
提供模板,则循环n
次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3.比较PCR扩增和体内DNA复制的异同:
项目
DNA复制
PCR技术
解旋方式
解旋酶催化
DNA在高温作用下变性解旋
场所
细胞内(主要在细胞核内)
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶
解旋酶、普通的DNA聚合酶等
耐高温的DNA聚合酶
温度条件
细胞内温和条件
需控制温度,在较高温度下进行
合成的对象
DNA分子
DNA片段或目的基因
相同点
(1)模板:均需要DNA的两条单链作为模板(2)原料:均为4种脱氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶
【特别提醒】
PCR过程的两点提醒
(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时,引物与DNA模板的结合是随机的,也存在DNA解开的两条链的结合。
(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物,比所需的DNA片段要长,从第二次循环才出现所需的DNA片段,这样的片段存在两种引物。
如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段,下列有关说法正确的是
( )
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后,片段c的数量为230
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】选C。图中片段a、b只有一种引物,是由原始DNA链为模板复制而来,其长度比片段c长,A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板,则每次循环都能产生图中片段a、b,B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物,而图中片段c有两种引物,则c最早出现在第二次循环,C项正确。经过30次循环后,得到的DNA片段总数为230,这包括图中的片段a、b,故D项不正确。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——演绎与推理
若该过程加入模板DNA片段a个,经过n次复制后,产生的DNA片段中含有模板DNA片段a的DNA个数为多少?试分析原因。
提示:2a个。因为DNA是半保留复制,一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中。
(2)科学思维——批判性思维
某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的,你认为他的说法正确吗?说明你的理由。
提示:正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键,将DNA分子双链变成单链,不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同,因此所需的温度不同。
【素养·迁移】
2020年新型冠状病毒引发的疫情在世界范围内迅速传播。各研发机构迅速进行了针对新型冠状病毒检测和治疗的研发。回答下列问题。
(1)科研机构在拿到新型冠状病毒序列后,第一时间就进行了新型冠状病毒核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法)的开发。
①这里涉及的PCR是利用________________________的原理,将目的基因加以复制。?
②PCR技术扩增目的基因的前提是要有____________________________,以便根据它合成______________________。?
③PCR扩增的过程:目的基因DNA______________后解链为单链,______________与单链相应互补序列结合,然后在______________________作用下进行延伸,如此重复循环。?
(2)接种疫苗是人类对付传染病的有力武器。疫苗作为____________________可激发人体产生相应的______________________,当与疫苗同源的病毒侵入人体后,可引发二次免疫反应。?
【解析】(1)①PCR的原理是DNA双链复制。
②PCR技术扩增目的基因需要有一段已知目的基因的核苷酸序列,利用该序列合成引物。
③PCR扩增的过程:目的基因DNA受热变性形成单链,引物与单链相应序列结合,在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下进行延伸,如此重复循环。
(2)疫苗作为抗原,激发人体产生记忆细胞和抗体,当与疫苗同源的病毒侵入人体后,可引发二次免疫反应。
答案:(1)①DNA双链复制 ②一段已知目的基因的核苷酸序列 引物 ③受热变性 引物 耐高温的DNA聚合酶
(2)抗原 记忆细胞和抗体
【补偿训练】
PCR是聚合酶链式反应的缩写,现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段,它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物
④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥DNA解旋酶 ⑦限制性内切核酸酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑧
D.①②③④⑤⑧
【解析】选D。PCR反应的实质是模拟体内DNA复制,因此需要稳定的缓冲液环境,①正确;PCR反应需要DNA模板,②正确;PCR反应需要一对引物,③正确;PCR反应需要以四种脱氧核苷酸为原料,④正确;PCR反应需要DNA聚合酶催化延伸过程,⑤正确;PCR反应过程中通过高温使DNA变性解链,不需要DNA解旋酶,⑥错误;PCR反应不需要限制性内切核酸酶,⑦错误;PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度,因此需要温控设备,⑧正确。
知识点二 目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
1.目的基因导入受体细胞的方法:
生物类型
方法
受体细胞
转化过程
特点
植物
农杆菌转化法
体细胞或受精卵
目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
适用于双子叶植物和裸子植物
花粉管通道法
在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
适用于任何开花植物
动物
显微注射法
受精卵
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物
是采用最多、最有效的方法
微生物
Ca2+处理法
原核细胞
Ca2+处理微生物细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使该细胞吸收DNA分子
原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,从而成为最常用的受体细胞
2.目的基因的检测与鉴定:
3.常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法:
转基因生物
检测方法
观察目标
抗虫植物
饲喂害虫
害虫死亡
抗病毒(菌)植物
病毒(菌)感染
未侵染上病斑
抗盐植物
盐水浇灌
正常生长
抗除草剂植物
喷洒除草剂
正常生长
【特别提醒】
不同分子水平的两个检测原理
(1)转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的,只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA,而是mRNA。
(2)翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
在基因工程中,受体细胞的不同,导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题:
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入____________细胞,具体操作时,先要将目的基因插入农杆菌____________质粒的T-DNA中,然后用该农杆菌感染植物细胞。?
(2)将重组质粒导入动物细胞,常采用____________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以,用表达载体转化大肠杆菌时,常先用____________处理大肠杆菌,以利于表达载体的进入。?
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变,属于可遗传变异中的__________(变异类型)。?
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞,具体操作时,先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,然后用该农杆菌感染植物细胞。
(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以,用表达载体转化大肠杆菌时,常先用Ca2+处理大肠杆菌,以利于表达载体的进入。(3)基因工程的原理为基因重组。
答案:(1)植物 Ti (2)显微注射 Ca2+ (3)基因重组
【素养·探究——母题追问】
(1)生命观念——结构与功能观
农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA片段?
提示:Ti质粒的T-DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。
(2)科学思维——演绎与推理
如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞,与农杆菌转化法相比有什么优点?
提示:①操作简便;②直接将目的基因导入受精卵,无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可,其他答案合理也可)
【素养·迁移】
新型冠状病毒导致全球疫情,造成很多人死亡。科学工作者经研究,发现了数种快速检验新型冠状病毒的方法,下列与新型冠状病毒研究、诊断有关的说法中错误的是
( )
A.镜检法:在光学显微镜下直接观察病人的痰液或血液,以发现病原体
B.PCR:体外基因复制技术,可在几十分钟内把病原体的基因扩展到数百万倍
C.抗原—抗体法:用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合,发现病原体
D.DNA探针技术:用放射性同位素、荧光因子等标记的DNA分子作为探针,利用DNA分子杂交原理来检测病原体
【解析】选A。病毒在光学显微镜下无法看到,只有在电子显微镜下才能观察到,A错误;PCR用于体外快速扩增特定基因或DNA序列,B正确;病原体进入人体后会刺激机体产生特异性免疫反应,产生相应抗体,由于抗体与抗原结合具有特异性,因此用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合,可发现病原体,C正确;可以利用DNA分子作为探针,通过DNA分子杂交技术检测病原体,D正确。
【补偿训练】
受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是
( )
A.棉花细胞——花粉管通道法
B.大肠杆菌——用Ca2+处理法
C.羊受精卵——农杆菌转化法
D.大豆细胞——农杆菌转化法
【解析】选C。花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法,是一种十分简便经济的方法,我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的,A正确;Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变,使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态,所以将目的基因导入微生物细胞,常采用Ca2+处理法,B正确;农杆菌转化法的受体细胞一般是双子叶植物和裸子植物,羊受精卵导入目的基因的方法是显微注射法,C错误;将目的基因导入大豆(双子叶)细胞可用农杆菌转化法,D正确。
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.基因工程的操作过程涉及许多的技术和方法,下列有关基因工程中的操作步骤和技术的描述正确的是________。?
①PCR过程使用的是耐高温的DNA聚合酶。
②基因表达载体中含有起始密码子和终止密码子。
③农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。
④只要检测出受体细胞中含有目的基因,目的基因就一定能成功表达。
⑤基因工程中将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等。
【解析】选①③⑤。PCR仪在DNA分子扩增过程使用的是耐高温的DNA聚合酶,①正确;基因表达载体中含有启动子和终止子,起始密码子和终止密码子在mRNA上,②错误;农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且能整合到受体细胞的染色体上,③正确;目的基因导入受体细胞后,除检测是否含有目的基因外,还需要检测目的基因是否表达,④错误;基因工程中将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等,⑤正确。
2.从自然界中的生物体内分离得到的天然酶,在工业生产环境中催化效率往往较低。科研人员通过如图所示的流程改造天然酶,以改进酶的功能。对这一改造过程的分析,不合理的是
( )
A.①过程产生的基因突变是随机的
B.②过程中受体菌应处理为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
C.③过程筛选突变酶依赖于抗生素
D.多次重复循环导致酶的定向进化
【解析】选C。①过程产生的基因突变是随机的,A正确;②过程中导入受体菌时,应用钙离子处理为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B正确;③过程筛选突变酶依赖于抗原-抗体杂交,C错误;多次重复循环导致酶的定向进化,使酶的活性越来越高,D正确。
3.缺乏维生素A就容易导致出现夜盲症,营养不良,甚至有一些能够威胁到生命。而β-胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。根据以上信息分析正确的是
( )
A.重组质粒中的目的基因含有psy基因和crtl基因
B.构建重组质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶
C.可通过显微注射法将目的基因导入水稻受体细胞
D.PCR既可扩增特定基因也可检测目的基因表达
【解析】选A。根据“八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶参与β-胡萝卜素的合成”可知,重组质粒中的目的基因含有psy基因和crtl基因,A正确;构建重组质粒需要限制酶、DNA连接酶,不需要核酸酶,B错误;可通过农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞,C错误;PCR可扩增特定基因,但要检测目的基因是否表达应该用抗原-抗体杂交法,D错误。
4.如图为基因表达载体的模式图,下列有关说法错误的是
( )
A.构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶
B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别
C.图中启动子位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于检测受体细胞中是否导入了目的基因
【解析】选B。构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶,A正确;用不同种类的载体构建基因表达载体时处理方法是有差别的,B错误;启动子位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,C正确;抗生素抗性基因的作用就是作为标记基因,用于检测受体细胞中是否导入了目的基因,D正确。
【思维·跃迁】
5.目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT-PCR技术。RT—PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术,具体过程如图所示,下列说法不正确的是
( )
A.引物A与引物B应该具有不同的碱基序列
B.过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
C.该反应体系中应加入缓冲液、引物、4种核糖核苷酸、逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶等物质
D.该检测方法的应用依赖于新型冠状病毒特异性序列的确定
【解析】选C。引物A与引物B分别结合在目的片段序列的两端,其碱基序列不同,A正确;过程Ⅱ为PCR的反应阶段,通过控制温度的变化实现变性、退火、延伸,实现目标序列的循环扩增,B正确;RT-PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶等物质,而不是4种核糖核苷酸,C错误;RT-PCR的前提条件是目的片段的特异性序列的确定,D正确。
6.(2019·全国卷Ⅰ改编)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______________。
?
(2)目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________。
?
【解析】(1)体内进行DNA复制时,需要解旋酶和DNA聚合酶,解旋酶可以打开双链之间的氢键,DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时,利用高温变性即加热至90
℃以上,破坏双链之间的氢键,使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
(2)由于在PCR过程中,需要不断地改变温度,该过程中涉及较高温度处理,大肠杆菌DNA聚合酶在高温处理下会变性失活,因此PCR过程中需要用耐高温的DNA聚合酶催化。
答案:(1)解旋酶 加热至90
℃以上 氢键 (2)大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【拓展·探究】
7.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力,将人的干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养可以提取干扰素用于制药。
(1)在人的DNA分子上获取干扰素基因时,要用到限制酶。假设该限制酶能专一性地识别DNA上—GAATTC—序列,并在某一位点切割某化学键,该化学键是( )
A.氢键
B.G与C之间的键
C.A与T之间的键
D.两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(2)在此基因工程操作过程中的核心步骤是__________________。启动子位于基因的__________,是______________识别和结合的部位。?
(3)人的干扰素基因为什么可以在家蚕细胞中进行表达?
【解析】(1)限制酶切割的是序列上两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。在基因表达载体上,目的基因的首端是启动子,这是一段特殊的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的位点,启动目的基因的转录。(3)因为自然界中的生物都共用同一套密码子,所以一种生物的基因可以在另一种生物体内表达。
答案:(1)D (2)基因表达载体的构建 上游 RNA聚合酶 (3)人和家蚕细胞共用一套密码子。
十三 基因工程的基本操作程序
(20分钟·70分)
一、选择题(共7小题,每小题5分,共35分)
1.下列有关基因工程相关工具的叙述,正确的是
( )
A.限制酶能识别并切割DNA任意序列
B.DNA连接酶与DNA聚合酶作用位点不同
C.没有与目的基因重组的质粒不可以进入受体细胞
D.使用质粒载体可以避免目的基因在受体内被分解
【解析】选D。限制酶只能识别DNA上特定序列并切割;DNA连接酶与DNA聚合酶作用位点都是磷酸二酯键;进入受体细胞的有普通质粒和重组质粒;质粒能够在宿主细胞内稳定存在,故将目的基因与质粒重组可以避免目的基因在受体内被分解。
2.哪些是基因表达载体的必需组成部分
( )
①启动子 ②终止密码子 ③标记基因
④目的基因 ⑤终止子
A.①②③④
B.①③④⑤
C.①②④⑤
D.①②③⑤
【解析】选B。启动子位于基因表达载体的首端,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质;终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停止下来;标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来;目的基因是表达载体上必须具有的结构。
3.某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因:A是抗链霉素基因,B是抗氨苄青霉素基因,且目的基因要插入基因B中,而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是
( )
A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B.RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶
C.可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D.在含氨苄青霉素培养基中不能生长,但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌
【解析】选D。导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒,也可能为普通质粒,A项错误;构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶,不需要RNA聚合酶,B项错误;由于目的基因要插入基因B中,即抗氨苄青霉素基因破坏,即工程菌不能抗氨苄青霉素,因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C项错误;据分析可知,在含氨苄青霉素培养基中不能生长,但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌,D项正确。
4.以下有关基因工程的叙述,正确的是
( )
A.利用PCR技术可以大量扩增目的基因
B.目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法
C.用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端
D.利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达
【解析】选A。PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术;农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法;用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端,便于两者连接;利用载体上标记基因的相关特性可检测出目的基因已导入受体细胞,但不能确定目的基因是否得以表达。
5.中美科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie-J,Hobbie-J比普通老鼠更加聪明,大脑运转更加迅速,它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie-J产生过程的描述,错误的是
( )
A.NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B.改变后的NR2B基因作为目的基因,可直接注入小鼠受精卵内
C.通常采用显微注射技术将重组质粒导入小鼠受精卵内
D.可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否插入小鼠染色体DNA
【解析】选B。PCR技术可在体外大量扩增目的基因,A正确;改变后的NR2B基因作为目的基因,需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内,B错误;将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术,C正确;通过PCR等技术从分子水平检测目的基因是否插入染色体DNA,D正确。
6.新型冠状病毒是一种RNA病毒,其基因编码的结构蛋白一共有5种,分别是S蛋白、核衣壳蛋白N、膜蛋白M、小膜蛋白E和血凝素酯酶HE。新型冠状病毒主要通过S蛋白和人类细胞表面受体ACE2蛋白结合,激活细胞内吞并启动病毒复制程序。下列说法错误的是
( )
A.通过药物引起人类ACE2蛋白基因突变,是一个好的防治思路
B.S蛋白的结构与功能很可能是疫苗研发与药物开发中必须关注的重点
C.新冠肺炎患者确诊可以通过核酸检测和抗体检测来实现,但核酸检测更可信
D.如果开发新型冠状病毒“重组病毒载体疫苗”的话,选择病毒载体时“安全性”十分重要
【解析】选A。通过药物引起人类ACE2蛋白基因突变,会影响细胞的正常代谢,A错误;新型冠状病毒主要通过S蛋白和人类细胞表面受体ACE2蛋白结合,激活细胞内吞并启动病毒复制程序,了解S蛋白的结构与功能有利于疫苗研发与药物开发,B正确;抗体检测会出现假阳性,用核酸检测更可信,C正确;开发新型冠状病毒“重组病毒载体疫苗”要考虑病毒载体的“安全性”,D正确。
【补偿训练】
目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测与鉴定的是
( )
①检测受体细胞中是否有目的基因
②检测受体细胞中是否有致病基因
③检测目的基因是否转录出了mRNA
④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A.①②③
B.②③④
C.①③④
D.①②④
【解析】选C。检测受体细胞中是否有目的基因,可以利用PCR技术,①正确;基因工程中不需要检测受体细胞中是否有致病基因,②错误;检测目的基因是否转录出了mRNA,可以利用PCR技术,③正确;检测目的基因是否翻译成蛋白质,可以利用抗原-抗体杂交技术,④正确。
7.如图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时,从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。以下说法正确的是
( )
A.图中Ⅰ是质粒,步骤①常需用到限制酶和DNA聚合酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组Ti质粒,步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ是农杆菌,通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
【解析】选C。Ⅰ为质粒,步骤①为基因表达载体的构建,常需用到限制酶和DNA连接酶,A错误;图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞,B错误;图中步骤③是将目的基因导入植物细胞,C正确;基因的表达具有独立性,剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达,D错误。
【补偿训练】
番茄叶片受害虫的损伤后,叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂,抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米,以对付猖獗的玉米螟。如图为培育转基因抗虫玉米的流程图,下列描述正确的是
( )
A.用限制性内切核酸酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B.用氯化钙处理玉米受体细胞,有利于含目的基因的重组质粒导入
C.重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位,以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D.若将目的基因导入玉米花粉细胞,通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米
【解析】选C。目的基因是用限制性内切核酸酶将DNA酶切后得到的,需筛选;氯化钙用于处理细菌细胞;基因成功表达的前提是能转录和翻译,转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动;花药离体培养得到的是玉米的单倍体,需再用秋水仙素处理单倍体,使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。
二、非选择题(共2小题,共35分)
8.(15分)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产,乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此,可将丙种蛋白质基因转入甲种农作物体内,使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。回答下列问题:
(1)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中,常需要使用____________酶和______________酶。?
(2)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养,筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗____________的危害。?
(3)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口,则该植株的种子__________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。因为__?_____
__________________________________________________________________。
【解析】(1)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中,常需使用限制酶和DNA连接酶。(2)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养,筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗乙种昆虫的危害。(3)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口,则该植株的种子不含丙种蛋白质基因,因为基因不能跨细胞转移。
答案:(1)限制 DNA连接
(2)乙种昆虫
(3)不含 基因不能在体内跨细胞转移
9.(20分)人参是一种名贵药材,具有良好的滋补作用。口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程,①～④表示相关的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
(1)步骤①中,利用PCR技术扩增干扰素基因时,设计引物序列的主要依据是______________________。科研人员还在两种引物的一端分别加上____________和____________序列,以便于后续基因的剪切和连接。?
(2)过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________,过程③中需先用__________处理根瘤农杆菌,以便将基因表达载体导入细胞。?
(3)过程④中,科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后,先通过______________过程获得DNA,再进行PCR扩增,若最终未能检测出干扰素基因,其可能原因是________________________________。?
(4)科研人员认为,由转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好,其依据是___________________________。?
【解析】(1)PCR技术的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。因此,合成引物时主要依据目的基因(干扰素基因)两端的部分核苷酸序列。同时,便于后续的剪切和连接,设计引物时还需加上相关限制酶的识别序列,本题中限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列分别是GAATTC、GGATCC。
(2)基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。用原核细胞作为受体细胞时,常用Ca2+(CaCl2)处理,使其成为感受态。
(3)从愈伤组织细胞提取RNA后,经反转录获得DNA。对PCR技术获得的较多的DNA片段进行检测筛选,未能检测出干扰素基因,说明在愈伤组织细胞中不含干扰素基因转录形成的RNA,可能是干扰素基因未能导入,也可能是导入的干扰素基因未转录。
(4)单纯干扰素只起治疗的作用,而由转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物既有干扰素的治疗作用,又有人参的滋补作用。
答案:(1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列
GAATTC GGATCC
(2)复制原点 Ca2+(CaCl2)
(3)反转录 导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录(或干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞)
(4)药物既有干扰素治疗的作用,又有人参的滋补作用
(10分钟·30分)
1.(8分)(不定项)蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。某科学家通过构建该种生物缺失chlL基因的变异株,以研究chlL基因对叶绿素合成的控制,技术路线如图所示。下列相关叙述正确的是
( )
A.①②过程应使用不同的限制性内切核酸酶
B.①②过程都要使用DNA连接酶
C.终止密码子是基因表达载体的重要组成部分
D.若操作成功,可用含红霉素的培养基筛选出该变异株
【解析】选A、B、D。限制性内切核酸酶有特异性,①②过程要切割的DNA序列不同,故应使用不同的限制性内切核酸酶;DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键,使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合;基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成,终止密码子是mRNA上密码子的一种,表示一次翻译的结束;变异株中chlL基因被重组基因替换,重组基因中有红霉素抗性基因,故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。
【补偿训练】
“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物(注:引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸),两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,如图乙所示,其中第⑤种DNA分子有
( )
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
【解析】选A。由图分析可知:X基因第一次复制得到2个两种DNA分子:①和②;X基因第二次复制得到4个四种DNA分子:①复制得①和③、②复制得②和④;X基因第三次复制得到8个五种DNA分子:①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;X基因第四次复制得到16个五种DNA分子:①复制得①和③、2个③复制得2个③和2个⑤、2个④复制得2个④和2个⑤、2个⑤复制得到4个⑤。从上面的推测可知,第四轮循环产物中有8个⑤。
【实验·探究】
2.(22分)如图1表示我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”的主要培育流程,请据图回答:
(1)杀虫基因通过①～④,最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做______________;其中________(填标号)是转基因抗虫水稻的核心步骤,需要的工具酶是______________、________________。?
(2)“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有__________________、__________________。?
(3)构建重组质粒时,常用Ti质粒作为载体,是因为Ti质粒上具有T-DNA,它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中______________________上。?
(4)图2是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(部分基因及部分限制酶作用位点),组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造,据图分析:
①人工改造质粒时,要使抗虫基因表达,还应插入____________,其作用是__________________。?
②人工改造质粒时,先用限制酶Ⅰ处理,可以去除质粒上的____________基因和____________基因(填图2质粒上的基因名称),保证重组质粒进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长;然后再用限制酶Ⅱ分别切割经过改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子,并构成重组Ti质粒,那么成功导入抗虫基因的水稻胚细胞将不能在含__________(填抗生素名称)的培养基上生长。?
【解析】(1)杀虫基因通过①～④,最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化;其中①过程表示基因表达载体的构建,这是转基因抗虫水稻的核心步骤,需要的工具酶是限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)分析图解可知,“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有基因工程技术(转基因技术)、植物组织培养技术。(3)构建重组质粒时,常用Ti质粒作为载体,是因为Ti质粒上具有T-DNA,它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中染色体的DNA上。(4)①启动子是一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。②图中看出,tms基因能够编码吲哚乙酸,tmr基因能够编码细胞分裂素,这两种激素能够促进植物的生长。因此人工改造时用限制酶Ⅰ处理,其目的之一是除去或破坏质粒上的tmr、tms,保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长;另外只有一个插入位点,也有利于目的基因(或外源DNA)准确插入。
答案:(1)转化 ① 限制性内切核酸酶(限制酶) DNA连接酶
(2)基因工程技术(转基因技术) 植物组织培养技术
(3)染色体的DNA
(4)①启动子 为RNA聚合酶提供识别和结合的部位,驱动转录 ②tms tmr 四环素
【补偿训练】
如图是将乙肝表面抗原基因转移到烟草细胞内生产乙肝疫苗的示意图,请据图回答下列问题:
(1)过程①表示________________。为了使目的基因正常表达,其首端必须有启动子,它是____________识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端,要选择____________(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)进行连接。?
(2)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞的方法称为____________
__________________________。它利用了载体Ti质粒中含有________序列,可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。?
(3)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞后,生根、长芽的过程中采用了细胞工程的__________________技术,该技术的原理是__________________。?
(4)要检测烟草细胞中乙肝表面抗原基因是否合成出乙肝表面抗原蛋白,采用的方法是________________________________________________________。?
【解析】(1)据图可知:过程①表示基因表达载体的构建,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,RNA聚合酶与其结合后可以驱动基因的转录。为了使目的基因正常表达,其首端必须有RNA聚合酶识别和结合的部位,即启动子;若限制酶切出了平末端,要选择T4DNA连接酶进行连接。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,故将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞的方法称为农杆菌转化法。它利用了载体Ti质粒中含有T-DNA序列,可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。
(3)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞后,采用了植物组织培养技术让其生根、长芽,该技术的原理是植物细胞具有全能性。
(4)检测乙肝表面抗原基因是否翻译出乙肝表面抗原蛋白,采用的方法是抗原-抗体杂交法。
答案:(1)基因表达载体的构建 RNA聚合酶 T4DNA连接酶
(2)农杆菌转化法 T-DNA
(3)植物组织培养 植物细胞具有全能性
(4)抗原-抗体杂交法
【方法规律】围绕“农杆菌转化法”的解题方法
围绕运用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞类的题目解题的技巧是“一看、二找、三不定”。
一看:一定要看清T-DNA的位置、限制酶的识别序列、运用限制酶后破坏抗性基因的情况。
二找:农杆菌转化法中一定存在两次转移、两次筛选,找到它,并分析出影响它的各种因素。
三不定:受体细胞不一定是受精卵,也可以是体细胞;导入后的目的基因不一定能成功表达;导入的方法不一定只有农杆菌转化法。(共111张PPT)
第2节 基因工程的基本操作程序
必备知识·素养奠基
一、目的基因的筛选与获取(第一步)
1.目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变_____________或获得
_____________的基因。
2.筛选合适目的基因的方法:从相关的___________________的基因中进行筛
选。
受体细胞性状
预期表达产物
已知结构和功能清晰
3.利用PCR获取和扩增目的基因
(1)原理:______________。
(2)DNA复制所需的基本条件:
参与的组分
DNA复制的作用
_______
(体外用高温)
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制_____
______________
合成DNA子链的原料
__________
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的___端开始连接脱
氧核苷酸
DNA半保留复制
解旋酶
模板
4种脱氧核苷酸
DNA聚合酶
3'
(3)过程:
填一填:基于PCR的过程,完成下列问题:
过程Ⅰ为_____,该阶段的温度为_____以上,目的是使双链DNA解聚为_____。?
过程Ⅱ为_____,该阶段的温度为_____左右,两种引物通过_____________与两条
单链DNA结合。?
过程Ⅲ为_____,该阶段的温度为_____左右,该过程需要在[D]耐高温的________
酶的催化下,利用______________为原料,根据碱基互补配对原则从子链的___
端延伸合成新的子链DNA。?
(4)仪器:__________。
(5)鉴定方法:_______________。
变性
90℃
单链
复性
50℃
碱基互补配对
延伸
72℃
DNA聚合
4种脱氧核苷酸
3'
PCR扩增仪
琼脂糖凝胶电泳
【激疑】
PCR过程中两种引物的碱基序列能否互补?说明理由。
提示:不能。因为两种引物分别与两个DNA单链的3'端互补结合,而DNA的两条单链的3'端碱基序列往往不同,如果2种引物的碱基序列互补那么会影响引物与DNA单链的结合。
二、基因表达载体的构建(第二步)
1.基因表达载体作用:
(1)使基因在_________中稳定存在,并且遗传给下一代。
(2)使目的基因能够_____和发挥作用。
受体细胞
表达
2.基因表达载体组成:
填一填:基于基因表达载体的结构模式图,完成下列问题:
(1)[A]_______,RNA聚合酶识别和结合的部位,可以驱动基因转录出mRNA,[B]
_________。
(2)[C]_______,转录停止的部位。
(3)[D]_________,[E]_________。
启动子
目的基因
终止子
复制原点
标记基因
3.构建过程:
(1)用_____的_______切割载体。
(2)用________限制酶或能产生相同_________的限制酶切割目的基因。
(3)用__________酶将目的基因片段拼接到载体上。
适宜
限制酶
同一种
黏性末端
DNA连接
【激疑】构建基因表达载体时目的基因插入的位置应该在哪里?为什么?
提示:启动子下游和终止子上游。因为只有插入在启动子和终止子之间,目的基因才可以正常表达。
三、将目的基因导入受体细胞(第三步)
1.植物细胞:
(1)___________法——我国独创的方法
(2)___________法——常用的方法
转化是指_________进入受体细胞内,并在受体细胞内维持___________的过程。
2.动物细胞:
利用_________直接将目的基因导入_______中。
3.原核生物:
用____处理,使细胞处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态,将_______
_____________导入其中。
花粉管通道
农杆菌转化
目的基因
稳定和表达
显微注射
受精卵
Ca2+
重组的
基因表达载体
四、目的基因的检测与鉴定(第四步)
1.分子水平的检测:
连一连:将检测目的和方法连线
2.个体生物学水平的检测:如饲喂法等。
关键能力·素养形成
知识点一 PCR技术
1.PCR过程:
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90
℃以上时,双链DNA解旋为单链
复性
温度下降到50
℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
过程
说明
图解
延伸
72
℃左右时,耐高温的
DNA聚合酶有最大活性,可使DNA新链由5'端向3'端延伸
2.PCR扩增的计算:理论上DNA数目呈指数扩增。
(1)若开始只有一个DNA
提供模板,则循环n
次后获得的子代DNA数目为2n个。
(2)若开始有N0个DNA
提供模板,则循环n
次后获得的子代DNA数目为N0·2n个。
3.比较PCR扩增和体内DNA复制的异同:
项目
DNA复制
PCR技术
解旋
方式
解旋酶催化
DNA在高温作用下变性解旋
场所
细胞内(主要在细胞核内)
细胞外(主要在PCR扩增仪内)
酶
解旋酶、普通的DNA聚合酶等
耐高温的DNA聚合酶
项目
DNA复制
PCR技术
温度
条件
细胞内温和条件
需控制温度,在较高温度下进行
合成的
对象
DNA分子
DNA片段或目的基因
相同点
(1)模板:均需要DNA的两条单链作为模板
(2)原料:均为4种脱氧核苷酸
(3)酶:均需DNA聚合酶
【特别提醒】
PCR过程的两点提醒
(1)复性不一定均为引物与DNA模板结合。复性时,引物与DNA模板的结合是随机的,也存在DNA解开的两条链的结合。
(2)PCR反应的结果不都是所需的DNA片段。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物,比所需的DNA片段要长,从第二次循环才出现所需的DNA片段,这样的片段存在两种引物。
【素养案例】
如图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段,下列有关说法正确的是
( )
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后,片段c的数量为230
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】选C。图中片段a、b只有一种引物,是由原始DNA链为模板复制而来,其长度比片段c长,A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板,则每次循环都能产生图中片段a、b,B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物,而图中片段c有两种引物,则c最早出现在第二次循环,C项正确。经过30次循环后,得到的DNA片段总数为230,这包括图中的片段a、b,故D项不正确。
【素养·探究——母题追问】
(1)科学思维——演绎与推理
若该过程加入模板DNA片段a个,经过n次复制后,产生的DNA片段中含有模板DNA片段a的DNA个数为多少?试分析原因。
提示:2a个。因为DNA是半保留复制,一开始的模板链最终分布在子代DNA分子中。
(2)科学思维——批判性思维
某同学认为PCR过程不同的DNA片段变性时温度是不同的,你认为他的说法正确吗?说明你的理由。
提示:正确。变性目的是通过升高温度破坏氢键,将DNA分子双链变成单链,不同片段的DNA分子中氢键的数量不同导致稳定性不同,因此所需的温度不同。
【素养·迁移】
2020年新型冠状病毒引发的疫情在世界范围内迅速传播。各研发机构迅速进行了针对新型冠状病毒检测和治疗的研发。回答下列问题。
(1)科研机构在拿到新型冠状病毒序列后,第一时间就进行了新型冠状病毒核酸检测试剂盒(双重荧光PCR法)的开发。
①这里涉及的PCR是利用________________________的原理,将目的基因加以复制。?
②PCR技术扩增目的基因的前提是要有____________________________,以便根据它合成______________________。?
③PCR扩增的过程:目的基因DNA______________后解链为单链,______________与单链相应互补序列结合,然后在______________________作用下进行延伸,如此重复循环。?
(2)接种疫苗是人类对付传染病的有力武器。疫苗作为____________________可激发人体产生相应的______________________,当与疫苗同源的病毒侵入人体后,可引发二次免疫反应。?
【解析】(1)①PCR的原理是DNA双链复制。
②PCR技术扩增目的基因需要有一段已知目的基因的核苷酸序列,利用该序列合成引物。
③PCR扩增的过程:目的基因DNA受热变性形成单链,引物与单链相应序列结合,在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下进行延伸,如此重复循环。
(2)疫苗作为抗原,激发人体产生记忆细胞和抗体,当与疫苗同源的病毒侵入人体后,可引发二次免疫反应。
答案:(1)①DNA双链复制 ②一段已知目的基因的核苷酸序列 引物 ③受热变性 引物 耐高温的DNA聚合酶
(2)抗原 记忆细胞和抗体
【补偿训练】
PCR是聚合酶链式反应的缩写,现在已成为分子生物学实验中的一种常规手段,它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物
④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥DNA解旋酶 ⑦限制性内切核酸酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥
B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑧
D.①②③④⑤⑧
【解析】选D。PCR反应的实质是模拟体内DNA复制,因此需要稳定的缓冲液环境,①正确;PCR反应需要DNA模板,②正确;PCR反应需要一对引物,③正确;PCR反应需要以四种脱氧核苷酸为原料,④正确;PCR反应需要DNA聚合酶催化延伸过程,⑤正确;PCR反应过程中通过高温使DNA变性解链,不需要DNA解旋酶,⑥错误;PCR反应不需要限制性内切核酸酶,⑦错误;PCR反应过程中需要控制的关键因素是温度,因此需要温控设备,⑧正确。
知识点二 目的基因导入受体细胞及目的基因的检测与鉴定
1.目的基因导入受体细胞的方法:
生物
类型
方法
受体细胞
转化过程
特点
植物
农杆
菌转
化法
体细胞或受精卵
目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中的染色体DNA上→目的基因表达
适用于双子叶植物和裸子植物
花粉
管通
道法
在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
适用于任何开花植物
生物
类型
方法
受体细胞
转化过程
特点
动物
显微
注射
法
受
精
卵
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的转基因动物
是采用最多、最有效的方法
微生
物
Ca2+
处理
法
原
核
细
胞
Ca2+处理微生物细胞→使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→将基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→一定温度下促使该细胞吸收DNA分子
原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,从而成为最常用的受体细胞
2.目的基因的检测与鉴定:
3.常见转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法:
转基因生物
检测方法
观察目标
抗虫植物
饲喂害虫
害虫死亡
抗病毒
(菌)植物
病毒(菌)感染
未侵染上病斑
抗盐植物
盐水浇灌
正常生长
抗除草
剂植物
喷洒除草剂
正常生长
【特别提醒】
不同分子水平的两个检测原理
(1)转录水平的检测原理与复制水平的检测原理是相似的,只是被检测的物质不再是转基因生物的基因组DNA,而是mRNA。
(2)翻译水平的检测则是利用抗原与抗体特异性结合的原理。
【素养案例】
在基因工程中,受体细胞的不同,导入目的基因的方法也不同。请回答下列问题:
(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入____________细胞,具体操作时,先要将目的基因插入农杆菌____________质粒的T-DNA中,然后用该农杆菌感染植物细胞。?
(2)将重组质粒导入动物细胞,常采用____________的方法。若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以,用表达载体转化大肠杆菌时,常先用____________处理大肠杆菌,以利于表达载体的进入。?
(3)目的基因导入受体细胞引起生物性状的改变,属于可遗传变异中的__________(变异类型)。?
【解题导引】解答本题思维流程如下:
【解析】(1)农杆菌转化法常用来将外源基因转入植物细胞,具体操作时,先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中,然后用该农杆菌感染植物细胞。
(2)将目的基因导入动物细胞最常用的方法是显微注射法。若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱。所以,用表达载体转化大肠杆菌时,常先用Ca2+处理大肠杆菌,以利于表达载体的进入。(3)基因工程的原理为基因重组。
答案:(1)植物 Ti (2)显微注射 Ca2+ (3)基因重组
【素养·探究——母题追问】
(1)生命观念——结构与功能观
农杆菌转化法为什么要将目的基因插入农杆菌质粒的T-DNA片段?
提示:Ti质粒的T-DNA片段可以整合到受体细胞的染色体上。
(2)科学思维——演绎与推理
如果改用花粉管通道法将目的基因导入受体细胞,与农杆菌转化法相比有什么优点?
提示:①操作简便;②直接将目的基因导入受精卵,无须组织培养即可获得植株。(答出一个即可,其他答案合理也可)
【素养·迁移】
新型冠状病毒导致全球疫情,造成很多人死亡。科学工作者经研究,发现了数种快速检验新型冠状病毒的方法,下列与新型冠状病毒研究、诊断有关的说法中错误的是
( )
A.镜检法:在光学显微镜下直接观察病人的痰液或血液,以发现病原体
B.PCR:体外基因复制技术,可在几十分钟内把病原体的基因扩展到数百万倍
C.抗原—抗体法:用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合,发现病原体
D.DNA探针技术:用放射性同位素、荧光因子等标记的DNA分子作为探针,利用DNA分子杂交原理来检测病原体
【解析】选A。病毒在光学显微镜下无法看到,只有在电子显微镜下才能观察到,A错误;PCR用于体外快速扩增特定基因或DNA序列,B正确;病原体进入人体后会刺激机体产生特异性免疫反应,产生相应抗体,由于抗体与抗原结合具有特异性,因此用特殊制备的病原体蛋白质与病人血清中的相关抗体特异性结合,可发现病原体,C正确;可以利用DNA分子作为探针,通过DNA分子杂交技术检测病原体,D正确。
【补偿训练】
受体细胞不同,将目的基因导入受体细胞的方法也不相同,下列受体细胞与导入方法匹配错误的一项是
( )
A.棉花细胞——花粉管通道法
B.大肠杆菌——用Ca2+处理法
C.羊受精卵——农杆菌转化法
D.大豆细胞——农杆菌转化法
【解析】选C。花粉管通道法是我国科学家独创的一种方法,是一种十分简便经济的方法,我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的,A正确;Ca2+处理法能使大肠杆菌细胞的生理状态发生改变,使之处于易于吸收周围环境中DNA分子的生理状态,所以将目的基因导入微生物细胞,常采用Ca2+处理法,B正确;农杆菌转化法的受体细胞一般是双子叶植物和裸子植物,羊受精卵导入目的基因的方法是显微注射法,C错误;将目的基因导入大豆(双子叶)细胞可用农杆菌转化法,D正确。
【课堂回眸】
课堂检测·素养达标
【概念·诊断】
1.基因工程的操作过程涉及许多的技术和方法,下列有关基因工程中的操作步骤和技术的描述正确的是________。?
①PCR过程使用的是耐高温的DNA聚合酶。
②基因表达载体中含有起始密码子和终止密码子。
③农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且与其染色体DNA整合在一起。
④只要检测出受体细胞中含有目的基因,目的基因就一定能成功表达。
⑤基因工程中将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等。
【解析】选①③⑤。PCR仪在DNA分子扩增过程使用的是耐高温的DNA聚合酶,①正确;基因表达载体中含有启动子和终止子,起始密码子和终止密码子在mRNA上,②错误;农杆菌的Ti质粒上的T-DNA可转移到植物细胞内,并且能整合到受体细胞的染色体上,③正确;目的基因导入受体细胞后,除检测是否含有目的基因外,还需要检测目的基因是否表达,④错误;基因工程中将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、花粉管通道法等,⑤正确。
2.从自然界中的生物体内分离得到的天然酶,在工业生产环境中催化效率往往较低。科研人员通过如图所示的流程改造天然酶,以改进酶的功能。对这一改造过程的分析,不合理的是
( )
A.①过程产生的基因突变是随机的
B.②过程中受体菌应处理为一种能吸收
周围环境中DNA分子的生理状态
C.③过程筛选突变酶依赖于抗生素
D.多次重复循环导致酶的定向进化
【解析】选C。①过程产生的基因突变是随机的,A正确;②过程中导入受体菌时,应用钙离子处理为一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B正确;③过程筛选突变酶依赖于抗原-抗体杂交,C错误;多次重复循环导致酶的定向进化,使酶的活性越来越高,D正确。
3.缺乏维生素A就容易导致出现夜盲症,营养不良,甚至有一些能够威胁到生命。而β-胡萝卜素可以在人体内转化成维生素A。科学家尝试通过转基因技术生产富含胡萝卜素的大米。八氢番茄红素合酶(其基因用psy表示)和胡萝卜素脱饱和酶(其基因用crtl表示)参与β-胡萝卜素的合成。根据以上信息分析正确的是
( )
A.重组质粒中的目的基因含有psy基因和crtl基因
B.构建重组质粒需要限制酶、DNA连接酶和核酸酶
C.可通过显微注射法将目的基因导入水稻受体细胞
D.PCR既可扩增特定基因也可检测目的基因表达
【解析】选A。根据“八氢番茄红素合酶和胡萝卜素脱饱和酶参与β-胡萝卜素的合成”可知,重组质粒中的目的基因含有psy基因和crtl基因,A正确;构建重组质粒需要限制酶、DNA连接酶,不需要核酸酶,B错误;可通过农杆菌转化法将目的基因导入水稻受体细胞,C错误;PCR可扩增特定基因,但要检测目的基因是否表达应该用抗原-抗体杂交法,D错误。
4.如图为基因表达载体的模式图,下列有关说法错误的是
( )
A.构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶
B.任何基因表达载体的构建都是一样的,没有差别
C.图中启动子位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位
D.抗生素抗性基因的作用是作为标记基因,用于检测受体细胞中是否导入了目的基因
【解析】选B。构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶,A正确;用不同种类的载体构建基因表达载体时处理方法是有差别的,B错误;启动子位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,C正确;抗生素抗性基因的作用就是作为标记基因,用于检测受体细胞中是否导入了目的基因,D正确。
【思维·跃迁】
5.目前广泛应用的新型冠状病毒检测方法是实时荧光RT-PCR技术。RT—PCR是将RNA逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应相结合的技术,具体过程如图所示,下列说法不正确的是
( )
A.引物A与引物B应该具有不同的碱基序列
B.过程Ⅱ通过控制温度的变化实现目标序列的循环扩增
C.该反应体系中应加入缓冲液、引物、4种核糖核苷酸、逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶等物质
D.该检测方法的应用依赖于新型冠状病毒特异性序列的确定
【解析】选C。引物A与引物B分别结合在目的片段序列的两端,其碱基序列不同,A正确;过程Ⅱ为PCR的反应阶段,通过控制温度的变化实现变性、退火、延伸,实现目标序列的循环扩增,B正确;RT-PCR反应体系中应加入缓冲液、引物、4种脱氧核苷酸、逆转录酶、耐高温的DNA聚合酶等物质,而不是4种核糖核苷酸,C错误;RT-PCR的前提条件是目的片段的特异性序列的确定,D正确。
6.(2019·全国卷Ⅰ改编)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。
(1)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是______________。在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是____________。上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的______________。
?
(2)目前在PCR反应中使用耐高温的DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是______________________。
?
【解析】(1)体内进行DNA复制时,需要解旋酶和DNA聚合酶,解旋酶可以打开双链之间的氢键,DNA聚合酶可以催化磷酸二酯键的形成。在体外进行PCR扩增时,利用高温变性即加热至90
℃以上,破坏双链之间的氢键,使DNA成为单链。解旋酶和高温处理都破坏了DNA双链中碱基对之间的氢键。
(2)由于在PCR过程中,需要不断地改变温度,该过程中涉及较高温度处理,大肠杆菌DNA聚合酶在高温处理下会变性失活,因此PCR过程中需要用耐高温的DNA聚合酶催化。
答案:(1)解旋酶 加热至90
℃以上 氢键 (2)大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
【拓展·探究】
7.家蚕细胞具有高效表达外源基因的能力,将人的干扰素基因导入家蚕细胞并大规模培养可以提取干扰素用于制药。
(1)在人的DNA分子上获取干扰素基因时,要用到限制酶。假设该限制酶能专一性地识别DNA上—GAATTC—序列,并在某一位点切割某化学键,该化学键是( )
A.氢键
B.G与C之间的键
C.A与T之间的键
D.两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(2)在此基因工程操作过程中的核心步骤是__________________。启动子位于基因的__________,是______________识别和结合的部位。?
(3)人的干扰素基因为什么可以在家蚕细胞中进行表达?
【解析】(1)限制酶切割的是序列上两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(2)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。在基因表达载体上,目的基因的首端是启动子,这是一段特殊的DNA片段,是RNA聚合酶识别和结合的位点,启动目的基因的转录。(3)因为自然界中的生物都共用同一套密码子,所以一种生物的基因可以在另一种生物体内表达。
答案:(1)D (2)基因表达载体的构建 上游 RNA聚合酶 (3)人和家蚕细胞共用一套密码子。
课时素养评价
十三 基因工程的基本操作程序
【基础达标】
(20分钟·70分)
一、选择题(共7小题,每小题5分,共35分)
1.下列有关基因工程相关工具的叙述,正确的是
( )
A.限制酶能识别并切割DNA任意序列
B.DNA连接酶与DNA聚合酶作用位点不同
C.没有与目的基因重组的质粒不可以进入受体细胞
D.使用质粒载体可以避免目的基因在受体内被分解
【解析】选D。限制酶只能识别DNA上特定序列并切割;DNA连接酶与DNA聚合酶作用位点都是磷酸二酯键;进入受体细胞的有普通质粒和重组质粒;质粒能够在宿主细胞内稳定存在,故将目的基因与质粒重组可以避免目的基因在受体内被分解。
2.哪些是基因表达载体的必需组成部分
( )
①启动子 ②终止密码子 ③标记基因
④目的基因 ⑤终止子
A.①②③④
B.①③④⑤
C.①②④⑤
D.①②③⑤
【解析】选B。启动子位于基因表达载体的首端,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质;终止子相当于一盏红色信号灯,使转录在所需要的地方停止下来;标记基因是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来;目的基因是表达载体上必须具有的结构。
3.某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因:A是抗链霉素基因,B是抗氨苄青霉素基因,且目的基因要插入基因B中,而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是
( )
A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒
B.RNA聚合酶是构建该重组质粒必需的工具酶
C.可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒
D.在含氨苄青霉素培养基中不能生长,但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌
【解析】选D。导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒,也可能为普通质粒,A项错误;构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶,不需要RNA聚合酶,B项错误;由于目的基因要插入基因B中,即抗氨苄青霉素基因破坏,即工程菌不能抗氨苄青霉素,因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C项错误;据分析可知,在含氨苄青霉素培养基中不能生长,但在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌,D项正确。
4.以下有关基因工程的叙述,正确的是
( )
A.利用PCR技术可以大量扩增目的基因
B.目的基因导入受体细胞最常用的方法是农杆菌转化法
C.用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生不同的黏性末端
D.利用载体上标记基因的相关特性就可检测出目的基因已导入受体细胞并成功表达
【解析】选A。PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术;农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法;用同一种限制酶分别切割载体和目的基因的目的是能够产生相同的黏性末端,便于两者连接;利用载体上标记基因的相关特性可检测出目的基因已导入受体细胞,但不能确定目的基因是否得以表达。
5.中美科学家通过改变一种名为NR2B的基因研制出了转基因超级小鼠Hobbie-J,Hobbie-J比普通老鼠更加聪明,大脑运转更加迅速,它能够轻松完成迷宫任务。下列关于Hobbie-J产生过程的描述,错误的是
( )
A.NR2B基因可通过PCR技术进行扩增
B.改变后的NR2B基因作为目的基因,可直接注入小鼠受精卵内
C.通常采用显微注射技术将重组质粒导入小鼠受精卵内
D.可采用PCR等技术检测改变后的NR2B基因是否插入小鼠染色体DNA
【解析】选B。PCR技术可在体外大量扩增目的基因,A正确;改变后的NR2B基因作为目的基因,需要与载体结合后才可导入小鼠受精卵内,B错误;将目的基因导入动物细胞常用显微注射技术,C正确;通过PCR等技术从分子水平检测目的基因是否插入染色体DNA,D正确。
6.新型冠状病毒是一种RNA病毒,其基因编码的结构蛋白一共有5种,分别是S蛋白、核衣壳蛋白N、膜蛋白M、小膜蛋白E和血凝素酯酶HE。新型冠状病毒主要通过S蛋白和人类细胞表面受体ACE2蛋白结合,激活细胞内吞并启动病毒复制程序。下列说法错误的是
( )
A.通过药物引起人类ACE2蛋白基因突变,是一个好的防治思路
B.S蛋白的结构与功能很可能是疫苗研发与药物开发中必须关注的重点
C.新冠肺炎患者确诊可以通过核酸检测和抗体检测来实现,但核酸检测更可信
D.如果开发新型冠状病毒“重组病毒载体疫苗”的话,选择病毒载体时“安全性”十分重要
【解析】选A。通过药物引起人类ACE2蛋白基因突变,会影响细胞的正常代谢,A错误;新型冠状病毒主要通过S蛋白和人类细胞表面受体ACE2蛋白结合,激活细胞内吞并启动病毒复制程序,了解S蛋白的结构与功能有利于疫苗研发与药物开发,B正确;抗体检测会出现假阳性,用核酸检测更可信,C正确;开发新型冠状病毒“重组病毒载体疫苗”要考虑病毒载体的“安全性”,D正确。
【补偿训练】
目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过鉴定与检测才能知道。下列属于目的基因检测与鉴定的是
( )
①检测受体细胞中是否有目的基因
②检测受体细胞中是否有致病基因
③检测目的基因是否转录出了mRNA
④检测目的基因是否翻译成蛋白质
A.①②③
B.②③④
C.①③④
D.①②④
【解析】选C。检测受体细胞中是否有目的基因,可以利用PCR技术,①正确;基因工程中不需要检测受体细胞中是否有致病基因,②错误;检测目的基因是否转录出了mRNA,可以利用PCR技术,③正确;检测目的基因是否翻译成蛋白质,可以利用抗原-抗体杂交技术,④正确。
7.如图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时,从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。以下说法正确的是
( )
A.图中Ⅰ是质粒,步骤①常需用到限制酶和DNA聚合酶
B.图中Ⅱ是含目的基因的重组Ti质粒,步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C.图中Ⅲ是农杆菌,通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
【解析】选C。Ⅰ为质粒,步骤①为基因表达载体的构建,常需用到限制酶和DNA连接酶,A错误;图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞,B错误;图中步骤③是将目的基因导入植物细胞,C正确;基因的表达具有独立性,剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达,D错误。
【补偿训练】
番茄叶片受害虫的损伤后,叶肉细胞迅速合成蛋白酶抑制剂,抑制害虫的消化作用。人们尝试将番茄的蛋白酶抑制剂基因导入玉米,以对付猖獗的玉米螟。如图为培育转基因抗虫玉米的流程图,下列描述正确的是
( )
A.用限制性内切核酸酶切割番茄的DNA得到的产物就是蛋白酶抑制剂基因
B.用氯化钙处理玉米受体细胞,有利于含目的基因的重组质粒导入
C.重组Ti质粒应有RNA聚合酶识别和结合的部位,以启动蛋白酶抑制剂基因的转录
D.若将目的基因导入玉米花粉细胞,通过花药离体培养可获得稳定遗传的转基因玉米
【解析】选C。目的基因是用限制性内切核酸酶将DNA酶切后得到的,需筛选;氯化钙用于处理细菌细胞;基因成功表达的前提是能转录和翻译,转录时需RNA聚合酶识别转录的起点才能启动;花药离体培养得到的是玉米的单倍体,需再用秋水仙素处理单倍体,使染色体加倍才能得到稳定遗传的转基因玉米。
二、非选择题(共2小题,共35分)
8.(15分)已知甲种农作物因受到乙种昆虫危害而减产,乙种昆虫食用某种原核生物分泌的丙种蛋白质后死亡。因此,可将丙种蛋白质基因转入甲种农作物体内,使甲种农作物获得抗乙种昆虫危害的能力。回答下列问题:
(1)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中,常需要使用____________酶和______________酶。?
(2)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养,筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗____________的危害。?
(3)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口,则该植株的种子__________(填“含有”或“不含”)丙种蛋白质基因。因为________
__________________________________________________________。?
【解析】(1)在利用上述丙种蛋白质基因和质粒载体构建重组质粒的过程中,常需使用限制酶和DNA连接酶。(2)将含有重组质粒的农杆菌与甲种农作物的愈伤组织共同培养,筛选出含有丙种蛋白质的愈伤组织,由该愈伤组织培养成的再生植株可抵抗乙种昆虫的危害。(3)若用含有重组质粒的农杆菌直接感染甲种农作物植株叶片伤口,则该植株的种子不含丙种蛋白质基因,因为基因不能跨细胞转移。
答案:(1)限制 DNA连接
(2)乙种昆虫
(3)不含 基因不能在体内跨细胞转移
9.(20分)人参是一种名贵药材,具有良好的滋补作用。口服α-干扰素在慢性乙肝、丙肝及部分肿瘤的治疗中有一定疗效。如图为科研人员制备能合成干扰素的人参愈伤组织细胞的流程,①～④表示相关的操作,EcoRⅠ、BamHⅠ为限制酶,它们的识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
(1)步骤①中,利用PCR技术扩增干扰素基因时,设计引物序列的主要依据是______________________。科研人员还在两种引物的一端分别加上____________和____________序列,以便于后续基因的剪切和连接。?
(2)过程②所构建的基因表达载体中未标注出的必需元件还有__________,过程③中需先用__________处理根瘤农杆菌,以便将基因表达载体导入细胞。?
(3)过程④中,科研人员提取愈伤组织细胞的RNA后,先通过______________过程获得DNA,再进行PCR扩增,若最终未能检测出干扰素基因,其可能原因是________________________________。?
(4)科研人员认为,由转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物比单纯干扰素的疗效要好,其依据是_____________________________。?
【解析】(1)PCR技术的前提条件是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。因此,合成引物时主要依据目的基因(干扰素基因)两端的部分核苷酸序列。同时,便于后续的剪切和连接,设计引物时还需加上相关限制酶的识别序列,本题中限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的识别序列分别是GAATTC、GGATCC。
(2)基因表达载体的组成有目的基因、启动子、终止子、复制原点和标记基因等。用原核细胞作为受体细胞时,常用Ca2+(CaCl2)处理,使其成为感受态。
(3)从愈伤组织细胞提取RNA后,经反转录获得DNA。对PCR技术获得的较多的DNA片段进行检测筛选,未能检测出干扰素基因,说明在愈伤组织细胞中不含干扰素基因转录形成的RNA,可能是干扰素基因未能导入,也可能是导入的干扰素基因未转录。
(4)单纯干扰素只起治疗的作用,而由转干扰素基因的人参愈伤组织加工成的药物既有干扰素的治疗作用,又有人参的滋补作用。
答案:(1)干扰素基因两端的部分核苷酸序列
GAATTC GGATCC
(2)复制原点 Ca2+(CaCl2)
(3)反转录 导入人参愈伤组织细胞的干扰素基因未能转录(或干扰素基因未能导入人参愈伤组织细胞)
(4)药物既有干扰素治疗的作用,又有人参的滋补作用
【能力提升】(10分钟·30分)
1.(8分)(不定项)蓝藻拟核DNA上有控制叶绿素合成的chlL基因。某科学家通过构建该种生物缺失chlL基因的变异株,以研究chlL基因对叶绿素合成的控制,技术路线如图所示。下列相关叙述正确的是
( )
A.①②过程应使用不同的限制性内切核酸酶
B.①②过程都要使用DNA连接酶
C.终止密码子是基因表达载体的重要组成部分
D.若操作成功,可用含红霉素的培养基筛选出该变异株
【解析】选A、B、D。限制性内切核酸酶有特异性,①②过程要切割的DNA序列不同,故应使用不同的限制性内切核酸酶;DNA连接酶的作用是连接被切开的磷酸二酯键,使chlL基因、红霉素抗性基因与质粒结合;基因表达载体由目的基因、启动子、终止子和标记基因等组成,终止密码子是mRNA上密码子的一种,表示一次翻译的结束;变异株中chlL基因被重组基因替换,重组基因中有红霉素抗性基因,故可用含红霉素的培养基筛选出该变异株。
【补偿训练】
“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段,若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”,需在PCR反应中加入两种引物(注:引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸),两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子,如图乙所示,其中第⑤种DNA分子有
( )
A.8个 B.6个 C.4个 D.2个
【解析】选A。由图分析可知:X基因第一次复制得到2个两种DNA分子:①和②;X基因第二次复制得到4个四种DNA分子:①复制得①和③、②复制得②和④;X基因第三次复制得到8个五种DNA分子:①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;X基因第四次复制得到16个五种DNA分子:①复制得①和③、2个③复制得2个③和2个⑤、2个④复制得2个④和2个⑤、2个⑤复制得到4个⑤。从上面的推测可知,第四轮循环产物中有8个⑤。
【实验·探究】
2.(22分)如图1表示我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”的主要培育流程,请据图回答:
(1)杀虫基因通过①～④,最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做______________;其中________(填标号)是转基因抗虫水稻的核心步骤,需要的工具酶是______________、________________。?
(2)“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有__________________、__________________。?
(3)构建重组质粒时,常用Ti质粒作为载体,是因为Ti质粒上具有T-DNA,它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中______________________上。?
(4)图2是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(部分基因及部分限制酶作用位点),组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造,据图分析:
①人工改造质粒时,要使抗虫基因表达,还应插入____________,其作用是__________________。?
②人工改造质粒时,先用限制酶Ⅰ处理,可以去除质粒上的____________基因和____________基因(填图2质粒上的基因名称),保证重组质粒进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长;然后再用限制酶Ⅱ分别切割经过改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子,并构成重组Ti质粒,那么成功导入抗虫基因的水稻胚细胞将不能在含__________(填抗生素名称)的培养基上生长。?
【解析】(1)杀虫基因通过①～④,最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫
做转化;其中①过程表示基因表达载体的构建,这是转基因抗虫水稻的核心步骤,
需要的工具酶是限制性内切核酸酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)分析图解可
知,“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有基因工程技术(转基因技术)、
植物组织培养技术。(3)构建重组质粒时,常用Ti质粒作为载体,是因为Ti质粒
上具有T-DNA,它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中染色体的DNA上。
(4)①启动子是一段特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别
和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需要的蛋白质。
②图中看出,tms基因能够编码吲哚乙酸,tmr基因能够编码细胞分裂素,这两种激素能够促进植物的生长。因此人工改造时用限制酶Ⅰ处理,其目的之一是除去或破坏质粒上的tmr、tms,保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长;另外只有一个插入位点,也有利于目的基因(或外源DNA)准确插入。
答案:(1)转化 ① 限制性内切核酸酶(限制酶) DNA连接酶
(2)基因工程技术(转基因技术) 植物组织培养技术
(3)染色体的DNA
(4)①启动子 为RNA聚合酶提供识别和结合的部位,驱动转录 ②tms tmr 四环素
【补偿训练】
如图是将乙肝表面抗原基因转移到烟草细胞内生产乙肝疫苗的示意图,请据图回答下列问题:
(1)过程①表示________________。为了使目的基因正常表达,其首端必须有启动子,它是____________识别和结合的部位。若限制酶切出了平末端,要选择____________(填“E.coliDNA连接酶”或“T4DNA连接酶”)进行连接。?
(2)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞的方法称为_______________。它利用了载体Ti质粒中含有________序列,可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。?
(3)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞后,生根、长芽的过程中采用了细胞工程的__________________技术,该技术的原理是__________________。?
?
(4)要检测烟草细胞中乙肝表面抗原基因是否合成出乙肝表面抗原蛋白,采用的方法是________________________________________________。
【解析】(1)据图可知:过程①表示基因表达载体的构建,启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,RNA聚合酶与其结合后可以驱动基因的转录。为了使目的基因正常表达,其首端必须有RNA聚合酶识别和结合的部位,即启动子;若限制酶切出了平末端,要选择T4DNA连接酶进行连接。
(2)将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法,故将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞的方法称为农杆菌转化法。它利用了载体Ti质粒中含有T-DNA序列,可以将目的基因整合到宿主细胞的染色体上。
(3)图中将乙肝表面抗原基因导入烟草细胞后,采用了植物组织培养技术让其生根、长芽,该技术的原理是植物细胞具有全能性。
(4)检测乙肝表面抗原基因是否翻译出乙肝表面抗原蛋白,采用的方法是抗原-抗体杂交法。
答案:(1)基因表达载体的构建 RNA聚合酶 T4DNA连接酶
(2)农杆菌转化法 T-DNA
(3)植物组织培养 植物细胞具有全能性
(4)抗原-抗体杂交法
【方法规律】围绕“农杆菌转化法”的解题方法
围绕运用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞类的题目解题的技巧是“一看、二找、三不定”。
一看:一定要看清T-DNA的位置、限制酶的识别序列、运用限制酶后破坏抗性基因的情况。
二找:农杆菌转化法中一定存在两次转移、两次筛选,找到它,并分析出影响它的各种因素。
三不定:受体细胞不一定是受精卵,也可以是体细胞;导入后的目的基因不一定能成功表达;导入的方法不一定只有农杆菌转化法。
